DNA技術與人類基因組

1、高中生物奧林匹克競賽輔導專題講座 專題九 DNA 技術與人類 基因組競賽要求】1DNA操作的工具2質粒是基因的載體3內切酶與連接酶4基因克隆5反轉錄6DNA探針7PCR技術8人類基因組9DNA技術的應用10DNA技術帶來的危害與倫理問題知識梳理】一、基因工程概述基因工程：是在分子生物學和分子遺傳學綜合發(fā)展基礎上于本世紀 70 年代誕生的一 門嶄新的生物技術科學。 一般來說， 基因工程是指在基因水平上的遺傳工程， 它是用人為方 法將所需要的某一供體生物的遺傳物質-DNA 大分子提取出來， 在離體條件下用適當的工具酶進行切割后， 把它與作為載體的 DNA 分子連接起來， 然后與載體一起導入某一更易

2、生長、 繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質在其中 安家落戶 ，進行正常復制和表達，從而獲得 新物種的一種嶄新的育種技術。這個定義表明，基因工程具有以下幾個重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生 物中進行繁殖， 能夠跨越天然物種屏障， 把來自任何一種生物的基因放置到新的生物中， 而 這種生物可以與原來生物毫無親緣關系， 這種能力是基因工程的第一個重要特征。 第二個特 征是，一種確定的 DNA 小片段在新的寄主細胞中進行擴增，這樣實現(xiàn)很少量DNA 樣品 拷貝”出大量的DNA,而且是大量沒有污染任何其它 DNA序列的、絕對純凈的 DNA分子群體。二、細胞是 DNA 操作必不可少的工具（一）質粒是

3、基因的載體基因載體或稱克隆載體。這是為殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些攜帶”感興趣的外源 DNA 、實現(xiàn)外源DNA 的無性繁DNA 分子。其中，為使插入的外源 DNA 序列可轉DNA 分子有質錄、進而翻譯成多肽鏈而設計的克隆載體又稱表達載體?？沙洚斂寺≥d體的 粒DNA、噬菌體 DNA 和病毒 DNA。細菌質粒是獨立于細菌擬核中 DNA 分子的自主復制的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，是基因工 程最常用的運載體。最常用的質粒是大腸桿菌的質粒。大腸桿菌的質粒中常含有抗藥基因， 如抗四環(huán)素的標記基因。細菌質粒的大小只有普通細菌擬核DNA的百分之一左右。質粒能夠“友好”地“借居”在宿主細胞中。一般來說，質粒

4、的存在與否對宿主細胞生存沒有決定 性的作用。 但是， 質粒的復制則只能在宿主細胞內完成。 土壤農桿菌的質粒常用于培育轉基 因植物。(二) 工具酶1. 限制性內切酶：識別特異序列，切割DNA2. DNA連接酶：催化 DNA中相鄰的5磷酸基與3羥基間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合，連接DNA片段3. DNA聚合酶I:(1 )合成雙鏈cDNA中第二條鏈(2) 缺口平移制做探針(3) DNA序列分析(4) 填補3末端4. Taq酶：催化PCR反應，聚合 DNA5 .反轉錄酶：a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶I進行填補，標記或 DNA序列分析6 多聚核苷酸激酶： 催化DNA 5羥基末端磷酸化，或

5、標記探針7 .堿性磷酸酶： 切除DNA5末端磷酸基&末端轉移酶：在3羥基末端進行同系多聚核苷酸加尾9. DNA酶： 切割 DNA10. RNA酶: 切害9 RNA在所有工具酶中，限制性核酸內切酶具有特別重要的意義。所謂限制性核酸內切酶就是識別DNA的特異序列，并在識別點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。根據酶的組成，所需因子及裂解 DNA方式的不同，可將限制性核酸內切酶分為三類。重組DNA技術中常用的限制性核酸內切酶為H類酶，大部分H類酶識別 DNA位點的核苷酸序列呈二元旋轉對稱，通常稱這種特殊的結構順序為回文結構。F面小結限制性內切酶類I1需Mg 2+、SAM 及ATP J識別位點復雜，特

