柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的影響

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減柔肝消癥飲對肝硬化大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子B1表達(dá)的影響（作者：單位：郵編：）作者：楊牧祥于文濤王少賢張【摘要】目的 觀察柔肝消癥飲對肝硬化大鼠轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）B 1 表達(dá)的影響。方法 以復(fù)方鱉甲軟肝片為對照，觀察柔肝消癥飲對肝 硬化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)和肝細(xì)胞 TGF3 1表達(dá)的影響。結(jié)果 與正 常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)肝小葉損害，纖維組織增生，假小葉形成， 肝細(xì)胞TGF（3 1表達(dá)明顯增強(qiáng)（P0.01）;與模型組比較，各治療組肝臟 病理損害較輕，肝細(xì)胞 TGF3 1表達(dá)減少（P0.01）。結(jié)論 柔肝消癥飲 能顯著抑制肝硬化模型大鼠肝細(xì)胞TGF3 1表

2、達(dá)，具有抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成、抗肝硬化的作用?！娟P(guān)鍵詞】 柔肝消癥飲；肝硬化；轉(zhuǎn)化生長因子B 1【Abstract Objective To observe the effect of Rouganxiaozheng liquid on expression of TGFp 1 in hepatic cells of cirrhosis rats. Methods Fufangbiejiaruangantablet wasselected as con trol and the effect of Rouga nxiaozhe ng liquid on hepatic sclerosis was

3、 evaluated by observ ing the cha nge ofpathological hepatic tissue and the expressi on of TGF3 1 inhepatic cells. Results Compared with normal group, the normal hepatic lobules in model group were disappeared and fibroplasias and pseudolobule formed. The expressi on of TGF3 1 in hepatic cells were i

4、n creased obviously(P0.01). Compared with model group, the change of pathological histology of each treatment group was improved, the expression of TGFp 1 of each treatme nt group was decreased evide ntly(P0.01). Con clusi ons Rouganxiaozheng liquid has the effect of inhibitingthesynthesis ofextrace

5、llular matrix and hepatocirrhosis and canobviously decrease the expressi on of TGF 3 1 in hepatic cells of cirrhosis rats.【Key words Rouganxiaozheng liquid; Hepatic cirrhosis;TGFp 1肝硬化是由一種或多種病因長期或反復(fù)作用造成的彌散性肝臟損 害，是我國常見疾病和主要死亡病因之一1。目前國內(nèi)外尚缺乏有 效的治療藥物。柔肝消癥飲為本課題組經(jīng)多年臨床觀察篩選的治療肝 硬化有效方藥，為了探討其作用機(jī)制，本研究觀察了該藥對肝硬化

6、大 鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) 3 1表達(dá)的影響。1材料與方法1.1材料1.1.1動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180200 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，動物合格證號：SCXK鄂）2004 擬 007。1.1.2藥物柔肝消癥飲：由香附、青皮、炙黃芪、炒白術(shù)、白 芍、三棱、莪術(shù)、地鱉蟲、郁金、姜黃、丹參等藥物組成，水煎濃縮 成所需含量的藥液。復(fù)方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有 限公司）0.5 g/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 Z19991011。1.1.3主要試劑TGFB 1免疫組織化學(xué)試劑盒購自Santa Cruz , 批號：sc擬146。1.1.4主要儀器HH擬

7、W2擬600型電熱恒溫水箱，天津泰斯特儀 器有限公司；OLYMPUS BX5型顯微照相儀，日本；LEICA RM2125型切 片機(jī)，德國LEICA公司。1.2方法1.2.1模型制備60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為造模組48 只和正常組12只。參照文獻(xiàn)2，3，48只造模組大鼠首次予皮下 注射40%四氯化碳花生油溶液0.5 ml/100 g 體重，以后每周2次皮 下注射0.3 ml/100 g 體重，共9 w。造模開始前2 w均以20%豬油、 0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料（河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心加工） 喂養(yǎng)，第39周以0.5%膽固醇和99.5%玉米面混合飼料（河北醫(yī)科 大學(xué)動物實(shí)

8、驗(yàn)中心加工）喂養(yǎng)。整個造模期間以 30%L醇作為飲料讓 大鼠自由飲用。正常組則以正常飼料和純凈水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)9 w末確認(rèn)造模成功后予以分組治療。1.2.2分組與治療 造模結(jié)束后，正常組隨機(jī)抽取大鼠10只，將 造模成功大鼠隨機(jī)抽取40只，再分為4組，每組10只，雌雄各半。 各組用藥如下：正常組：灌服生理鹽水；模型組：灌服生理鹽水； 柔肝消癥高劑量組（簡稱高劑量組）：每日予柔肝消癥2.5 g/100 g 體重；柔肝消癥低劑量組（簡稱低劑量組）：每日予柔肝消癥 1.25 g/100 g體重；復(fù)方鱉甲軟肝片對照組（簡稱對照組）：每日予復(fù)方 鱉甲軟肝片0.056 g/100 g體重。各治療組均將藥物配制成

