槐定堿預(yù)防小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用及對肝臟CD14TLR4表達(dá)的影響

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減槐定堿預(yù)防小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用及對肝臟CD14、TLR4表達(dá)的影響(作者：單位：郵編：)作者：王琳琳，周婭，梁錦屏，黃菱，高曉峰，劉靜，王 寧萍，趙建寧【摘要】目的研究預(yù)防性給予槐定堿對小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損 傷的影響及對CD14、TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)。方法觀察槐定堿12、6、 4mg/kg三個(gè)劑量預(yù)防性處理的小鼠，在給予內(nèi)毒素后2、6、12、24h 時(shí)各組小鼠一般狀況、肉眼及光鏡下肝組織的病理變化，賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度，RT-PCR與Western Blot分別檢 測肝組織CD14及TLR4的mRNA與蛋白表達(dá)，放免法檢測血清 T

2、NF- a含量的變化。結(jié)果槐定堿三個(gè)劑量預(yù)防性給予，各個(gè)時(shí)間點(diǎn) 結(jié)果均表明改善了內(nèi)毒素血癥模型小鼠的一般狀況，減輕了肝組織病理改變；槐定堿三個(gè)劑量組的 ALT值均低于同時(shí)間點(diǎn)的LPS模型組(PV0.01或PV0.05);槐定堿三個(gè)劑量組與同時(shí)間點(diǎn) LPS模型組 比較，均下調(diào)肝組織 CD14、TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)(P V 0.01 或P V 0.05);槐定堿三個(gè)劑量組血清 TNF- a水平均較同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組降低(PV0.01或PV0.05),并在24h時(shí)均降至正常對照組 水平。結(jié)論 槐定堿12、6、4mg/kg三個(gè)劑量預(yù)防性給予，可抑制內(nèi) 毒素血癥小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與

3、下調(diào)LPS識別受體CD14、TLR4表達(dá)，并進(jìn)而抑制下游炎癥因子分泌有關(guān)。【關(guān)鍵詞】苦豆子；槐定堿；內(nèi)毒素；肝臟；CD14 ; Toll樣受體4Abstract: Objective To observe the preventive effect of Sophorid ine on liver in flammatoryreacti on of mice withendotoxemia ， and its effect on the expression of CD14 and TLR4.Methods The ICR mice were admi nistered by three do

4、sage of Sophoridine, that was high doses (12mg/kg), middle doses (6mg/kg ) and low doses (4mg/kg ) . 2,6，12 ,24 hours after LPS injection, general symptoms were recorded,the blood and liver samples were taken and pathological damages of liver were checked. The level of ala nine ami notra nsami nase(

5、ALT) in serum was measured by Reitma n men surate rat ing. Reverse tran scripti on polymerase cha in reacti on (RTJPCR) was employed to detect themRNA expressi on of CD14 and TLR4 in liver. Protein expressi on of CD14 and TLR4 in liver were assessed by Western Blot. Serum TNF a levels were determ in

6、ed by radio immuno assay. Results The results of three dosage of Sophoridi ne pretreated groups at each time_point showed that Sophoridine could ameliorate the generalsymptoms of endotoxic liver injury models significantly and decreasepathological damage of liver tissue. The threeSophorid ine group

7、with differe nt doses showd a sig nifica ntly lower ALT value tha n that in the LPS model at the same time point (P v 0.01 or Pv 0.05); compare to the LPS model, the express of CD14 , TLR4 mRNA and proteins in the liver of the three different doses sophoridine group were down regulated significantly

8、 (P v 0.01 or P v 0.05 ) , and the levels of serum TNF a of three Sophoridine group were significantly reduced than those in the LPS model at the same time point (Pv 0.01 or Pv 0.05) , and they reached the level of no rmal con trol groups at 24h.C on clusi on The mecha nism of Sophorid ine anti en d

