酶的生物改造課件

1、1 2 介介 紹紹 提提 綱綱 定向進化技術概述定向進化技術概述 定向進化技術的應用定向進化技術的應用 定向進化的方法定向進化的方法 3 l基于序列的理性設計：基于序列的理性設計：化學修飾和定點突變化學修飾和定點突變 利用已知酶分子的特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之利用已知酶分子的特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之 間關系，以及氨基酸殘基功能等信息，對酶分子進行間關系，以及氨基酸殘基功能等信息，對酶分子進行 改造；改造； l利用基因操作模擬自然進化的非理性設計：利用基因操作模擬自然進化的非理性設計：定向進化定向進化 不需要準確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機突變、基不需要準確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機突變、基

2、 因重組等方法模擬自然進化機制在體外改造酶基因，因重組等方法模擬自然進化機制在體外改造酶基因， 并定向篩選出所需突變酶；并定向篩選出所需突變酶； 4 5 突變前蛋白與木糖復合物模型突變前蛋白與木糖復合物模型 突變后蛋白與木糖復合物模型突變后蛋白與木糖復合物模型 氨基酸殘基與木糖之間距離比突變前下降，不利于體積氨基酸殘基與木糖之間距離比突變前下降，不利于體積 更大的葡萄糖底物，易于結(jié)合底物木糖，對木糖活性提高更大的葡萄糖底物，易于結(jié)合底物木糖，對木糖活性提高 6 l自然進化過程：自然進化過程： 突變突變自然選擇自然選擇遺傳后代遺傳后代 l自然進化結(jié)果：自然進化結(jié)果： 生物多樣性生物多樣性 基因多

3、樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的基因多樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的 多個基因或同一個基因（同源性）多個基因或同一個基因（同源性） l局限性：局限性：周期長，效率低周期長，效率低 ； 可控性差；可控性差； 7 基因工程技術使得人類快速篩選工業(yè)菌種基因工程技術使得人類快速篩選工業(yè)菌種 成為可能，在幾天和數(shù)月內(nèi)即可完成；還可以成為可能，在幾天和數(shù)月內(nèi)即可完成；還可以 讓人類按照自己的意愿和需要改造菌種，甚至讓人類按照自己的意愿和需要改造菌種，甚至 可以產(chǎn)生自然界中原本不存在的全新酶，以適可以產(chǎn)生自然界中原本不存在的全新酶，以適 應大工業(yè)生產(chǎn)的需要。應大工業(yè)生產(chǎn)的需要。 -哲理上哲理上, ,承認了人類

4、對蛋白質(zhì)的認知的嚴重不足承認了人類對蛋白質(zhì)的認知的嚴重不足; ; -技術上技術上, ,將大自然已經(jīng)實踐了幾億年的達爾文進化將大自然已經(jīng)實踐了幾億年的達爾文進化 原理應用于試管中原理應用于試管中, ,以以隨機突變與隨機雜交隨機突變與隨機雜交方法來改方法來改 變蛋白質(zhì)的性能變蛋白質(zhì)的性能, ,再輔以篩選來獲得優(yōu)異的變種。再輔以篩選來獲得優(yōu)異的變種。 (Frances Arnold, Caltech, 1993)(Frances Arnold, Caltech, 1993) 8 l定義：定義： 從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然或人從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然或人 為獲得）出發(fā)，經(jīng)過基因突變和

5、重組，構(gòu)建一為獲得）出發(fā)，經(jīng)過基因突變和重組，構(gòu)建一 個人工突變基因庫，通過篩選最終獲得預先期個人工突變基因庫，通過篩選最終獲得預先期 望具有某些特性的進化酶；望具有某些特性的進化酶； 所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬 于蛋白質(zhì)的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結(jié)于蛋白質(zhì)的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結(jié) 構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自 然進化機制然進化機制( (隨機突變、重組和自然選擇隨機突變、重組和自然選擇) )，在體外改，在體外改 造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶

6、。造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 9 l在待進化酶基因的在待進化酶基因的PCRPCR擴增反應中，利用擴增反應中，利用Taq DNATaq DNA聚合聚合 酶不具有酶不具有3-53-5校對功能的性質(zhì)，配合適當條件，校對功能的性質(zhì)，配合適當條件， 以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變 庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶 ( (或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)) )，從而排除其他突變體。，從而排除其他突變體。 l定向進化的基本規(guī)則是定向進化的基本規(guī)則是“”。 。前者是人為引發(fā)的，后者。前者是人為引

7、發(fā)的，后者 雖相當于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選雖相當于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選 擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個 進化過程完全是在人為控制下進行的進化過程完全是在人為控制下進行的 10 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 穩(wěn)定性 活性 有機溶液中的活性 不同的底物的利用 酸堿度 蛋白質(zhì)的表達 親和性 專一性 1234 性能 代數(shù) 達到目的達到目的 隨機突變隨機突變 隨機雜交隨機雜交 篩選篩選 目標蛋白 11 12 枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進化熱穩(wěn)定性的分子進化 13 l內(nèi)酰胺酶的活性提高了內(nèi)酰胺酶的活性提高了3

8、2,00032,000倍；倍； l半乳糖苷酶的底物特異性提高了半乳糖苷酶的底物特異性提高了10001000倍，倍， 且活性提高且活性提高6666倍；倍； l天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶對天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶對支鏈氧代氨基酸活性提支鏈氧代氨基酸活性提 高高10105 5倍且對纈氨酸的催化效率提高倍且對纈氨酸的催化效率提高2.12.110106 6倍倍 等。等。 14 lReetzReetz等等 (1997) (1997) 將脂酶水解對硝基將脂酶水解對硝基-2-2-甲基癸酯甲基癸酯 的對映體選擇性提高了的對映體選擇性提高了4040倍倍 lYouYou和和Arnold (1996) Arnold (1996) 提高了枯

9、草桿菌蛋白酶提高了枯草桿菌蛋白酶E E的的 表達水平和在有機溶劑中的活性，使酶的總活力表達水平和在有機溶劑中的活性，使酶的總活力 提高了提高了500500倍倍 lZhaoZhao和和ArnoldArnold（19981998）在保持酶活力不變的條件）在保持酶活力不變的條件 下將枯草桿菌蛋白酶下將枯草桿菌蛋白酶E E的作用溫度提高了的作用溫度提高了1717度度 15 l隨機突變隨機突變 不同的定向進化方法不同的定向進化方法 l構(gòu)建突變基因文庫構(gòu)建突變基因文庫 載體的選擇，基因重組，組建基因文庫載體的選擇，基因重組，組建基因文庫 l突變基因的篩選突變基因的篩選 平板篩選法，熒光篩選法，表面展示法平

10、板篩選法，熒光篩選法，表面展示法 16 l無性進化方法：易錯無性進化方法：易錯PCRPCR法，盒式誘變法，盒式誘變 l有性進化方法有性進化方法 1 1）DNADNA改組法（改組法（DNA Shuffling)DNA Shuffling) 2 2）體外隨機重組法（）體外隨機重組法（RPR)RPR) 3 3）交錯延伸法）交錯延伸法(StEP)(StEP) l基因家族的同源重組基因家族的同源重組 l外顯子的改組外顯子的改組 l雜合進化雜合進化 17 18 v 改變改變4 4種底物的濃度比，或降低一種種底物的濃度比，或降低一種dNTPdNTP的量（降至的量（降至5 5 -10-10）, ,加入加入dI

11、TPdITP來代替被減少的來代替被減少的dNTP. dNTP. 緩沖液中另緩沖液中另 加加0.5mmol/L Mn0.5mmol/L Mn2+ 2+ v v 添加一定濃度的錳離子；添加一定濃度的錳離子； 19 20 21 22 23 24 25 26 v 對一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行比較，以一 定的標準程序計算出各氨基酸序列的共有序列； v 人工合成同序基因后重組表達。 Martin Lehmann等（20002002）把這種方法 應用在真菌植酸酶家族設計合成了同源植酸酶基因 ，并表達出具熱穩(wěn)定性的同源植酸酶。 27 l真核基因中外顯子編碼一個折疊結(jié)構(gòu)域，故內(nèi)含真核基因中外顯子編碼一個折疊