6、異性差，切割位點距識別點遠。類nI僅需Mg 2+識別切割特異性強，切割發(fā)生在識別位點。1|需 Mg 2+及 ATP切割位點在識別位點周圍，酶活性不單一。(三)基因克隆1.概念：DNA克隆就是應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質與載體DNA結合成一具有自我復制能力的DNA分子一一復制子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆又稱重組DNA。2 .重組DNA的基本原理 一個完整的DNA克隆過程應包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構建， 目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導入受體細胞，篩選并無性繁殖含重組分子的受體細

7、胞(轉化子)。(1) 目的基因的獲取 目前獲取目的基因大致有如下幾種途徑或來源。a. 化學合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根據某種基因產物的氨基酸序列推導出該多肽編碼基因的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過化學合成原理合成目的基因。b. 基因組DNA：采用物理方法(剪切或超聲波)或限制性內切酶將染色體 DNA切割成許 多片段，然后將它們與適當克隆載體結合，將重組DNA轉入受體菌中擴增，每個細菌內都 攜帶一種重組 DNA 分子的多個拷貝。 全部細菌所攜帶的各種染色體 DNA 片段就涵蓋了基因 組全部信息， 即基因文庫。 建立基因文庫后， 結合適當篩選方法從眾多的轉化子菌株中選出 含某一基因

8、的菌株，擴增分離得到目的基因。c. cDNA:以mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與 mRNA互補的DNA,再復制成雙鏈 cDNA片段，與適當載體連接后轉入受體菌， 擴增為cDNA文庫。用適當方法cDNA文庫中就 可以篩選分離到目的基因。d. 聚合酶鏈反應：在有模板 DNA、引物及dNTP存在時，向DNA合成體系中引入熱穩(wěn) 定的Taq DNA聚合酶。反應體系經變性、退火及擴增循環(huán)自動。反復進行感興趣DNA片段 的酶促合成，使目的基因按指數增長。（ 2）克隆載體的選擇與改建a. 質粒：存在于細菌染色體外，小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，可獨立自主進行復制，含篩選標記，含多種限制性內切酶的單一切割位點，

9、可插入目的基因。b. 噬菌體：eg入噬菌體、MB載體c. 柯斯質粒與酵母人工染色體載體：用于插入大DNA片段。d. 病毒載體。（3）外源基因與載體的連接即DNA的體外重組。這種 DNA重組是靠DNA酶將外源DNA與載體共價連接的。a. 粘性末端連接I .同一限制酶切割位點連接由同一限制性核酸內切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，當這樣的兩個 DNA 片段一起退火時，粘性末端單鏈間進行堿基配對， 然后在DNA連接酶催化作用下形成共價結合的重組DNA分子。n .不同限制酶切割位點連接由兩種不同的限制性核酸內切酶切割的DNA片段，具有相同類型的粘性末端，即配對末端，也可以進行粘性不同末

10、端連接。b. 平端連接c. 同聚物加尾連接同聚物加連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉移酶作用下，在 DNA 片段制造出粘性末端，而后進行粘性末端連接。d. 人工接頭連接（4）重組 DNA 導入受體細胞根據重組 DNA 時所采用的載體性質不同，導入重組 DNA 分子有轉化、轉染和感染等不 同手段。a. 感受態(tài)細胞。經一定方法處理 （如CaCD處理）后具備接受外界 DNA能力的大腸桿菌。 受體菌應為安全無毒菌株，且為限制酶缺陷型及重組缺陷型。b. 轉化、轉染及感染。本定義不涉及真核細胞，只針對大腸桿菌。 轉化：以質粒為載體，將攜帶外源基因的載體 DNA 導入受體

11、細胞。轉染：以噬菌體為載體， 用DNA連接酶使噬菌體 DNA環(huán)化，再通過質粒轉化方式導入 受體菌。感染：以噬菌體為載體，在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。（5）重組體的篩選a.直接選擇法 直接法是針對載體攜帶某種或某些標志基因和目的基因而設計的篩選方法，其特點是直接測定基因表型。I .抗藥性標志選擇：如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標志基因，則只有含這種抗藥基 因的轉化子細菌才能在含該抗菌藥物的培養(yǎng)板上幸存并形成菌落。n 標志補救：若克隆的基因能夠在宿主菌表達，且表達產物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補,那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選，這就是標志補救篩選。川分子雜交法b.免疫學方法應用