9、otox in liver injury had a strong relation with down Jregulating of the expression of CD14 and TLR4, and in flue nee of TLR4 tra nsducti on pathway, and restrai ning secretio n of dow nstream in flammatory factors.Key words: sophora alopecuroides L; sophorid ine; en dotox in; liver; CD14 ; toll like

10、 receptor細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide , LPS),即內(nèi)毒素(endotoxin , ET)，是革蘭陰性菌(G-菌)的主要病原相關(guān)分子模式。G-菌感染引 起膿毒癥，并進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，內(nèi)毒素是主要病原因素之一。因?yàn)榭箖?nèi)毒素藥物缺如，內(nèi)毒素所致疾病一直是臨床治療 的棘手難題1-3 。近年來，Toll樣受體4 (TLR4 )信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的發(fā)現(xiàn)為人們攻克內(nèi)毒素所致疾病提供了新的方向，將該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號受體作為靶位，以阻斷炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，從而防止失控性炎癥發(fā) 生，已成為開發(fā)新的抗內(nèi)毒素藥物的途徑之一?？喽棺?Sophoraalopecuroides L)為

11、豆科槐屬植物，槐定堿是苦豆子中含量較高的生 物堿之一。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿對內(nèi)毒素肺損傷小鼠模型 具有顯著的保護(hù)效應(yīng)4，有必要對其進(jìn)行更為深入的研究。 肝臟是 機(jī)體清除內(nèi)毒素的主要器官，同時(shí)也是內(nèi)毒素血癥時(shí)受損最早、 最明 顯的靶器官之一 5。本研究通過建立小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷模 型，觀察預(yù)防性給予槐定堿對小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用，探討其作用是否與調(diào)節(jié)LPS識別受體CD14、TLR4表達(dá)有關(guān)。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑和儀器LPS(E.coli 055 B5), Sigma 公司產(chǎn)品；槐定堿(批號:960324 ， mp 109 C，含量98%以上)購于寧夏藥物研究所

12、；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒購于北京北化康泰臨床試劑有限公司；RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于江蘇碧云 天生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠TLR4、CD14多克隆抗體購于美國 Santa Cruz公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物 有限公司；小鼠TNF- a放免分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有 限公司。1.1.2動物ICR小鼠,清潔級,均為雄性,68周齡,1822 g,寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(寧)2005-0001。1.2方法1.2.1藥物參照小鼠腹腔注射槐定堿的LD50 (58.0 mg/kg ) :

13、6,實(shí)驗(yàn)選用槐定堿約1/5、1/10、1/15 LD50三個(gè)劑量。1.2.2動物模型制備與分組ICR小鼠腹腔注射LPS(E.coli 055 : B5)10 mg/kg(經(jīng)預(yù)試驗(yàn)選 定)制備小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷模型。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組20只，即正常對照組；內(nèi)毒素 肝損傷模型組；組分別為槐定堿高劑量(12mg/kg )、中劑量(6mg/kg )、低劑量(4mg/kg )組。組小鼠腹腔注射0.2mL/10g 生理鹽水，組小鼠每天分別腹腔注射槐定堿高、中、低劑量， 連續(xù)3d;然后，除組末次注射后 30min腹腔注射生理鹽水0.2mL 外，組均在末次注射后30min腹腔注射LPS 10mg

14、/kg ;隨 后各組分別在注射LPS后2、6、12、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取5 只小鼠，進(jìn)行觀察檢測。1.2.3觀察指標(biāo)各組小鼠分別在給予 LPS后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)記錄一般狀況并取材，賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度：摘小鼠眼球取血置 小試管中，血液凝固后，3000r/min離心10min，吸取血清，按ALT 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作；肝臟的病理變化：肉眼觀察肝臟形態(tài)、色澤、包膜等的改變；取各肝右葉同一部位，置10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定后，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察肝組織的病理變 化； RT-PCR 檢測肝組織 CD14和TLR4 mRNA 表達(dá)水平：PCR 引物由北京賽百盛公

