生物化學(xué)基因工程課件

1、生物化學(xué)基因工程第第 十十 四四 章章目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物化學(xué)基因工程基因重組：基因重組： 基因重組是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的過(guò)程，是指整段基因重組是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的過(guò)程，是指整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間甚至不同物種之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間甚至不同物種之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移或交換，并在新的位置上進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的或交換，并在新的位置上進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的現(xiàn)象。基因重組又叫現(xiàn)象?；蛑亟M又叫DNA重組重組，是自然界的常見(jiàn)現(xiàn)，是自然界的常見(jiàn)現(xiàn)象。它在物種變異、進(jìn)化、兩性繁殖、基因表達(dá)和象。它在物種變異、進(jìn)化、兩性繁殖、基因表達(dá)和調(diào)控以及基因激活等方面都具有重要作用。調(diào)控以及基因

2、激活等方面都具有重要作用?；蚬こ蹋夯蚬こ蹋?基因工程是指在試管內(nèi)應(yīng)用人工方法進(jìn)行基因基因工程是指在試管內(nèi)應(yīng)用人工方法進(jìn)行基因重組，把重組的基因?qū)爰?xì)胞或細(xì)菌內(nèi)，進(jìn)行復(fù)制、重組，把重組的基因?qū)爰?xì)胞或細(xì)菌內(nèi)，進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。利用這一技術(shù)可以擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄和翻譯。利用這一技術(shù)可以擴(kuò)增DNA，生產(chǎn)蛋，生產(chǎn)蛋白質(zhì)，或者創(chuàng)造生物新品種。該技術(shù)又稱(chēng)為白質(zhì)，或者創(chuàng)造生物新品種。該技術(shù)又稱(chēng)為重組重組DNA， DNA克隆或分子克隆?？寺』蚍肿涌寺?。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程第第 一一 節(jié)節(jié)DNA的重組的重組 DNA Recombination目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物

3、化學(xué)基因工程（三）機(jī)制：（三）機(jī)制：Holliday模型；同源重組有模型；同源重組有4個(gè)關(guān)鍵步驟個(gè)關(guān)鍵步驟 兩個(gè)同源染色體兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊。排列整齊。一個(gè)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)對(duì)應(yīng)鏈連接，形成鏈連接，形成Holliday中間體。中間體。通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA。Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體體DNA。片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 由于切開(kāi)的方式不同，得到兩種不同的

4、產(chǎn)物：由于切開(kāi)的方式不同，得到兩種不同的產(chǎn)物：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程片段重組體：片段重組體： （見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）：（見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體：拼接重組體：（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）：（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。 生物化學(xué)基因工程 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_侵?jǐn)_(recA)分支遷移分支遷移 (r

5、ecA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶

6、DNA連接酶連接酶拼接重組體拼接重組體片段重組體片段重組體目目 錄錄生物化學(xué)基因工程E.coli同源重組分子機(jī)制：同源重組分子機(jī)制： 需數(shù)十種酶參與，其中最關(guān)鍵的是：需數(shù)十種酶參與，其中最關(guān)鍵的是：RecA蛋白、蛋白、RecBCD復(fù)合物及復(fù)合物及RuvC蛋白。蛋白。 RecA RecA蛋白蛋白是由是由recrec基因編碼的，可結(jié)合單鏈基因編碼的，可結(jié)合單鏈DNADNA，形成形成RecAssDNARecAssDNA復(fù)合物。復(fù)合物。 RecARecA蛋白具有多個(gè)蛋白具有多個(gè)DNADNA結(jié)合位點(diǎn)，因此線(xiàn)性結(jié)合位點(diǎn)，因此線(xiàn)性RecAssDNARecAssDNA復(fù)合物可以通過(guò)插復(fù)合物可以通過(guò)插入同源的入

7、同源的DNADNA雙螺旋的大溝，形成三鏈雙螺旋的大溝，形成三鏈DNADNA中間物，中間物，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)逐漸取代雙螺旋并通過(guò)旋轉(zhuǎn)逐漸取代雙螺旋DNADNA中的一條鏈，與互補(bǔ)中的一條鏈，與互補(bǔ)鏈配對(duì)，將同源鏈置換出來(lái)，產(chǎn)生新的雙鏈鏈配對(duì)，將同源鏈置換出來(lái)，產(chǎn)生新的雙鏈DNADNA分子，分子，從而完成從而完成DNADNA重組。重組。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 具有三種酶活性：具有三種酶活性：依賴(lài)依賴(lài)ATPATP的核酸外切酶；的核酸外切酶；ATPATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶；增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶；需要需要ATPATP的的解旋酶活性解旋酶活性。利用利用ATPATP水解提供能量，沿著水解提供能量，沿著DNADNA鏈運(yùn)

8、動(dòng)，并以較快鏈運(yùn)動(dòng)，并以較快的速度將前方的速度將前方DNADNA解旋，當(dāng)遇到解旋，當(dāng)遇到CHICHI（因交換位點(diǎn)的（因交換位點(diǎn)的DNA DNA 結(jié)構(gòu)類(lèi)似于希臘字母結(jié)構(gòu)類(lèi)似于希臘字母 而得名）位點(diǎn)而得名）位點(diǎn)（5GCTGGTGG35GCTGGTGG3）時(shí)，可在其下游切出）時(shí)，可在其下游切出33末端末端的游離單鏈。從而使的游離單鏈。從而使DNA DNA 重組成為可能。重組成為可能。RecBCD蛋白蛋白 有內(nèi)切酶活性，可切開(kāi)同源重組的中間體有內(nèi)切酶活性，可切開(kāi)同源重組的中間體RuvC蛋白蛋白目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 首先由首先由RecBRecB、RecCRecC、RecDRecD的復(fù)合物使的復(fù)合物