12、特異抗體與目的基因表達產物相互作用進行篩選，屬非直接選擇法。特異性強、靈敏度高，適用于選擇不為宿主菌提供任何標志的基因。（6）克隆基因的表達a. 原核表達體系大腸桿菌是當前采用最多的原核表達體系，運用大腸桿菌表達載體符合下述標準：含大腸桿菌適宜的選擇標志具有能調控轉錄、產生大量mRNA的強啟動子含適當的翻譯控制序列和翻譯起始點等含有合理設計的多接頭克隆位點，以確保目的基因按一定方向與載體正確銜接表達產物的分離、純化。大腸桿菌表達體系中尚有一些不足之處：由于缺乏轉錄后加工機制，只能表達克隆的cDNA,不宜表達真核基因組 DNA;由于缺乏適當的翻譯后加工機制，表達的真核蛋白質 不能形成適當的折疊或

13、進行糖基化修飾；表達的蛋白質常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進行復雜的復性處理；很難表達大量的可溶性蛋白。b. 真核表達體系與原核表達體系比較，真核表達體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)勢性。尤其是哺乳類動物細胞，不僅可表達真核的 cDNA,而且還可表達真核基因組 DNA;將表達載體導入真核細胞的過程稱轉染，常用于細胞轉染的方法有：磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導轉染、電穿孔法、脂質體轉染及顯微注射。三. DNA操作技術的其他工具（一）反轉錄1970年Temin等在致癌 RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的 DNA聚合酶，該酶以 RNA為核 板，根據堿基配對原則，按照RNA的

14、核苷酸順序（其中V與A配對）合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉錄的方向相反，故稱為反轉錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉錄酶。后來發(fā)現(xiàn)反轉錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞中也有反轉錄酶。反轉錄酶的作用是以 dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA）為引物， 在tRNA3桹H末端上，按5宀方向，合成一條與 RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單 鏈叫做互補 DNA（complementary DNA, cDNA）,它與RNA模板形成 RNA桪NA雜交體。隨后 又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條 D

15、NA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程（如下圖）。卯丨丨.RNADNA奈交萍 5*4RNABH屮54DNA聚咅酸iiiiiiiiinh.i雙辭DMA攜帶反轉錄酶的病毒又稱為反轉錄病毒，它侵入宿主細胞后先以病毒 RNA 為模板靠反 轉錄酶催化合成 DNA,隨后這種DNA環(huán)化并整合到宿主細胞的染色體 DNA中去，以原病毒 的形式在宿主細胞中一代代傳遞下去。以后又發(fā)現(xiàn)許多反轉錄病毒基因組中都含有癌基因， 如果由于某種因素激活了癌基因就可使宿主細胞轉化為癌細胞。大多數反轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性： DNA聚合酶活性；以 RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要

16、RNA為引物，多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3 末端以5宀方向合成DNA。反轉錄酶中不具 有3宀外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。 RNase H活性；由反轉錄酶催化合成的 cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA5端水解掉 RNA分子。 DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條 DNA分子。除此之外，有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織

17、細胞提取mRNA并以它為模板，在反轉錄酶的作用下，合成出互補的DNA（cDNA），由此可構建出cDNA文庫（cDNA library），從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法。（二）DNA探針DNA探針技術又稱分子雜交技術，是利用DNA分子的變性、復性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性 DNA序列進行探查的新技術。 DNA探針是利用同位素、生物 素等標記的特定 DNA片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組DNA,小至20個堿基。當DNA探針與待測的非標記單鏈 DNA （或RNA）按堿基順序互補結合時，以氫健將2條單鏈連接而形成標記DNA-DNA （或標記DNA-

18、RNA）的雙鏈雜交分子。將未配對結合的核苷酸溶解后用 檢測系統(tǒng)（放射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應結果。由于DNA分子堿基互補的精確性，單連DNA探針僅與樣品中變性處理的 DNA單鏈出現(xiàn)配對雜交，由此決定了探針的特異性； 用放射性同位素（如32P）或生物素標記探針，使雜交試驗同時具有高度的敏感性。相關內容：所謂雜交指兩個以上的分子因具有相近的化學結構和性質而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體中 的分子不是來自一個二聚體分子。同一個二聚體中的兩個分子在變性解離后重組合稱為復性。利用兩條不 同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術相對應的另一項 技術被稱為探針技