15、司合成。TLR4 弓 I物：5 CAATGTCTCTGGCAGGTGTA 3，5 AAGGGATAAGAACGCTGAGA 3:片段長度為 406bp;CD14 弓 I物：5TGCGGAGGTTCAAG ATG 3,5 GTGGACACGGAAGCAGA 3:片段長度為 237bp;伊act in 引物：5 GGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3 5 TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3 :片段長度為 350bp。提取小鼠肝組織總 RNA,采用Promega公司的一步法RT-PCR試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；PCR產(chǎn)物電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，以Bio

16、-Image Analysis System進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以相對光密度值（relative optical den sity, ROD） x面積（mm2）表示；Western-Blot檢測肝組織CD14和TLR4蛋白表 達(dá)水平：提取標(biāo)本的總蛋白；測定樣品蛋白濃度（ BCA 法）;行SDS-PAGE后，用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，以目的條 帶面積灰度值/內(nèi)參（B-actin ）條帶面積灰度值做為半定量檢測結(jié)果； 放射免疫分析法檢測血清腫瘤壞死因子（TNF- a ）含量：取血清， 按試劑盒說明書操作，丫放免計(jì)數(shù)儀檢測，打印出數(shù)值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用

17、單因素方差分析進(jìn)行組間 差異表示。應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多樣本均數(shù)間比較 采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠一般狀況的改變正常對照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)均活動自如， 進(jìn)食正常，無病態(tài)；槐定 堿各劑量組小鼠于末次給藥后 30min，注射LPS， 2h時(shí)各劑量組 小鼠均見活動減少；6h時(shí)蜷縮無力，進(jìn)食減少，低劑量組有口唇發(fā) 紫，個(gè)別有腹瀉癥狀，但高、中劑量組未見口唇發(fā)紫及腹瀉；12h時(shí)各劑量組前述癥狀緩解；24h時(shí)各劑量組小鼠進(jìn)食、活動基本恢復(fù)正 常。各時(shí)間點(diǎn)的一般狀況均明顯好于同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組。各實(shí)驗(yàn)組小鼠均無死亡。2.2小鼠肝臟

18、的病理學(xué)觀察2.2.1大體觀察正常對照組小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，包膜光滑，質(zhì)地柔 軟?；倍▔A各劑量處理小鼠給予 LPS后2h及6h肝臟無明顯肉眼可 見變化；12h時(shí)各劑量組小鼠肝臟均有輕微腫脹；24h時(shí)肝臟腫脹較 明顯，其中低劑量組的部分小鼠肝臟表面可見點(diǎn)狀及片狀出血點(diǎn)。但與LPS模型組12h及24h時(shí)間點(diǎn)相比，槐定堿各劑量組小鼠肝臟充 血水腫程度較輕，中、高劑量組未見肝表面有出血點(diǎn)。光鏡觀察：正常對照組各時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常， 肝索排列整 齊，未見炎性細(xì)胞。LPS模型組2h時(shí)無明顯變化；6h時(shí)肝小葉內(nèi)血管擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞輕微腫脹、有散在炎性細(xì)胞浸潤；12h時(shí)除上述病變更為明顯外，部分

19、區(qū)域有散在點(diǎn)狀及小灶狀壞死， 部分肝細(xì)胞出 現(xiàn)雙核現(xiàn)象；24h時(shí)可見小葉內(nèi)肝竇擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞氣球樣變，壞 死部位見較多淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)可見血管擴(kuò)張充血 及炎細(xì)胞浸潤。槐定堿各劑量組較同時(shí)間點(diǎn)LPS組病變明顯減輕，24h時(shí)病變減輕尤為明顯?；倍▔A高、中劑量組病變輕于低劑量組。 參見圖1（見封3）。2.3小鼠血清中ALT含量測定槐定堿三個(gè)劑量組的 ALT值在2、6h時(shí)間點(diǎn)變化曲線與LPS模型組相仿，但均低于同時(shí)間點(diǎn)的 LPS模型組（PV0.01或PV 0.05 ），12h時(shí)，LPS模型組的ALT值升至頂峰，而槐定堿三個(gè)劑 量組則趨于下降，至24h時(shí)除低劑量組外均已達(dá)到正常水平?；?/p>