9、使DNADNA產(chǎn)產(chǎn)生單鏈切口；生單鏈切口；RecARecA蛋白催化單鏈蛋白催化單鏈DNADNA對(duì)另一雙鏈對(duì)另一雙鏈DNADNA的侵入，并與其中的一條鏈交叉，交叉分支移的侵入，并與其中的一條鏈交叉，交叉分支移動(dòng)，待相交的另一鏈在動(dòng)，待相交的另一鏈在RecBCDRecBCD內(nèi)切酶催化下斷裂內(nèi)切酶催化下斷裂后，由后，由DNADNA連接酶連接缺失的遠(yuǎn)末端，形成連接酶連接缺失的遠(yuǎn)末端，形成HollidayHolliday中間體；此中間體再經(jīng)內(nèi)切酶中間體；此中間體再經(jīng)內(nèi)切酶RuvCRuvC切割、切割、DNADNA連接酶連接完成重組。連接酶連接完成重組。E.Coli的同源重組過(guò)程的同源重組過(guò)程:目目 錄錄生

10、物化學(xué)基因工程( (四四).).功能功能1.1.在減數(shù)分裂過(guò)程中，同源染色體之間進(jìn)行在減數(shù)分裂過(guò)程中，同源染色體之間進(jìn)行交換，形成生物個(gè)（群）體的多樣性。交換，形成生物個(gè)（群）體的多樣性。2.2.是是DNADNA損傷修復(fù)的重要機(jī)制之一。損傷修復(fù)的重要機(jī)制之一。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)胞與細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)胞與細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌），這種類(lèi)型的胞（細(xì)菌），這種類(lèi)型的DNA轉(zhuǎn)移稱(chēng)為接合作用轉(zhuǎn)移稱(chēng)

11、為接合作用(conjugation)。并非所有質(zhì)粒并非所有質(zhì)粒DNA都能轉(zhuǎn)移，而是只有某些較都能轉(zhuǎn)移，而是只有某些較大的質(zhì)粒（如大的質(zhì)粒（如F因子）才能通過(guò)接合作用發(fā)生轉(zhuǎn)移。因子）才能通過(guò)接合作用發(fā)生轉(zhuǎn)移。因因F因子含有細(xì)菌的性鞭毛蛋白編碼基因。能表達(dá)因子含有細(xì)菌的性鞭毛蛋白編碼基因。能表達(dá)形成細(xì)菌的表面性鞭毛。形成細(xì)菌的表面性鞭毛。 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式：接合、轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合。轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程可接合質(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 質(zhì)粒質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)

12、狀雙鏈DNA分子分子F+F-性鞭毛連接性鞭毛連接酶切單鏈酶切單鏈目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（二）轉(zhuǎn)化作用（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱(chēng)為轉(zhuǎn)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化作用化作用 (transformation)。例如：當(dāng)細(xì)菌破裂溶解（溶菌）時(shí)，其裂解例如：當(dāng)細(xì)菌破裂溶解（溶菌）時(shí)，其裂解的的DNA片斷可被另一細(xì)菌作為外源片斷可被另一細(xì)菌作為外源DNA攝取，并攝取，并重組整合進(jìn)自己的基因組，隨細(xì)菌基因一起復(fù)制、重組整合進(jìn)自己的基因組，隨細(xì)菌基因一起復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，使受體菌獲得新的遺傳

13、表型。轉(zhuǎn)錄、翻譯，使受體菌獲得新的遺傳表型。 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程例：例：溶菌時(shí)，裂解的溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。片段被另一細(xì)菌攝取。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)，當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)，再次感染另一（受體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞再次感染另一（受體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用作用(transduction)。 自然界常見(jiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是由噬菌體感染宿主自然界常見(jiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是由噬菌體感染宿主菌（細(xì)胞）時(shí)，伴隨發(fā)生菌（細(xì)胞）

14、時(shí)，伴隨發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移和基因重組。轉(zhuǎn)移和基因重組。 過(guò)程：噬菌體感染宿主菌后有兩種生活方式：過(guò)程：噬菌體感染宿主菌后有兩種生活方式：溶菌性生長(zhǎng)途徑和溶源性生長(zhǎng)途徑。溶菌性生長(zhǎng)途徑和溶源性生長(zhǎng)途徑。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 噬菌體噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，迅在宿主菌內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，迅速增殖，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，組裝成大量新的速增殖，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，組裝成大量新的噬菌體。連續(xù)增殖直到把細(xì)菌漲破，新的噬菌噬菌體。連續(xù)增殖直到把細(xì)菌漲破，新的噬菌體釋放出來(lái)，又可再感染其他細(xì)菌。體釋放出來(lái)，又可再感染其他細(xì)菌。1.溶菌性生長(zhǎng)途徑：溶菌性生長(zhǎng)途徑：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程2.溶源菌生長(zhǎng)途徑：