19、術，它是指利用標記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技術，我們 把標記的分子叫探針。將探針技術與分子雜交技術相結合，從而使分子雜交技術得以廣泛推廣應用。目前 所用的核酸雜交技術均應用了標記技術。DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲的 DNA 探針種類很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA 探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些 DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術的發(fā)展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術用于細菌的 分類和

20、菌種鑒定比用 G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發(fā)展方向，加之分子雜交技術的高度 敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。DNA 探針（包括 cDNA 探針）有三大優(yōu)點：第一，這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。其次， DNA探針不易降解（相對 RNA而言），一般能有效抑制 DNA酶活性。第 三，DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記。（三）PCR技術類似于 DNA 的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應

21、步驟構成： 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93C左右一定時間后， 使模板DNA雙鏈或經PCR 擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。 引物的延伸：DNA模板-引物結合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性 -退火 -延伸三過程，就可獲得更多的 “半保留復制鏈 ”，而且這種新鏈 又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一

22、個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。四人類基因組計劃HGP（Human Genome Project）是了解人類自身奧秘的計劃，1985年，美國能源部（DOE）率先提出，旨在闡明人類基因組 DNA長達3X 109堿基對（base pair, bp）的序列。發(fā)現(xiàn)所 有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。1986 年美國宣布啟動”人類基因組啟動計劃”；1989年，美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）建立國家人類基因組 研究中心（NCHGF）; 1990年，NIH和DOE聯(lián)合提出美國人類基因組計劃，正式啟動HGP,計劃于 15年內提供 30億美元的資助。

23、人類基因組計劃主要內容包括繪制人類基因組的4張圖，即遺傳 （連鎖）圖、物理圖、 DNA序列圖和轉錄圖。（1）遺傳圖 遺傳圖是指基因或 DNA 標記（如多肽性遺傳標記 ）在染色體上以遺傳距離表示相對位置的圖，又稱為連鎖圖。遺傳距離通常以基因或DNA 片段在染色體交換過程中分離的頻率厘摩（CM）來表示。cM值越高，表明兩點之間距離越遠；CM值越低，表明兩點間距離越近。通過遺傳圖可以大致了解各個基因或DNA片段之間的相對距離與方向。遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的DNA標記越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高。目前人類基因組遺傳圖的分辨率為6cM。遺傳圖不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手

24、段，即使在人類基因組物理圖建立起來之后， 它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重 要手段。這方面研究的下一個目標就是建立分辨率更高的遺傳圖。（2）物理圖 物理圖指表示 DNA序列上DNA標記之間實際距離的圖。通常由 DNA的限制酶片段或克隆的 DNA片段有序排列而成。 標記之間的物理距離以DNA上核苷酸數目的多少（kb，表示千堿基對，或 Mb ,1 Mb=1 000 kb）來表示。物理圖是進行 DNA序列分析和基因組織結構研究的基礎。 限制酶物理圖是基因組結構的重要特征， 例如， 每一個基因都有其 特定的限制酶， 每一條染色體， 每一個個體的基因組，甚至每一個物種的基因組， 都有其特 異的限制酶

25、物理圖。物理圖反映了 DNA標記之間的實際距離，而遺傳圖則反映DNA標記之間的連鎖關系。在DNA交換頻繁的區(qū)域，兩個物理距離位置相距較近的基因或DNA片段，可能具有較大的遺傳距離，而兩個物理距離位置相距較遠的基因或DNA片段，則可能因該部位在遺傳過程中很少發(fā)生交換而具有很近的遺傳距離。（3）序列圖 序列圖是指整個人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖。測定的總長度約為1 m。由30億個核苷酸對組成的序列圖就是人類基因組計劃原定2005年要完成的任務。 2000年6月，6國科學家已向全世界宣布 “人類基因組草圖 ”的繪制工作已經完成。（4）轉錄圖 在整個人類基因組中，只有1%5%的DNA序