20、定堿高、中劑量組在2、6、24h時(shí)間點(diǎn)的降A(chǔ)LT效應(yīng) 明顯強(qiáng)于低劑量組（均P V 0.05 ），說明槐定堿降低小鼠血清 ALT作 用具有一定的量-效關(guān)系，高、中劑量組優(yōu)于低劑量組，見圖2。2.4小鼠肝組織中 CD14 與TLR4的mRNA表達(dá)2.4.1肝組織中CD14 mRNA 表達(dá)槐定堿高劑量組在給予 LPS后各時(shí)間點(diǎn)肝組織CD14mRNA表 達(dá)水平均低于LPS模型組（P均V 0.01 ），而與正常對照組差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義；中劑量組各時(shí)間點(diǎn) CD14mRNA表達(dá)水平亦均顯著低于 LPS模型組（P均V 0.01 ），僅6h時(shí)間點(diǎn)CD14mRNA表達(dá)明顯高于 正常對照組；而低劑量組在 2、12、

21、24h時(shí)間點(diǎn)CD14mRNA表達(dá)水 平雖均低于LPS模型組（P V 0.05或P V 0.01），但從2h起，至12h 時(shí)均仍明顯高于正常對照組（PV0.05或PV0.01 ）, 24h時(shí)才接近 正常對照組水平，見圖3、4。2.4.2 肝組織中TLR4 mRNA 表達(dá)模型組小鼠給予 LPS后2h肝組織TLR4 mRNA表達(dá)開 始上調(diào)，并迅速于6h達(dá)高峰，以后開始下降（PV0.01 ），至24h時(shí) 接近正常對照組水平?；倍▔A三個(gè)劑量組在給予 LPS后TLR4 mRNA 表達(dá)趨勢與LPS模型組相似，但與同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組比較，槐定 堿三個(gè)劑量均表現(xiàn)出下調(diào) TLR4 mRNA作用，至12h除低劑量

22、組外， 高、中劑量組已接近正常對照組水平，見圖 5、6。2.5小鼠肝組織中CD14、TLR4的蛋白表達(dá)2.5.1肝組織中CD14蛋白表達(dá)模型組在給予LPS后各時(shí)間點(diǎn)CD14蛋白表達(dá)趨勢與其 mRNA表達(dá)基本一致。2h肝組織中CD14蛋白表達(dá)開始明顯上調(diào)， 并迅速于6h達(dá)高峰，以后開始下降，至 24h仍明顯高于正常對照 組（PV0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；倍▔A高、中、低劑量組在給予 LPS后CD14蛋白表達(dá)趨勢與LPS模型組相似，但除6h低劑量組 外各時(shí)間點(diǎn)的CD14蛋白表達(dá)均顯著低于同時(shí)間點(diǎn) LPS模型組（P V0.01 或 PV0.05）,見圖 7、8。2.5.2肝組織中TLR4蛋白表達(dá)

23、LPS模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)TLR4蛋白表達(dá)趨勢與其mRNA表達(dá)基 本一致。2h肝組織TLR4蛋白表達(dá)開始上調(diào)，于 6h達(dá)高峰（PV 0.01）,以后開始下降（PV0.05）, 24h時(shí)已接近正常對照組水平。 槐定堿高、中、低劑量組在給予 LPS后2 h的TLR4蛋白表達(dá)均與 正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至 6h三個(gè)劑量組的TLR4蛋白表達(dá)均達(dá) 高峰，但在12h時(shí)均已較LPS模型組提前下調(diào)至接近正常對照組水 平，見圖9、10。2.6血清中TNF- a含量槐定堿三個(gè)劑量處理小鼠給予 LPS后血清TNF- a水平均較同時(shí)間 點(diǎn)LPS模型組顯著降低（P V 0.01或P V 0.05 ），并在24h時(shí)均降至