15、溶源菌生長(zhǎng)途徑： 是噬菌體是噬菌體DNA整合進(jìn)宿主染色體，隨宿主整合進(jìn)宿主染色體，隨宿主DNA復(fù)制而被動(dòng)復(fù)制，這種整合了噬菌體復(fù)制而被動(dòng)復(fù)制，這種整合了噬菌體DNA的細(xì)菌稱(chēng)的細(xì)菌稱(chēng)為為溶源菌溶源菌。在溶源菌生長(zhǎng)中，噬菌體與宿主菌可以共。在溶源菌生長(zhǎng)中，噬菌體與宿主菌可以共存維持無(wú)數(shù)代，直到宿主遭遇特殊事件時(shí)，使原噬菌存維持無(wú)數(shù)代，直到宿主遭遇特殊事件時(shí)，使原噬菌體體DNA從細(xì)菌染色體上被切下再進(jìn)入溶菌途徑。當(dāng)從細(xì)菌染色體上被切下再進(jìn)入溶菌途徑。當(dāng)原噬菌體原噬菌體DNA從細(xì)菌染色體被切下時(shí)，如果有部分從細(xì)菌染色體被切下時(shí)，如果有部分宿主宿主DNA被隨著切下，這種帶有宿主被隨著切下，這種帶有宿主D

16、NA的噬菌體的噬菌體稱(chēng)為稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體再次感染細(xì)菌時(shí)就可將。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體再次感染細(xì)菌時(shí)就可將前一宿主前一宿主DNA轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞，發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞，發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。生物化學(xué)基因工程噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑溶菌生長(zhǎng)途徑(lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenic pathway)例例目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 概念：概念：在整合酶催化下，在兩個(gè)在整合酶催化下，在兩個(gè)DNA序列的特異位序列的特異位點(diǎn)之間發(fā)生的整合作用稱(chēng)為位點(diǎn)特異重組點(diǎn)之間發(fā)生的整合作用稱(chēng)為位點(diǎn)特異重組(sit

17、e-specific recombination) 種類(lèi)：種類(lèi)： 噬菌體噬菌體DNA的整合的整合;細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組；細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組； 免疫球蛋白基因的重排；免疫球蛋白基因的重排；轉(zhuǎn)座重組等。轉(zhuǎn)座重組等。三、位點(diǎn)特異重組三、位點(diǎn)特異重組目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 在在噬菌體噬菌體感染的早期即有大量整合酶產(chǎn)生，故幾感染的早期即有大量整合酶產(chǎn)生，故幾乎所有被感染的細(xì)胞都發(fā)生整合作用。乎所有被感染的細(xì)胞都發(fā)生整合作用。 噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異特異靶位點(diǎn)靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；發(fā)生選擇性整合；（一）一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合 （了解）

18、（了解）目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 2. 2.特異位點(diǎn)：特異位點(diǎn)：噬菌體重組的特異位點(diǎn)稱(chēng)噬菌體重組的特異位點(diǎn)稱(chēng)attP(attachmentattP(attachment site phage) site phage)，含，含P P、O O和和PP三個(gè)序列組成三個(gè)序列組成。大腸桿菌大腸桿菌的重組位點(diǎn)的重組位點(diǎn)attBattB（ attachment site bacteriaattachment site bacteria），含），含B B、O O和和BB三個(gè)序列。三個(gè)序列。O O是是15bp15bp的的核心序列核心序列，是是attBattB和和attPattP所共同的所共同的. .而其兩側(cè)的

19、序列是而其兩側(cè)的序列是B B，BB和和P P，P,P,被被稱(chēng)為稱(chēng)為臂臂。整合酶與兩個(gè)核心序列都相結(jié)合。整合酶與兩個(gè)核心序列都相結(jié)合。P O P B O B目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 （2 2）整合宿主因子整合宿主因子（integration host factor integration host factor IHFIHF）由大腸桿菌產(chǎn)生，結(jié)合于由大腸桿菌產(chǎn)生，結(jié)合于attPattP，對(duì)整合起促進(jìn)作用。，對(duì)整合起促進(jìn)作用。（3 3）切除酶切除酶（excisionase excisionase Xis Xis ）由）由噬菌體噬菌體xisxis基基因編碼。指導(dǎo)因編碼。指導(dǎo)噬菌體噬菌體DNADNA

20、從宿主的染色體中切出來(lái)。從宿主的染色體中切出來(lái)。4.4.過(guò)程過(guò)程：噬菌體編碼整合酶。這個(gè)酶能指導(dǎo)噬菌體編碼整合酶。這個(gè)酶能指導(dǎo)噬菌體噬菌體DNADNA通過(guò)重組位點(diǎn)通過(guò)重組位點(diǎn)attPattP插入插入E.coliE.coli的重組位點(diǎn)的重組位點(diǎn)attBattB處發(fā)處發(fā)生交叉重組，將兩個(gè)較小的環(huán)狀生交叉重組，將兩個(gè)較小的環(huán)狀DNADNA分子變成一個(gè)大環(huán)。分子變成一個(gè)大環(huán)。3.3.參與的整合的酶參與的整合的酶 （1 1）整合酶）整合酶（integrase integrase IntInt）：由）：由噬菌體噬菌體intint基基因編碼，指導(dǎo)因編碼，指導(dǎo)噬菌體噬菌體DNADNA插入到宿主的染色體中。插入