9、所需濃度， 1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 ml/100 g計(jì)算，共4 w。1.2.3動物取材 治療結(jié)束后，用10%水合氯醛（0.2 ml/kg）將大 鼠麻醉，腹部正中切口，迅速剖取肝臟，用濾紙吸去表面液體，在肝 臟最大葉距邊緣約0.5 cm處取1 cm3大小組織塊，置于4%多聚甲醛 溶液固定24 h，逐級酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，采用HE和免疫組化SP法染色。1.2.4檢測指標(biāo)免疫組化光鏡下TGF（3 1陽性表達(dá)為棕黃色顆 粒。采用HPIASQ；1000型高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng) 9.0版 對染色陽性部位進(jìn)行光密度值測定。定量分析TGF（3 1陽性表達(dá)的面數(shù)密度（Na）（測

10、量窗口中陽性細(xì)胞數(shù)目/參考面積，表示參照系單位體 積中陽性細(xì)胞的數(shù)目），比表面（Sv）（陽性表達(dá)總周長/參考面積，反 映參照體積中陽性細(xì)胞面積所占的相對比例 ），體積百分?jǐn)?shù)（Vv）、面 積百分?jǐn)?shù)（Aa）（陽性表達(dá)總面積/參考面積，反映單位面積內(nèi)陽性表達(dá) 面積所占的比值），平均灰度（反映肝細(xì)胞中陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度）。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量數(shù)據(jù)采用x 士 s表示，運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析、Student擬Newma擬Keul檢驗(yàn)2結(jié)果2.1各組大鼠肝細(xì)胞TGF（3 1的定量表達(dá) 模型組大鼠肝細(xì)胞TGF （3 1Na Sv、Vv和平均灰度均較正常組明顯升高（P0.01）;用藥治療后，

11、 各用藥組TGF3 1陽性表達(dá)參數(shù)均較模型組明顯下降（P0.01）。其中， 高劑量組TGF3 1Na較對照組明顯下降（P0.05）。見表1。表1各組大 鼠肝細(xì)胞TGF3 1的定量表達(dá)與模型組比較：1）P0.01;與對照組比較： 2）P0.052.2光鏡觀察 見圖1。正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則成索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分 布。肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，無異常改變。肝細(xì)胞呈多邊形，胞漿均勻，細(xì) 胞核形態(tài)正常。模型組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，間質(zhì)內(nèi)彌漫性淋巴 細(xì)胞浸潤。肝細(xì)胞體積明顯增大，局部肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性， 可見到再生的肝細(xì)胞（雙核）。肝間質(zhì)廣泛纖維組織增生，

12、將正常肝小 葉分割成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)（即假小葉形成）。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu) 亦受損，少數(shù)肝細(xì)胞氣泡樣變性但僅偶見壞死細(xì)胞，較少炎性細(xì)胞浸潤，少量纖維組織增生，但未見形成間隔。低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)被破 壞，部分肝細(xì)胞氣泡樣變性并伴有細(xì)胞壞死，較多淋巴、單核細(xì)胞浸 潤，纖維組織增生，但較少形成間隔。對照組與低劑量組基本相似。2.3各組大鼠TGF3 1的定性表達(dá)TGF3 1在正常肝細(xì)胞中有少 量表達(dá)，有少量胞核和胞漿染色陽性。造模以后大鼠肝細(xì)胞TGF3 1表達(dá)量明顯增強(qiáng)、陽性染色細(xì)胞數(shù)目增多，呈棕黃色胞漿型分布，主 要見于星狀細(xì)胞、類間質(zhì)細(xì)胞和炎細(xì)胞胞漿中。見圖2。各治療組陽 性染色程度較模型組明顯減

13、輕，在纖維隔內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞和炎細(xì)胞胞漿陽 性染色程度減輕、數(shù)目減少。圖1模型組大鼠肝臟病理變化（HE, X 200）圖2模型組大鼠肝細(xì) 胞TGF）； B 1表達(dá)（免疫組化，X 400）3討論肝硬化屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等病證范疇。中醫(yī) 學(xué)認(rèn)為本病多由酒食不節(jié)，損傷脾胃，脾失健運(yùn)，壅阻氣機(jī)，肝失條 達(dá)，氣血郁滯，或情志抑郁，肝失疏泄，氣郁日久，血流不暢，瘀血 停積，脅絡(luò)痹阻所致。其病位在肝脾兩臟，主要病機(jī)為肝郁脾虛、氣 滯血瘀。故當(dāng)以疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消癥為主要治法。本課題 組經(jīng)多年臨床觀察，反復(fù)篩選香附、青皮、炙黃芪、炒白術(shù)、白芍、 三棱、莪術(shù)、地鱉蟲、郁金、姜黃、丹參等藥物