12、結(jié)構(gòu)域，故內(nèi)含 子（轉(zhuǎn)錄后被剪切剩下外顯子）間的重組，可使子（轉(zhuǎn)錄后被剪切剩下外顯子）間的重組，可使 獨立外顯子組裝成編碼新蛋白質(zhì)的基因，可導致獨立外顯子組裝成編碼新蛋白質(zhì)的基因，可導致 蛋白質(zhì)的快速進化；蛋白質(zhì)的快速進化； l在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組， 導致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效導致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效 途徑之一。與途徑之一。與DNADNA改組不同，外顯子改組是靠同改組不同，外顯子改組是靠同 一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNADNA改組不改組不 受任何限制，發(fā)生

13、在整個基因片段上；受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上； 28 l把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分 子進行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酶子進行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酶 雜合體。雜合體。 l纖維素酶定向進化纖維素酶定向進化 29 30 31 u目標目標 根據(jù)定向進化要求，在一定的環(huán)境要求下進行篩選，從根據(jù)定向進化要求，在一定的環(huán)境要求下進行篩選，從 突變基因文庫中得到所需的突變基因。突變基因文庫中得到所需的突變基因。 u難點難點 突變庫容量大，一般達到突變庫容量大，一般達到10106 6，工作量巨大，工作量巨大 u關鍵關鍵 高通量篩選：通

14、量大，效率高高通量篩選：通量大，效率高 u方法方法 平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細胞平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細胞 表面展示法表面展示法 32 u依據(jù)細胞生長情況篩選依據(jù)細胞生長情況篩選 熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境 抗生素耐受性：抗生素濃度梯度抗生素耐受性：抗生素濃度梯度 pHpH穩(wěn)定性：穩(wěn)定性： pHpH梯度梯度 極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì) 33 u依據(jù)顏色變化篩選依據(jù)顏色變化篩選 大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體DNADNA載體（藍色）載體（藍色） 反應產(chǎn)

15、物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚反應產(chǎn)物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚 34 u依據(jù)透明圈大小篩選依據(jù)透明圈大小篩選 淀粉酶的進化：淀粉平板培養(yǎng)基淀粉酶的進化：淀粉平板培養(yǎng)基 豆鼓纖溶酶的進化：血纖維蛋白培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶的進化：血纖維蛋白培養(yǎng)基 35 u利用自身熒光激發(fā)特性利用自身熒光激發(fā)特性 生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì)生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì) u利用熒光報告基因利用熒光報告基因 辣根過氧化合物酶和單加氧酶的融合基因：辣根過氧化合物酶和單加氧酶的融合基因： 原理：萘原理：萘萘酚萘酚醌類化合物（能激發(fā)熒光）醌類化合物（能激發(fā)熒光） l綠色熒光蛋白基因

16、：獲綠色熒光蛋白基因：獲20082008年諾貝爾化學獎年諾貝爾化學獎 36 u獲獎獲獎 20082008年度諾貝爾化學獎授予日本科學家下村修、美年度諾貝爾化學獎授予日本科學家下村修、美 國科學家馬丁國科學家馬丁沙爾菲，以及美國華裔科學家錢永健。他沙爾菲，以及美國華裔科學家錢永健。他 們?nèi)艘驗樵诰G色熒光蛋白（）研究和應用方面做們?nèi)艘驗樵诰G色熒光蛋白（）研究和應用方面做 出的突出貢獻將各分得出的突出貢獻將各分得20082008年度年度1 13 3的諾貝爾化學獎獎金。的諾貝爾化學獎獎金。 37 u評論評論 生物學有些現(xiàn)象只能在打碎細胞以后才能做，所以生物學有些現(xiàn)象只能在打碎細胞以后才能做，所以

17、實際上是從實際上是從“死物死物”上來推測生物的情況。而下村修、錢上來推測生物的情況。而下村修、錢 永健和馬丁永健和馬丁沙爾菲發(fā)明的用熒光分子標記其他分子的方沙爾菲發(fā)明的用熒光分子標記其他分子的方 法，使科學家們能在活細胞、活生物上直接觀察一些生物法，使科學家們能在活細胞、活生物上直接觀察一些生物 現(xiàn)象。所以，可以說是把一些現(xiàn)象。所以，可以說是把一些“死物學死物學”變成了真正的變成了真正的 “生物學生物學 （北大饒毅） 綠熒光水母通過體內(nèi)綠色 熒光蛋白發(fā)光 科學家在線形蟲體內(nèi)植入 綠色熒光蛋白質(zhì) 38 39 FISH分析菌株 （a a）未加探針；（）未加探針；（b b）DAPIDAPI染色（染色