21、到宿主的染色體中。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 噬菌體 P O P 包裝 感染宿主 P O P B O B Int Int IHF IHF Xis B O P P O B 圖 23-21噬菌體的整合和切離 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 鼠傷寒沙門(mén)桿菌由鞭毛蛋白決定的鼠傷寒沙門(mén)桿菌由鞭毛蛋白決定的H H抗原有兩種，分抗原有兩種，分別為別為H1H1鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H2H2鞭毛蛋白。但有少數(shù)細(xì)菌呈相反鞭毛蛋白。但有少數(shù)細(xì)菌呈相反H H抗原，這種現(xiàn)象稱(chēng)為抗原，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鞭毛相轉(zhuǎn)變鞭毛相轉(zhuǎn)變 。這種抗原相位的。這種抗原相位的改變是由一段改變是由一段995bp995bp的的DNAHDNAH片段片段, ,

22、發(fā)生倒位所致。發(fā)生倒位所致。（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組 （了解）（了解） 1.H片段的組成和功能：片段的組成和功能：兩端各有一個(gè)兩端各有一個(gè)14bp的的反向重復(fù)序列（特異重組位點(diǎn)反向重復(fù)序列（特異重組位點(diǎn)-hix）。）。中間是中間是hin基基因，編碼特異的重組酶因，編碼特異的重組酶-倒位酶，催化倒位酶，催化H片段倒位重組。片段倒位重組。 hin基因兩端各有一個(gè)啟動(dòng)子（基因兩端各有一個(gè)啟動(dòng)子（P），其中一個(gè)啟動(dòng)），其中一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)hin基因表達(dá)產(chǎn)生倒位酶，另一個(gè)啟動(dòng)子正向啟基因表達(dá)產(chǎn)生倒位酶，另一個(gè)啟動(dòng)子正向啟動(dòng)鄰近的動(dòng)鄰近的H2和和rH1基因表達(dá)，分別產(chǎn)生基因表達(dá)，分別

23、產(chǎn)生H2鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制遠(yuǎn)方阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制遠(yuǎn)方H1基因的表達(dá)?；虻谋磉_(dá)。因而結(jié)果是因而結(jié)果是H2表達(dá)而表達(dá)而H1不表達(dá)。不表達(dá)。 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 以以hixhix為為特異重組位點(diǎn)，在特異重組位點(diǎn)，在倒位酶倒位酶作用下，兩個(gè)作用下，兩個(gè)hixhix之間的之間的H片段進(jìn)行特異位點(diǎn)重組片段進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位倒位)。其結(jié)果是。其結(jié)果是H2和和rH1基因不表達(dá)，基因不表達(dá)，因?yàn)闆](méi)有了啟動(dòng)子。但遠(yuǎn)方因?yàn)闆](méi)有了啟動(dòng)子。但遠(yuǎn)方的的H1H1基因因沒(méi)有阻遏蛋白的抑制而得以表達(dá)。所以，基因因沒(méi)有阻遏蛋白的抑制而得以表達(dá)。所以，倒位重組的后果是表達(dá)倒位重組的

24、后果是表達(dá)H1H1鞭毛蛋白而不表達(dá)鞭毛蛋白而不表達(dá)H2鞭毛鞭毛蛋白。因此，蛋白。因此，沙門(mén)氏菌的位相是由于它的兩種鞭毛沙門(mén)氏菌的位相是由于它的兩種鞭毛蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)H1H1和和H2H2的交迭表達(dá)。在某一時(shí)期，菌體表達(dá)的交迭表達(dá)。在某一時(shí)期，菌體表達(dá)其中的一種，但從不表達(dá)兩種。其中的一種，但從不表達(dá)兩種。2.倒位重組及后果：倒位重組及后果：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程例例：細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組：細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 1221目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)(Ig)，由兩

25、條輕鏈，由兩條輕鏈(L(L鏈鏈) )和兩條重鏈和兩條重鏈(H(H鏈鏈) )組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈碼輕鏈( ( 和和 ) )，一個(gè)編碼重鏈。輕鏈的基因族上分別，一個(gè)編碼重鏈。輕鏈的基因族上分別有有L L、V V、J J、C C四類(lèi)基因片段。四類(lèi)基因片段。L-L-前導(dǎo)片段；前導(dǎo)片段；V-V-可變片可變片段；段；J-J-連接片段；連接片段；C-C-恒定片段。重鏈的基因族上有恒定片段。重鏈的基因族上有L L、V V、D D、J J、C C五類(lèi)基因片段，五類(lèi)基因片段， D-D-多樣性片段。多樣性片段。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段

26、：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基因的基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段片段的下游，的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在片段的兩側(cè)均存在保守的保守的重組信號(hào)序列重組信號(hào)序列(recombination signal sequence, RSS)目目 錄錄生物化學(xué)基因工程CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重組信號(hào)序列重組信號(hào)序列基因片段基因片段回文七核苷酸序列回

27、文七核苷酸序列富含富含A九核苷酸序列九核苷酸序列間隔間隔 其其九核苷酸序列提供最初的識(shí)別位點(diǎn)，七核九核苷酸序列提供最初的識(shí)別位點(diǎn)，七核苷酸序列為切割位點(diǎn)。苷酸序列為切割位點(diǎn)。催化此重排的重組酶基因催化此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。RAG1識(shí)別識(shí)別信號(hào)序列，然后信號(hào)序列，然后 RAG2加入形成復(fù)合物，共同促加入形成復(fù)合物，共同促進(jìn)重排?？贵w基因片段的連接過(guò)程進(jìn)重排?？贵w基因片段的連接過(guò)程如圖如圖。 生物化學(xué)基因工程V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHV

28、J單鏈切開(kāi)單鏈切開(kāi)RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開(kāi)單鏈切開(kāi)轉(zhuǎn)移核苷酸轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過(guò)程免疫球蛋白基因重排過(guò)程目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程四、轉(zhuǎn)座重組四、轉(zhuǎn)座重組有些基因可從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另有些基因可從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一位置，這些可移動(dòng)的一位置，這些可移動(dòng)的DNA序列包括有序列包括有插入序插入序列列和和轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子。由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱(chēng)為轉(zhuǎn)座移位或重排稱(chēng)為轉(zhuǎn)座(transposition)。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 1.插入序列插入序列(insertion sequen

29、ces, IS)組成：組成：是一大約長(zhǎng)是一大約長(zhǎng)7501500bp的的DNA片斷。其中包括：片斷。其中包括： 二個(gè)分離的反向重復(fù)二個(gè)分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列；序列； 兩翼有特有的正向重復(fù)序列；兩翼有特有的正向重復(fù)序列；一個(gè)轉(zhuǎn)座酶一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因，能表達(dá)轉(zhuǎn)座酶引起轉(zhuǎn)座。編碼基因，能表達(dá)轉(zhuǎn)座酶引起轉(zhuǎn)座。 IRTransposase GeneIR 2. 轉(zhuǎn)座形式：轉(zhuǎn)座形式：保守性轉(zhuǎn)座：是指插入序列從原位遷移到新位。保守性轉(zhuǎn)座：是指插入序列從原位遷移到新位。復(fù)制性轉(zhuǎn)座：是指插入序列復(fù)制后，其中一個(gè)復(fù)復(fù)制性轉(zhuǎn)座：是指插入序列復(fù)制后，其中一

30、個(gè)復(fù)制品遷移到新位，另一個(gè)原位不動(dòng)。制品遷移到新位，另一個(gè)原位不動(dòng)。（一）插入序列轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座生物化學(xué)基因工程插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 1.轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 概念：概念：可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn) 移到另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列。移到另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列。 2.轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成：兩個(gè)兩個(gè)反向重復(fù)序列；反向重復(fù)序列； 轉(zhuǎn)座酶編碼基因，其產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座酶編碼基因，其產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座。 抗生素抗性基因等有用的基因?？股乜剐曰虻扔杏玫幕?。IRIRTransposase Gene有用基有用基因

31、因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子插入新的靶位點(diǎn)的過(guò)程包括：在靶位點(diǎn)交轉(zhuǎn)座子插入新的靶位點(diǎn)的過(guò)程包括：在靶位點(diǎn)交錯(cuò)切割錯(cuò)切割DNADNA，將轉(zhuǎn)座子同靶位點(diǎn)的突出末端連接起來(lái)，將轉(zhuǎn)座子同靶位點(diǎn)的突出末端連接起來(lái)，以及補(bǔ)齊缺口、致使靶位點(diǎn)出現(xiàn)正向重復(fù)序列。以及補(bǔ)齊缺口、致使靶位點(diǎn)出現(xiàn)正向重復(fù)序列。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程生物化學(xué)基因工程由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物化學(xué)基因工程第第 二二 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)DNA Recombination Technique 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物化學(xué)基因工程重組重組D

32、NA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)的豌豆雜交試驗(yàn)1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)第一個(gè)重組重組DNA分子分子1977年年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遺傳工遺傳工程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年年 開(kāi)始建造開(kāi)始建造第一家第一家應(yīng)用重組應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠(chǎng)技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠(chǎng)1997年年 英國(guó)羅斯林研究所成功的克

33、隆了英國(guó)羅斯林研究所成功的克隆了“多莉多莉”羊。羊。 所有這些工作的基礎(chǔ)都是所有這些工作的基礎(chǔ)都是重組重組DNA技術(shù)技術(shù)。重組。重組DNA技術(shù)就是技術(shù)就是基因工程基因工程，是對(duì)基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，是對(duì)基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造的分子工程，包括的分子工程，包括基因重組、基因克隆和克隆基因基因重組、基因克隆和克隆基因的表達(dá)的表達(dá)。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程1.克隆克隆(clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。2.克隆化克隆化(cloning)獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化 (cloning)，即無(wú)性繁殖。，即無(wú)性繁殖。3.克隆技術(shù)水平：

34、克隆技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 。在分子水平上進(jìn)行。在分子水平上進(jìn)行。細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆。在細(xì)胞水平上進(jìn)行。在細(xì)胞水平上進(jìn)行。個(gè)體克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）（動(dòng)物或植物）（一）（一） DNA克隆克隆目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的人工的DNA）與載體）與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化

35、，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再?gòu)闹泻Y選出含有目的基因的轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再?gòu)闹泻Y選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，然后進(jìn)行擴(kuò)增、提取，獲得大量同一化子細(xì)胞，然后進(jìn)行擴(kuò)增、提取，獲得大量同一DNA分子，即為分子，即為DNA克隆克隆。也稱(chēng)。也稱(chēng)基因克隆或重組基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 4.DNA克隆克隆目目 錄錄生物化學(xué)基因工程基因工程的基本程序基因工程的基本程序基因工程的基本程序是基因工程的基本程序是：（1 1）獲取目的基因（外源）獲取目的基因（外源DNADNA片段）（片段）（2 2）將目的基因連接到載體上，得雜化載）將目的基因連接到載體上，得雜化載體；（體；（3