26、列為編碼序列。在人體某一特定組織的細胞中，一般只有10%的基因是表達的。如果能把某段DNA 序列相應的 mRNA確定下來，就抓住了基因的主要部分，即可轉錄部分。所以，一張人類基因組的轉錄圖（也稱 cDNA 圖或表達序列圖 ） 才是人類基因圖的雛形1999 年，作為惟一的發(fā)展中國家，我國正式參與了這個跨世紀的國際合作項目，德、 日、英、 法國家的科學家先后正式加入， 共有 16 個實驗室和 1100 名生物科學家、 計算機專 家和技術人員參與其中。該計劃已繪制出覆蓋率達97的人類基因組 “工作框架圖 ”，并在2001年 6月前繪制出更高覆蓋率的 “完成序列圖 ”；2003年 4月 14日，由我國

27、總理溫家寶和 其他五國政府首腦簽署的 人類基因組聯(lián)合宣言 發(fā)表； 2005年 10月26日，六國“協(xié)作組” 宣布這一計劃圓滿完成。五.DNA技術的其他應用（一）親緣鑒定DNA 是從幾滴血 , 腮細胞或培養(yǎng)的組織纖內提取而來。用疇素將 DNA 樣本切成小段 , 放進喱膠內，用電泳槽推動 DNA小塊使之分離一一最細的在最遠，最大的最近。之后，分離 開的基因放在尼龍薄膜上，使用特別的DNA探針去尋找基因，相同的基因會凝聚于一，然后, 利用特別的染料，在X光的環(huán)境下，便顯示由DNA探針凝聚于一的黑色條碼。小孩這種肉眼 可見的條碼很特別，一半與母親的吻合 ，一半與父親的吻合。這過程重覆幾次，每一種探針用

28、于尋找DNA的不同部位并影成獨特的條碼 ，用幾組不同的探針，可得到超過99.9%的父系或 然率或分辨率。（二）醫(yī)療與制藥基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的貢獻體現(xiàn)在三個方面：利用 “工程菌 ”生產基因工程藥品；基因診斷；基因治療。1. 工程菌概念及基因工程獲得胰島素的方式工程菌指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。 如：含有人類胰島素的大腸桿菌菌株， 含有抗蟲基因的土壤 膿桿菌菌株都是 “工程菌 ”?？茖W家將動物體內能夠控制產生胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組， 并且在大腸桿菌內表達成功。 從而取代了過去主要從豬、 牛等家畜的胰腺中提取 胰島素的歷史，滿足了社

29、會中糖尿病對胰島素的需求。2. 干擾素概念及產生機理干擾素是病毒侵入細胞后產生的一種糖蛋白。由于干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染， 因此，它是一種抗病毒的特效藥。 傳統(tǒng)的干擾素生產方法是 從人的血液中白細胞內提取的，每300wL能提取出1mg干擾素。科學家用基因工程的方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內獲得了干擾素，從每1kg細菌培養(yǎng)物中可以得到 2040mg干擾素。3. 白細胞介素及其產生機理白細胞介素-2 是淋巴細胞產生的一種淋巴因子，能促進 淋巴細胞活化和增殖。用基因工程方法生產的白細胞介素 -2 在臨床上主要用于治療腫瘤和 感染性疾病。 20 世紀 90 年代后期， 我國上海生化研究所的研究

30、人員完成了白細胞介素 -2 在 大腸桿菌中的高效表達。4. 基因診斷概念及應用基因診斷是用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標記的 DNA 分子做探針，利用 DNA 分子雜交原理，鑒定被檢測標本上的遺傳信息，達到檢測疾病的目的。DNA探針的制備方法之一：根據翻譯產物蛋白質的氨基酸序列查出相應的核苷酸序列（約 30 個氨基酸對應的 90 個左右的核苷酸序列） ，再從中選出兩個片段，用化學方法合成 這兩個片段并作同位素標記，即成探針。方法之二：用所需的mRNA逆轉錄后成為 DNA,標記后作為探針。用這一探針探查基因文庫中經加熱或提高pH 值而使之已經變性的 DNA片段，如果有一個片段能和探針片段

31、互補結合而成雙鏈（分子雜交），這一片段即含有所需要的基因?；蛟\斷是一種快速簡便的方法。例如：用3珠蛋白的DNA探針可以檢測出鐮此外， 基因診斷技術刀型細胞貧血癥； 用苯丙氨酸羥化酶基因探針可以檢測出苯丙酮尿癥。在腫瘤診斷中的應用也取得了重要成果。5基因治療及其原理基因治療是把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治 療疾病的目的。 其原理是把健康的基因導入含有基因缺陷的細胞中， 在有基因缺陷的病人的 細胞中既含有缺陷基因， 又含有通過基因工程導入的健康基因。 因此， 在病人體內兩種基因 都能夠表達， 健康基因的表達產物掩蓋了缺陷基因的表達產物， 從而治愈了有基因缺陷的疾 病。例如， 有一

