幽門螺桿菌感染動物模型述評

1、 幽門螺桿菌感染動物模型述評 作者：郭學(xué)軍 張永斌 鄒移海 【關(guān)鍵詞】 螺桿菌感染；,疾病模型,動物；,綜述,指導(dǎo)性 摘要：綜述了幽門螺桿菌（h.pylori）感染動物模型的建立方法，并對幾種重要的hp感染動物模型作了述評。認(rèn)為目前常規(guī)用于研究hp感染的實驗動物有小鼠、大鼠、雪貂、蒙古沙鼠、豚鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠及小型豬等，而小鼠由于遺傳背景明確，個體差異小，有很多品種品系，容易飼養(yǎng)繁殖且費用低廉，并且與小鼠相關(guān)的鼠免疫球蛋白、細(xì)胞類型、細(xì)胞因子等試劑較容易購買，可以更好地進(jìn)行hp感染疫苗的研究，所以目前小鼠在hp感染的研究中是應(yīng)用較多的動物。但小鼠不適合hp感染的并發(fā)癥（如潰瘍、腫瘤等）的研究。h

2、p感染的動物模型在中醫(yī)藥研究中主要用于脾虛證hp感染的研究、中藥藥理及治療hp感染中藥的篩選。 關(guān)鍵詞：螺桿菌感染； 疾病模型，動物； 綜述，指導(dǎo)性 1983年，澳大利亞學(xué)者marshall和warren從慢性胃炎患者的胃竇粘液層及上皮細(xì)胞中首次分離出幽門螺桿菌（helicobacter pylori，hp），并指出該菌可能是慢性胃炎的病原菌。1990年8月的悉尼國際胃腸會議肯定了hp與慢性胃炎（cg）和消化性潰瘍（pu）的關(guān)系1。近年來的研究表明，hp與胃癌的發(fā)生也有密切的關(guān)系。因此，復(fù)制幽門螺桿菌感染的實驗動物模型，對于研究預(yù)防和治療hp感染的方法及檢測hp疫苗有效性和安全性等都有十分重要

3、的意義。 由于單一的動物模型不能復(fù)制出所有hp感染后的表現(xiàn)，所以需要不同的動物模型來研究疾病的各種特性，并且應(yīng)該依據(jù)所研究疾病的內(nèi)容來選擇動物模型。在選擇動物做模型時，應(yīng)考慮以下幾個因素：（1）動物的遺傳特性：hp感染不同的人群后引起的臨床表現(xiàn)各不相同，提示宿主基因型與疾病的表現(xiàn)型之間可能存在一定的聯(lián)系。（2）動物的可用性：有些研究需要的動物種類特殊，如近交系動物、遺傳突變型動物、免疫缺陷型動物等，這些特殊品系的動物能否獲得對實驗成功至關(guān)重要。（3）動物的飼養(yǎng)：包括飼養(yǎng)費用、飼養(yǎng)的難易程度、動物的麻醉、外科手術(shù)、組織樣本的處理等。（4）動物的數(shù)量：每項研究必須保證有一定的動物數(shù)才具有統(tǒng)計學(xué)意義

4、，否則結(jié)論是不可靠的。（5）動物的hp接種量：每種動物對hp的敏感性不同，所需的hp接種量也不同。 常規(guī)用于研究hp感染的實驗動物包括小鼠、大鼠、雪貂、蒙古沙鼠、豚鼠、悉生豬等，最近，也有使用轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠的報道。以下對hp感染動物模型的建立方法、幾種重要的hp感染動物模型及hp感染動物模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用作一綜述。 1 建立hp感染動物模型的方法 11 hp菌株及培養(yǎng)用于建立hp感染動物模型的菌株為hp國際標(biāo)準(zhǔn)菌株sydney strain 1（ss1）。ss1含有細(xì)胞毒素相關(guān)基因（caga）和空泡形成毒基因（vaca）2，可采用固體或液體培養(yǎng)基，添加50?mg/l脫纖維凍融羊