36、 3）將雜化載體（）將雜化載體（DNADNA重組體）引入宿主細(xì)胞重組體）引入宿主細(xì)胞（受體細(xì)胞），使目的基因及載體上其它基因得以轉(zhuǎn)（受體細(xì)胞），使目的基因及載體上其它基因得以轉(zhuǎn)錄和翻譯。錄和翻譯。載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主細(xì)胞主細(xì)胞選出含有重選出含有重組組DNADNA的細(xì)的細(xì)胞并擴(kuò)增胞并擴(kuò)增abbAAb目目 錄錄生物化學(xué)基因工程生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等。酶工程、細(xì)胞工程等?；蚬こ袒蚬こ棠康模耗康模?分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA

37、獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） 基因工程基因工程(genetic engineering) 實(shí)實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，又稱(chēng)又稱(chēng)重組重組DNA工藝學(xué)工藝學(xué)。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶n T4DNA連接酶連接酶n 堿性磷酸酶堿性磷酸酶n 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶 在重組在重組DNA操作過(guò)程中，首先必備的工具就操作過(guò)程中，首先必備的工具就是各種工具酶。例如：是各種工具酶。

38、例如：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具

39、有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無(wú)外切活性，而無(wú)53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 錄錄生物化學(xué)基因工程Hamilt

40、on O. SmithHamilton O. Smith美國(guó)人美國(guó)人 Daniel Nathans Daniel Nathans 美國(guó)人美國(guó)人 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)及其在分子遺傳學(xué)方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 ,1978,1978年共獲諾貝爾獎(jiǎng)。年共獲諾貝爾獎(jiǎng)。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶1.定義定義限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是能識(shí)別是能識(shí)別DNA的特異序列的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。的一類(lèi)內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATC

41、C GBam H目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 3.作用：作用：在細(xì)菌體內(nèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制在細(xì)菌體內(nèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身保護(hù)自身DNA。對(duì)。對(duì)細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳具有重要意義。細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳具有重要意義。 2.分類(lèi)：分類(lèi)： 限制性核酸內(nèi)切酶已發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶已發(fā)現(xiàn)1800種之多。根據(jù)種之多。根據(jù)酶的組成，所需因子及裂解酶的組成，所需因子及裂解DNA方式不同，可分方式不同，可分為三類(lèi)：為三類(lèi)：、型。（基因工程技術(shù)中常用型。（基因工程技術(shù)中常用型）型）目目 錄錄生物化學(xué)基因工程第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大

42、寫(xiě)；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示該酶發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示該酶發(fā)現(xiàn)的先后次序。4.酶的命名：酶的命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶通常用三個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示。通常用三個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 5. 5.類(lèi)酶識(shí)別類(lèi)酶識(shí)別DNADNA序列特點(diǎn)序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 6. 6.平頭或鈍性末端、粘性末端：平頭或鈍性末

43、端、粘性末端： 平頭或鈍性末端：平頭或鈍性末端：有些限制性核酸內(nèi)切酶可在同有些限制性核酸內(nèi)切酶可在同一水平上切斷一水平上切斷DNADNA雙鏈，即形成平頭或鈍性末端。雙鏈，即形成平頭或鈍性末端。HindGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG目目 錄錄生物化學(xué)基因工程GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 粘性末端：粘性末端：有些酶在切割有些酶在切割DNA雙鏈時(shí)，在雙鏈時(shí)，在兩條鏈切口錯(cuò)開(kāi)數(shù)個(gè)核苷酸，從而形成突出的兩條鏈切口錯(cuò)開(kāi)數(shù)個(gè)核苷酸，從而形成突出的3粘性末端或粘性末端或5粘性末端。粘性末端。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 作用模式圖作用模式圖產(chǎn)生產(chǎn)生33突出突出粘

44、性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*553355335 53 33355OHP P*C T G C A*G55333 355OHP PA C G T C* * * * * * * * * * * *G* * * * * * * * * * * *目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 作用模式圖作用模式圖產(chǎn)生平末端產(chǎn)生平末端( (blunt end) )Alu I*AGCT*TCGA*553 3553355333355OHP*AG*TC55333355 OHPCT*GA*目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 不同的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別不同的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別DNADNA中的核苷酸序列長(zhǎng)中的核苷酸序列長(zhǎng)短

45、不一，分別為短不一，分別為4 4、6 6或或8 8個(gè)核苷酸序列。如果個(gè)核苷酸序列。如果DNADNA序序列是隨機(jī)的：列是隨機(jī)的：特異特異4 4核苷酸序列核苷酸序列約約256bp256bp出現(xiàn)一次；出現(xiàn)一次；特異特異6 6核苷酸核苷酸約約4kp4kp出現(xiàn)一次；出現(xiàn)一次；特異特異8 8核苷酸核苷酸約約65kp65kp出現(xiàn)一次。出現(xiàn)一次。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程同功異源酶同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱(chēng)同一位點(diǎn)，這些酶稱(chēng)同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGA

46、TCC GBst目目 錄錄生物化學(xué)基因工程同尾酶同尾酶有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割但切割DNA后，能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類(lèi)酶后，能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類(lèi)酶稱(chēng)為稱(chēng)為同尾酶同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱(chēng)為配伍未這兩個(gè)相同的粘性末端稱(chēng)為配伍未端端(compatible end) ，配伍未端可進(jìn)行相互連接。，配伍未端可進(jìn)行相互連接。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A目目 錄錄生物化學(xué)基因工程2.DNA2.DNA連接酶連接酶(DNA ligase)(DNA liga