32、種人類遺傳病叫做半乳糖血糖，患這種病的人，由于細胞內半乳糖苷轉移酶 基因缺陷而缺少半乳糖苷轉移酶，因此當乳糖分解成半乳糖后，不能繼續(xù)轉化成為葡萄糖， 過多的半乳糖在體內積聚，會引起肝、腦等功能受損。 1971 年，美國的一位科學家在體外 做了一個實驗， 他用帶有半乳糖苷轉移酶基因的噬菌體侵染患者的離體組織細胞， 結果發(fā)現(xiàn) 這些組織細胞能夠利用半乳糖了。（三）基因工程與農業(yè)基因工程在農牧業(yè)生產上的應用主要是培育高產、優(yōu)質或具有特殊用途的動植物新品 種?；蚬こ淘谵r業(yè)方面的應用主要表現(xiàn)在兩個方面。 首先，是通過基因工程技術獲得高產、 穩(wěn)產和具有優(yōu)良品質的農作物。例如，用基因工程的方法可以改善糧食作

33、物的蛋白質含量。 其次，是用基因工程的方法加快農作物新品種的培育。 科學家們在利用基因工程技術改良農 作物方面已取得重大進展， 一場新的綠色革命近在眼前。 這場新的綠色革命的一個顯著特點 就是生物技術、 農業(yè)、 食品和醫(yī)藥行業(yè)降融合到一起。 基因技術的突破使科學家們得以用傳 統(tǒng)育種專家難以想象的方式改良農作物。 例如， 基因技術可以使農作物自己釋放殺蟲劑， 可 以使農作物種植在旱地或鹽堿地上， 或者生產出營養(yǎng)更豐富的食品。 科學家們還在開發(fā)可以 生產出能夠防病的疫苗和食品的農作物?；蚣夹g也使開發(fā)農作物新品種的時間大為縮短。 利用傳統(tǒng)的育種方法， 需要七、 八年 時間才能培養(yǎng)出一個新的植物品種

34、， 基因工程技術使研究人員可以將任何一種基因注入到一 種植物中，從而培育出一種全新的農作物品種，時間則縮短一半?？茖W家將某些特定基因與病毒 DNADNA 轉移到動物受精卵中。由這種 如具有抗病能力、 高產仔率、 高基因工程在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應用也具有廣闊的前景，構成重組DNA,然后通過感染或顯微注射技術，將重組 受精卵發(fā)育稱的動物可以獲得人們所需要的各種優(yōu)良品質， 產奶率和高質量的皮毛等。（四）基因工程與環(huán)境保護基因工程的方法可以用于環(huán)境監(jiān)測， 和被污染環(huán)境的凈化。 利用基因工程可獲得同時能 分解多種有毒物質的新型菌種。例如， 1975 年，有人把降解芳烴、萜烴和多環(huán)芳烴的質粒 轉移到能降解烴的

35、一種假單胞桿菌內，結果獲得了能同時降解四種烴類的“超級菌”，它能把原油中約三分之二的烴分解掉。這種新型“工程菌”在環(huán)境保護方面有很大的潛力。 據報道，利用自然菌種分解海上浮油要花費一年以上的時間，而這中“超級菌”卻只要幾個小時 就夠了。六危害與倫理1轉基因食品的安全性1994 年美國 Caigene 公司的轉基因延熟番茄經 FDA 批準上市， 成為第一例通過安全評 價的轉基因植物食品。迄今為止，全世界已有40 多個可能作為食品來源的轉基因植物獲得批準上市。主要包括延熟番茄，抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜，抗蟲的馬鈴薯、棉花 和玉米，抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜，雄性不育的玉米和萵苣，以及改變