24、 正常對照組水平?；倍▔A三個(gè)劑量組之間下調(diào)血清 TNF- a的效應(yīng)差異 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖11。3討論本研究用槐定堿高（12mg/kg ）、中（6mg/kg ）、低（4mg/kg ）三 個(gè)劑量預(yù)防性給予急性內(nèi)毒素血癥肝損傷模型小鼠， 動態(tài)觀察各個(gè)時(shí) 間點(diǎn)結(jié)果，均表明顯著改善了模型小鼠的一般狀況， 減輕了肝組織病 理損傷，顯著降低血清ALT含量，其作用還呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系。 說明槐定堿具有阻斷內(nèi)毒素性肝臟炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷的作用。CD14、TLR4是細(xì)胞膜表面的LPS識別受體，LPS結(jié)合脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）與mCD14后，需借助跨膜的TLR4向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信 號。內(nèi)毒素所致膿毒癥主

25、要是由于 TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游炎癥因子的失 控性釋放，引起組織損傷和器官功能紊亂所致。因此目前認(rèn)為CD14、 TLR4是內(nèi)毒素所致炎癥反應(yīng)發(fā)生的起步點(diǎn)，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有 類似于“閥門”樣的作用7-8。調(diào)節(jié)內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最上游的關(guān)鍵分 子，影響細(xì)胞對LPS的識別，使機(jī)體對LPS的炎癥反應(yīng)不至過強(qiáng)， 可能成為有效防治膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要方法。本研究結(jié)果表明槐定堿可下調(diào)肝組織CD14及TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)，因而可減少 LPS與CD14、TLR4的結(jié)合，抑制下游炎癥因子表達(dá)，減輕內(nèi)毒素 的損傷效應(yīng)。TNF- a是公認(rèn)的致炎細(xì)胞因子。已有報(bào)道膿毒癥大鼠肝臟組織TLR4mRNA及TNF- am

26、RNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)9,也就是說， TLR4 mRNA的表達(dá)增高，下游炎癥因子TNF- a合成、分泌即增多， 反之亦然。內(nèi)毒素通過激活肝臟 Kupffer細(xì)胞（KCs）釋放大量TNF- a等炎性細(xì)胞因子，不但直接損害肝細(xì)胞，還使肝臟清除內(nèi)毒素能力 下降而加重內(nèi)毒素血癥，再促進(jìn)TNF- a產(chǎn)生。TNF- a大量分泌再加重 肝細(xì)胞損傷，并成為引起后續(xù)多器官損傷的重要環(huán)節(jié)。 故本研究中選 擇檢測血清中TNF- a作為指示槐定堿調(diào)節(jié)CD14、TLR4表達(dá)，影響 下游炎癥因子表達(dá)的指標(biāo)。本研究中槐定堿三個(gè)劑量預(yù)防性給予模型 小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著降低血清TNF- a水平（P V 0.01或P V0.05），并在24h時(shí)均已達(dá)到正常對照組水平。此結(jié)果表明槐定堿下 調(diào)肝組織CD14和TLR4表達(dá)與下調(diào)血清TNF- a含量的一致性，再結(jié)合上述槐定堿阻斷內(nèi)毒素性肝臟炎癥反應(yīng)，對內(nèi)毒素血癥小鼠的保護(hù)作用，說明槐定堿減輕內(nèi)毒素性肝損傷的作用機(jī)制與其調(diào)節(jié)細(xì)胞表面 LPS的模式識別受體CD14和TLR4的表達(dá)，并進(jìn)而影響LPS的細(xì) 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制下游炎癥因子表達(dá)有關(guān)。當(dāng)然除CD14和TLR4夕卜，在LPS炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上還有其它 上游和下游受體及轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，各自都有固定的功能，槐定堿對它們的 作用還有