47、se) 基因工程的縫紉針基因工程的縫紉針 催化兩條雙鏈催化兩條雙鏈DNADNA分子的互補(bǔ)粘性末端或平末分子的互補(bǔ)粘性末端或平末端的端的55磷酸基團(tuán)與磷酸基團(tuán)與33羥基形成磷酸酯鍵。羥基形成磷酸酯鍵。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA連接酶連接酶作用模式圖作用模式圖連接粘性末端粘性末端目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 連接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA連接酶連接酶目目 錄錄生物化學(xué)基因

48、工程（三）目的基因（三）目的基因 1. 1.定義：定義：應(yīng)用應(yīng)用DNADNA重組技術(shù)有目的地分離、獲得某重組技術(shù)有目的地分離、獲得某一感興趣的基因或一感興趣的基因或DNADNA序列，或某一感興趣的蛋白質(zhì)的序列，或某一感興趣的蛋白質(zhì)的基因基因, ,這些感興趣的這些感興趣的DNADNA序列或基因就稱(chēng)為目的基因或序列或基因就稱(chēng)為目的基因或目的目的DNADNA，又稱(chēng)外源基因。，又稱(chēng)外源基因。 2. 2.類(lèi)型：有二種：類(lèi)型：有二種： （1 1）cDNA cDNA (complementary DNA)(complementary DNA)是以是以mRNAmRNA或病毒或病毒RNARNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合

49、成的與為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與RNARNA互補(bǔ)的單鏈互補(bǔ)的單鏈cDNA cDNA 。以單鏈以單鏈cDNAcDNA為模板經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈為模板經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNAcDNA。 （2 2）基因組基因組DNADNA (genomic DNA) (genomic DNA)是代表一個(gè)細(xì)胞或是代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有生物體整套遺傳信息的所有DNADNA序列。序列。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（四）基因載體（四）基因載體 （除紅字外為了解）（除紅字外為了解） 1.定義定義:為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些義的蛋白質(zhì)所

50、采用的一些DNA分子。分子。 克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為的載體稱(chēng)為克隆載體克隆載體。 表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、翻譯成多序列可轉(zhuǎn)錄、翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為表達(dá)載體表達(dá)載體。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程2.載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；選和鑒定；分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源D

51、NADNA。（5 5）具有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；）具有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；（6 6）生物安全性好。）生物安全性好。 3.常用載體常用載體 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA、噬菌體、噬菌體DNA、病毒、病毒DNA目目 錄錄生物化學(xué)基因工程1. 1.質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)存在于細(xì)菌染色體以外的小型環(huán)狀雙鏈存在于細(xì)菌染色體以外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子分子目目 錄錄生物化學(xué)基因工程質(zhì)粒的特點(diǎn)：質(zhì)粒的特點(diǎn)：有限制性?xún)?nèi)切酶切口，有限制性?xún)?nèi)切酶切口，便于插入外源性便于插入外源性DNA。 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息，帶有某些遺傳信息， 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些

52、遺會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。例如，質(zhì)粒含有抗藥性基因，使細(xì)菌傳性狀。例如，質(zhì)粒含有抗藥性基因，使細(xì)菌對(duì)青霉素、四環(huán)素或重金屬產(chǎn)生抗性，有利于對(duì)青霉素、四環(huán)素或重金屬產(chǎn)生抗性，有利于基因工程中篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌；基因工程中篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌；目目 錄錄生物化學(xué)基因工程(2). (2). 有三種構(gòu)型：有三種構(gòu)型：超螺旋型超螺旋型（SCSC）、）、開(kāi)環(huán)型開(kāi)環(huán)型(OC)(OC)及及線(xiàn)型線(xiàn)型(LC),(LC),在一般實(shí)驗(yàn)條件下三種在一般實(shí)驗(yàn)條件下三種構(gòu)型的構(gòu)型的DNADNA分子電泳時(shí)，一般分子電泳時(shí)，一般SCSC最快，最快，LCLC次之，次之，OCOC最慢。最慢。- +OCLC SC目目 錄錄生物化學(xué)基因工程

53、 pBR322 pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體。是由天質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體。是由天然質(zhì)粒然質(zhì)粒pSC101pSC101、CoLE1pCoLE1p和和SF2124SF2124構(gòu)建而成。構(gòu)建而成。1、pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒特點(diǎn)：特點(diǎn)： 其分子量比較小，為其分子量比較小，為4363bp； 含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)(Ori)及與復(fù)制調(diào)節(jié)有關(guān)及與復(fù)制調(diào)節(jié)有關(guān)的序列，故能自我復(fù)制；的序列，故能自我復(fù)制；目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 含有抗氨芐青霉素含有抗氨芐青霉素(ampr)和抗四環(huán)素基因和抗四環(huán)素基因(tetr)，分別編碼抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素的酶，分別編碼抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素的酶，