36、油脂特性的油 菜和大豆等。轉基因植物由于采用遺傳工程操作的特殊手段，可能存在無法預測的其它性狀的改變，從而帶來某些轉基因植物食品的安全性問題。轉基因食品對人類的危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對人體產生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過敏源，引起人體的過敏反應。（3）這種食品某些營養(yǎng)成分或營養(yǎng)質量可能產生變化，使人體出現(xiàn) 某種病癥。1993年經濟發(fā)展合作組織（OECD）提出了食品安全性分析的實質等同性（Substa ntial equivale nee）原則，即生物技術產生的食品及食品成分是否與目前市場上銷售 的食品具有實質等同性。轉基因食品的安全評估主要包括：有無毒性、

37、有無過敏性以及抗生素抗性等標記基因的安全性。 食品安全性試驗最主要的問題是提出相關的科學問題并加以回 答，假設安全性分析包括所有可能的變數，則會太復雜到難以處置；相反，若僅觀察少數變數，則某些重要因素可能會被忽略。由于人們對轉基因食品的潛在危險性和安全性缺乏足夠的預見能力，因此，根據國情建立一系列的轉基因食品安全管理程序和措施是十分必要的。2. DNA技術引發(fā)倫理問題對人類的基因干預有可能引發(fā)現(xiàn)存人類道德不能包容的倫理難題，也是引致廣泛爭論的話題。因為對人類生命的干預，以前從未在這種廣度和深度進行，社會倫理缺乏充分的接納準備。而克隆技術的最新發(fā)展，使人們更有理由擔心基因研究被應用于非人道的目的

38、。如果復制技術被某些不受管制的瘋子”濫用，世界也將因人類科技進步而陷入噩夢般的境地。美國廣播公司1997年就復制技術進行的一項民意調查顯示，82%的美國人反對用復制技術培育人類；93%的美國人說，他們本人不愿意被人應用復制技術造出另一個與他一模一 樣的人。民意調查還表明，50%的美國人不贊成搞復制技術研究。1995年諾貝爾和平獎獲得者，英國核物理學家羅特布拉特反復制羊”的問世同原子彈的出現(xiàn)相提并論。他最近不無憂慮地說，遺傳工程像原子彈一樣具有令人恐怖的可能性 ”他強烈呼吁建立一個國際倫理委員會， 負責阻止可能危及人類的科學研究項目。 美國生物技 術工業(yè)組織也對復制技術諱莫如深， 該組織曾經發(fā)表

39、公報， 告誡其所屬的700家企業(yè)和研究 中心不得從事無性生殖的研究活動。復制羊”的消息公布后，美國政府迅速做出反應。2月24日當天，美國總統(tǒng)克林頓即發(fā)表談話，要求美國國家生物倫理學咨詢委員會研究復制技術在法律和倫理方面可能造成的 影響，并在3個月之內向他匯報。 克林頓甚至主張對美國現(xiàn)有的關于人類胚胎研究的立法進 行調整?！镜湫屠}】例1.作為基因的運輸工具 一運載體，必須具備的條件之一及理由是 A能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因B. 具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達C. 具有某些標記基因，以便目的基因的表達提供條件D. 在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存，以便于

40、進行篩選析：本題考查的是運載體必須具備的條件及理由，條件與理由必須相符。作為運載體要攜帶目的基因進入手提細胞并使之表達，必須能夠在宿主細胞內穩(wěn)定地保存并大量復制，以便通過復制提供大量目的基因。同時要具有某些標記基因， 是為了通過標記基因是否表達判斷目的基因是否進入了受體細胞，從而進行篩選手提細胞。 運載體要具有多個限制切點，則是為了便于與外源基因連接。綜上所述，正確答案為Ao答案：Ao例2下列有關基因工程技術的敘述，正確的是 A. 重組DNA技術所用的工具酶是限制酶、連接酶和載體B. 所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列C. 選用細菌作為重組質粒的受體細胞是因為細菌繁殖快D. 只要目的

41、基因進入了受體細胞就能成功實現(xiàn)表達析：此題考查了基因的操作工具、目的基因的表達等知識。解答題目明確以下幾方面 的知識：基因操作的工具酶是現(xiàn)之美、DNA連接酶；一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列；載體是基因的運載體工具； 目的基因進入體細胞后，受體細胞表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程；導入受體細胞中目的基因主要為了表達、生產目的基因的產物，因此能夠快速繁殖是選擇受體細胞的重要條件之一。答案：Co例3.下列高科技成果中，根據基因重組原理進行的是 我國科學家袁隆平利用雜交技術培育出超級水稻我國科學家將蘇云金芽孢桿菌的某些基因移植到棉花體內，培育出抗蟲棉我國科學家通過返回式衛(wèi)星搭載種子