14、組成“柔肝消癥飲”。 方中香附、青皮疏肝理氣，炙黃芪、炒白術(shù)健脾益氣，四藥相合，共 達(dá)抑肝扶脾之效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香附和青皮可減輕四氯化碳 導(dǎo)致的大鼠肝損傷，保護(hù)肝細(xì)胞4, 5；炙黃芪能促進(jìn)肝細(xì)胞合成 白蛋白，抑制間質(zhì)細(xì)胞膠原合成，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞吞噬 功能，提高機(jī)體免疫力6, 7；炒白術(shù)可減少四氯化碳引起的小鼠 肝細(xì)胞變性壞死，改善肝功能8。三棱、莪術(shù)、地鱉蟲，逐瘀消癥; 丹參、郁金、姜黃活血化瘀，可增強(qiáng)逐瘀消癥，軟堅(jiān)散結(jié)作用；白芍養(yǎng)血柔肝，既可助香附、青皮疏肝解郁之力，又可防止破血太過之弊； 現(xiàn)代藥理研究表明，丹參能降低急、慢性肝損傷大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性， 抑制膠原纖維增生及

15、假小葉生成，減輕間質(zhì)炎癥反應(yīng)，防治實(shí)驗(yàn)性肝 硬化的發(fā)生9；白芍可減輕肝細(xì)胞的壞死，對肝臟有保護(hù)作用8。 諸藥合用，共奏疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消癥之功效。近年來，關(guān) 于細(xì)胞因子在肝纖維化發(fā)病機(jī)制方面的研究極為活躍，有研究提示肝 星狀細(xì)胞(HSC)激活與轉(zhuǎn)化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，而 HSC的激活與 諸多細(xì)胞因子有關(guān)10，11。研究表明，TGF(3 1具有促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞 分化和增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，抑制其降解的作用，被認(rèn)為是肝 纖維化形成過程中的一個重要調(diào)控因子。 通過旁分泌、自分泌調(diào)控方 式刺激肝儲脂細(xì)胞生成大量膠原，形成肝纖維化導(dǎo)致肝硬化12。臨 床通過檢測TGF(3 1水平可直接了解肝纖

16、維化程度 1315。李英等16通過對97例肝硬化患者和30例正常對照組血清TGF3 1的檢 測,顯示肝硬化患者血清中的TGFB 1水平明顯高于正常對照組(P0.001)。肝纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解很大程度上由TGF31控制17。黃瑾等18通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，阿魏酸鈉可 對抗由TGF(3 1引起的肝細(xì)胞生長抑制作用，這可能與其減輕細(xì)胞內(nèi) 活性氧自由基產(chǎn)生，并能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖周期由靜止期向分裂期過渡 有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，柔肝消癥飲能夠抑制肝硬化模型大鼠肝細(xì)胞TGFB 1表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗肝纖維化、肝硬化的 作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1葉任高.內(nèi)科學(xué)M .第5版北京：人民衛(wèi)生出

17、版社，2001: 460擬 1.2李儀奎，王欽茂，周金黃.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M .上 海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991: 463擬.4.3陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991： 458.4黃險(xiǎn)峰，彭國平.香附的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展J中藥材，2003;26(1) : 66擬8.5姜靜巖，苗桂玲.青皮的藥理及臨床應(yīng)用J.時珍國醫(yī)國藥，2003;14(6) : 374擬5.6馬紅，王寶思，陳翌明，等.黃芪對免疫性肝纖維化大鼠 的治療作用J.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，1997;7(1) : 32.7王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)M .天津：天津科學(xué)技術(shù)出版 社，1997： 571，588.8

18、馬清鈞，王淑玲.常用中藥現(xiàn)代研究與臨床M .天津: 天津科技翻譯出版公司，1995: 401.9王寶恩，王早吉，朱家璇，等.復(fù)方丹參不同劑型治療肝 纖維化實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察J.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志， 1993;15(1) : 93.10展玉濤.肝星狀細(xì)胞活化的功能改變J.國外醫(yī)學(xué)消 化疾病分冊，1999;19 : 27擬9.11蔡為民，陳 峰.近年來肝纖維化主要進(jìn)展一一發(fā)病機(jī)制 研究J.臨床肝膽病雜志，1998;14 : 65擬8.12 Bedossa P， Peltier E，Terris B, et al.Transforming growth factor 擬beta 1 (TGF 擬beta 1) and TGF 擬beta 1 receptors in normal ， cirrhotic ， and neoplastic human liversJ.Hepatology，1995;21(3) : 760擬613劉 芳，李兵順，南月敏.慢性乙型肝炎患者血清轉(zhuǎn)化生 長因子B 1在肝纖維化過程中的作用J.中華肝臟病雜志，1999;7 : 196 擬 8.14閭軍，吳修斌，王蔚青.TGFB 1和I、皿型膠原在肝纖 維化大鼠血清中的水平及肝組織中表達(dá)J丨.中華肝臟病雜志，1999;