18、（c c）-探針雜交（探針雜交（d d） Msint-1268Msint-1268探針雜交菌株探針雜交菌株Y1Y1；（；（e e）Msint-1268Msint-1268探針雜交探針雜交M. M. trichosporium trichosporium OB3bOB3b 40 41 線粒體中表達的GFP 42 GFP在植物研究中的應用 43 u 內(nèi)涵內(nèi)涵 利用絲狀噬菌體的外膜結(jié)構(gòu)蛋白與某些特定利用絲狀噬菌體的外膜結(jié)構(gòu)蛋白與某些特定 的外源蛋白或多肽分子形成穩(wěn)定的復合物，使的外源蛋白或多肽分子形成穩(wěn)定的復合物，使 外源蛋白或多肽富集在噬菌體表面的一種分子外源蛋白或多肽富集在噬菌體表面的一種分子

19、展示技術展示技術 u 特點特點 有效性高，是前景廣闊的篩選方法有效性高，是前景廣闊的篩選方法 44 45 46 47 通過錨定在酵母細胞表面的特點蛋白質(zhì)與通過錨定在酵母細胞表面的特點蛋白質(zhì)與 某些外源蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定的化合物，使某些外源蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定的化合物，使 外源蛋白或多肽富集在酵母細胞表面的一種分外源蛋白或多肽富集在酵母細胞表面的一種分 子展示技術。子展示技術。 48 49 50 51 52 53 實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性的實例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性的定向進化定向進化 54 n高通量篩選方法的建立高通量篩選方法的建立 n生物信息學技術手段的建立生物信息學技術手段的建立

20、 n天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性的改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性的改造 研究內(nèi)容及執(zhí)行情況研究內(nèi)容及執(zhí)行情況 55 高通量篩選方法的建立高通量篩選方法的建立 基于酶聯(lián)免疫分析方法，選用醫(yī)用檢測試劑盒作基于酶聯(lián)免疫分析方法，選用醫(yī)用檢測試劑盒作 為檢測試劑，建立了快速高效的酶活性檢測方法，結(jié)為檢測試劑，建立了快速高效的酶活性檢測方法，結(jié) 合使用合使用9696孔酶標板，形成了酶的高通量篩選方法孔酶標板，形成了酶的高通量篩選方法。 建立了改進的可高通量操作的質(zhì)粒快速檢測方法，建立了改進的可高通量操作的質(zhì)?？焖贆z測方法， 改進后的質(zhì)?？鞕z工作量為原方法的改進后的質(zhì)粒快檢工作量為原方法的1/31/3左右，可用左右

21、，可用 于高通量篩選和鑒定所構(gòu)建的基因工程菌。于高通量篩選和鑒定所構(gòu)建的基因工程菌。 56 生物催化的數(shù)據(jù)整合和信息分析生物催化的數(shù)據(jù)整合和信息分析 峰值運算速度達峰值運算速度達30003000億次億次/ /秒的集群系統(tǒng)秒的集群系統(tǒng) 基因表達 蛋白質(zhì)表達 蛋白質(zhì)-DNA相互作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 基因和其他功能相互作用 蛋白質(zhì)定位 網(wǎng)絡調(diào)節(jié) 功能注解 生物信息學技術手段的建立生物信息學技術手段的建立 57 58 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用 酶法制備酶法制備L L苯丙氨酸的關鍵酶苯丙氨酸的關鍵酶 ； u L-苯丙氨酸的主要用途 氨基酸輸液 L-苯丙氨酸是人體八大必須氨基酸之一，是 氨基酸輸液的主要成份； 甜味劑的合成 由L-苯丙氨酸和L天冬氨酸合成的阿斯巴甜是 二十世紀九十年代以來最受關注的非糖型肽類甜味 劑，形成了對L-苯丙氨酸的強烈需求； 59 肉桂酸酶法肉桂酸酶法