42、培育出太空椒我國科學家通過體細胞克隆技術培養(yǎng)出太空牛A. B.C.D.析：本題考查幾種高薪技術所依據的遺傳學原理。袁隆平培育新型水稻利用的是雜交 技術，他本人也被稱為“雜交水稻之父”。而雜交技術的原理就是基因的自由組合定律；基因工程是認為地將目的基因導入受體細胞，使之表達，所以抗蟲棉的培育原理也應是基因重組；太空育種的原理是基因突變；克隆技術則是無性繁殖。答案：Bo例4:科學家應用基因工程培育出了一種抗蟲棉，它能產生毒素殺死害蟲，目前正在大面積推廣種植?？茖W家還研究了害蟲的遺傳基因，發(fā)現(xiàn)不抗毒素對抗毒素為顯性(此處分別用B和b表示)。據此回答：(1) 種植抗蟲棉，有禾U于生態(tài)環(huán)境保護，這是因為

43、 o(2 )棉田不抗毒素害蟲的基因型為 ;抗毒素害蟲的基因型為 o(3 )不抗毒素害蟲與抗毒素害蟲雜交則子代的基因型為 o析：本題主要考查以下幾個問題：“轉基因抗蟲棉”具有抗害蟲的能力，這表明棉花 體內產生了抗蟲的毒蛋白物質。這個事實說明，害蟲和植物共用一套遺傳密碼，蛋白質合成的方式是相同的?！稗D基因抗蟲棉”康害蟲的遺傳信息傳遞過程可表示為DNA (基因)T RNAT蛋白質?？茖W家語言，此種“轉基因抗蟲棉”獨立種植若干代以后，也將出現(xiàn)不抗 蟲的植株，此現(xiàn)象來源于基因突變。答案：(1)可以減少或不再使用農藥殺蟲，從而避免農藥對環(huán)境造成污染(2) BB 或 bb ( 3) Bb 或 bb例5：蠶的

44、絲腺細胞能產生大量蛋白質，這種蛋白質叫絲蛋白。這些細胞不產生血液中的蛋白質，因此推測絲腺細胞 A. 只有絲蛋白基因B. 有血蛋白和絲蛋白基因C. 有絲蛋白基因和其他基因，但沒有血液蛋白基因D. 比合子的基因少析生物體每個正常體細胞中都含有本物種整套的基因。對一個不斷分裂的胚性細胞而言，這些基因能按一定的發(fā)育順序被逐漸打開；而對一個高度分化的細胞(如絲腺細胞)而 言，細胞內絕大部分基因被關閉了，一般只有少部分與該細胞功能有關的基因才具有表達功能。因此，絲腺細胞中絲蛋白和血液蛋白基因都存在，但絲蛋白基因可以表達而血液蛋白基因被關閉了，不能表達。答案：Bo【智能訓練】1 根據基因工程的定義，下列名詞

45、中不能替代基因工程的是A.基因誘變B.分子克隆E.基因無性繁殖C.DNA重組D.傳工程2 .基因工程操作的三大基本兀件是A.供體、受體、載體B.供體、受體、抗體C.供體、受體、配體D.供體、抗體、載體3 .n型限制性內切核酸酶是指 A. 有內切核酸酶和甲基化酶活性且經常識別回文序列B. 僅有內切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供C. 限制性識別非甲基化的核苷酸序列D. 有外切核酸酶和甲基化的核苷酸序列4 .限制性內切核酸酶可以特異性地識別 A. 雙鏈DNA的特定堿基對B.雙鏈DNA的特定堿基序列C.特定的三聯(lián)密碼D.以上都正確5 .經抗藥性遺傳標記法篩選出的轉化體中，往往會出現(xiàn)無載體或無重組DNA分子的菌落,其原因很可能是A. 標記基因發(fā)生突變B. 載體或重組 DNA分子整合到了受體染色體C. 載體空載D. 載體或重組DNA分子不穩(wěn)定E. 篩選藥物誘導受體細胞產生抗體6. 關于cDNA最正確的說法是 A. 同mRNA互補的單鏈 DNAB.同mRNA互補