54、使細(xì)菌產(chǎn)生抗性。便于重組轉(zhuǎn)化菌的篩選。在使細(xì)菌產(chǎn)生抗性。便于重組轉(zhuǎn)化菌的篩選。在ampr和和tetr上各有一些限制酶切位點(diǎn)，這些酶切上各有一些限制酶切位點(diǎn)，這些酶切位點(diǎn)提供了外源位點(diǎn)提供了外源DNA插入質(zhì)粒的缺口。當(dāng)外源插入質(zhì)粒的缺口。當(dāng)外源DNA插入這些位點(diǎn)時(shí)，插入這些位點(diǎn)時(shí)，ampr和和tetr基因失活，使基因失活，使細(xì)菌失去抗生素抗性，可用于重組轉(zhuǎn)化菌的篩選。細(xì)菌失去抗生素抗性，可用于重組轉(zhuǎn)化菌的篩選。 有多種單一酶切位點(diǎn)?？稍诿盖形稽c(diǎn)處插有多種單一酶切位點(diǎn)?？稍诿盖形稽c(diǎn)處插入外源入外源DNA。生物化學(xué)基因工程目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 噬菌體噬菌體DNA改造成的載體系統(tǒng)改造成

55、的載體系統(tǒng): gt系列系列（插入型，適用（插入型，適用cDNA克?。┛寺。?EMBL系列系列（置換型，適用基因組（置換型，適用基因組DNA克隆）克?。?2. 噬菌體噬菌體(phage) 一種侵襲細(xì)菌的病毒。一種侵襲細(xì)菌的病毒。 常用作克隆載體的噬菌體常用作克隆載體的噬菌體DNA有有噬菌體噬菌體和和M13噬菌體。噬菌體。 M13噬菌體噬菌體DNA改造的載體系統(tǒng)改造的載體系統(tǒng):（含（含lacZ基因）基因） M13mp系列和系列和pUC系列系列。它們是在。它們是在M13基因間隔區(qū)插基因間隔區(qū)插入了大腸桿菌的一段入了大腸桿菌的一段調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因及及l(fā)acZ基因基因的的N端端146個(gè)個(gè)aa殘基編碼基因

56、，其產(chǎn)物是殘基編碼基因，其產(chǎn)物是半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段片段。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 含有含有pBR322pBR322的的復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)、抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因和和大腸桿菌乳糖操縱子大腸桿菌乳糖操縱子lacZlacZ的一段基因的一段基因，能編碼，能編碼半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段。 突變型突變型lac-E.colilac-E.coli因編碼因編碼半乳糖苷酶半乳糖苷酶肽段的肽段的基因缺陷，只能表達(dá)該酶的基因缺陷，只能表達(dá)該酶的片斷片斷（酶的（酶的C C端）。端）。 及及片斷單獨(dú)存在均無(wú)片斷單獨(dú)存在均無(wú)半乳糖苷酶活性，必半乳糖苷酶活性，必須是在宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)

57、兩個(gè)片段時(shí)，須是在宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，半乳糖苷酶才有活性。從而使特異性化合物變?yōu)榘肴樘擒彰覆庞谢钚?。從而使特異性化合物變?yōu)樗{(lán)色藍(lán)色化合物。此稱(chēng)為化合物。此稱(chēng)為互補(bǔ)互補(bǔ)。M13 噬菌體噬菌體pUC：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 當(dāng)當(dāng)在在lacZ基因內(nèi)插入外源基因時(shí)基因內(nèi)插入外源基因時(shí)，lacZ基因不基因不能表達(dá)能表達(dá)片段，轉(zhuǎn)染片段，轉(zhuǎn)染lac-E.coli后，在含有底物后，在含有底物X-gal的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)出現(xiàn)的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)出現(xiàn)白色菌落白色菌落。當(dāng)。當(dāng)在在lacZ基因基因內(nèi)無(wú)外源內(nèi)無(wú)外源DNA插入時(shí)插入時(shí)， lacZ基因基因能表達(dá)能表達(dá)片段，片段， lac-E.coli 能表達(dá)能

58、表達(dá)肽，肽，基因互補(bǔ)基因互補(bǔ)形成有活性的形成有活性的半半乳糖苷酶，因此在含有底物乳糖苷酶，因此在含有底物X-gal的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈藍(lán)色菌落呈藍(lán)色。這種。這種lacZ基因內(nèi)基因內(nèi)-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的插入滅活（即插入滅活（即肽段不再互補(bǔ)）是常用的篩選重組肽段不再互補(bǔ)）是常用的篩選重組體的方法。稱(chēng)為體的方法。稱(chēng)為互補(bǔ)篩選法，互補(bǔ)篩選法，也稱(chēng)為也稱(chēng)為藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選。 目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選目目 錄錄生物化學(xué)基因工程目目 錄錄生物化學(xué)基因工程 3. 3.柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體( (也叫粘性也叫粘性cosmid)cosmid) 是兼有質(zhì)粒和

59、噬菌體雙重特點(diǎn)的大容量載體，是兼有質(zhì)粒和噬菌體雙重特點(diǎn)的大容量載體，能插入能插入DNA片斷片斷3045kb左右。左右。目目 錄錄生物化學(xué)基因工程酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體載體細(xì)菌人工染色體載體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他載體：其他載體：目目 錄錄生物化學(xué)基因工程二、重組二、重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理基本原理基本原理目的基

60、因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 生物化學(xué)基因工程 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過(guò)過(guò) 程程目目 錄錄目目 錄錄生物化學(xué)基因工程（一）目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻墨@取 根據(jù)已知氨基酸順序推導(dǎo)出基因的核苷酸序根據(jù)已知氨基酸順序推導(dǎo)出基因的核苷酸序列，然后可用列，然后可用DNA合成儀人工合成目的基因。合成儀人工合成目的基因。先先合成小片段，再將小片段依次連接成一個(gè)完整基合成小片段，再將小片段依次連接成一個(gè)完整基因鏈。人工