5、血及萬古霉素10?mg/l，多粘菌素b?2?500?u/l，抗菌增效劑5?mg/l，微需氧條件（體積分?jǐn)?shù)為5%?o2、8%?co2、80%?n2）37下孵育72?h3。 12 動物接種的方法小動物如大、小鼠一般采用灌胃法。將培養(yǎng)后的菌體調(diào)整到適宜的濃度，禁食禁水12?h后，先灌胃05?ml nahco3或02?ml消炎痛（均有益于hp的定植），再灌胃菌液，灌胃后繼續(xù)禁食禁水4?h，23?d灌胃1次，連續(xù)5次，對照組灌胃生理鹽水4。大動物如感染hp的恒河猴可出現(xiàn)持續(xù)的感染、胃炎及特異性抗體水平的升高，并能對適當(dāng)?shù)闹委熥鞒龇磻?yīng)，因此自然感染hp的恒河猴亦可作為人類hp感染的動物模型。 13 感染動

6、物的鑒定末次灌胃后，可分別于第2、4、6、8周處死動物（大、小鼠），處死前斷食斷水，取胃粘膜組織，做病理切片、粘膜涂片并分離培養(yǎng)。分離的hp經(jīng)三酶（尿素酶、過氧化氫酶、氧化酶）實驗和革蘭氏染色鏡檢確定是否為ss14。 2 幾種重要的hp感染的動物模型 21 hp小鼠模型1997年，lee等2鑒定的hp悉尼株（ss1）被認(rèn)為是小鼠接種的首選菌株，接種c57bl/6小鼠后，胃粘膜定植時間可達(dá)8個月以上，定植后緩慢出現(xiàn)慢性活動性胃炎、嚴(yán)重胃粘膜萎縮等病理變化，而56日齡的cd1小乳鼠接種ss1菌株后，僅獲得24?h以上無差別定植。秦敏4的實驗證明，ss1在spf級的km鼠上定植時間可達(dá)26周，并確定

7、12周齡小鼠感染的較適菌量為5108，與人類的hp感染病變具有相似性。小鼠的遺傳背景明確，個體差異小，有很多品種品系，容易飼養(yǎng)繁殖，費用低廉，與小鼠相關(guān)的鼠免疫球蛋白、細(xì)胞類型、細(xì)胞因子等試劑較容易購買，可以更好地進(jìn)行hp感染疫苗的研究，所以目前小鼠在hp感染的研究中是應(yīng)用較多的動物。但小鼠不適合hp感染的并發(fā)癥（如潰瘍、腫瘤等）的研究。 22 hp大鼠模型常用品系為wistar、sd大鼠。hp在大鼠胃粘膜中群集繁殖力差，只有在大鼠胃粘膜預(yù)先存在損傷時，hp才能感染并引起炎癥反應(yīng)5，因此，找到適合的感染菌株并增加模型的病理變化程度才是解決大鼠感染模型的關(guān)鍵。且長期灌胃hp可誘導(dǎo)出高比例的腺胃癌

8、，影響了乙酸性胃潰瘍大鼠的潰瘍自然愈合過程6。hp大鼠模型對于研究hp與胃癌的關(guān)系，篩選抗菌藥物，研究hp的致病機理及潰瘍的防治等具有重要的輔助作用。 23 hp雪貂模型雪貂胃的解剖和生理特點與人相似。雪貂螺桿菌（hm）引起雪貂胃炎與hp感染引起人的胃炎都屬于浸潤性胃竇胃炎、胃體多灶性萎縮性胃炎和淺表性胃炎，而多灶性萎縮性胃炎屬于癌前病變。采用hp尿素酶和霍亂毒素（ct）佐劑制成口服疫苗，對感染hm的雪貂進(jìn)行長期免疫治療后，有一定的治療效果。雪貂對癌誘導(dǎo)劑敏感，可口服給藥，是研究hp致癌機制、藥物治療與篩選、療效評價和免疫治療效果的有價值的模型7。 24 hp蒙古沙鼠模型1981年日本學(xué)者yo

9、kota等首先用caga陽性hp菌株人工感染雜交蒙古沙鼠品系，可使沙鼠出現(xiàn)胃炎癥狀，癥狀比c57bl/6、balb/c等品系的小鼠要明顯得多8。sawada等9證明，用hp人工感染沙鼠后所觀察到的抗體應(yīng)答變化與人hp感染后的抗體應(yīng)答變化相同，caga陽性菌對動物的感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于caga陰性菌。hp感染沙鼠后，依次出現(xiàn)急性胃炎、慢性胃炎、十二指腸潰瘍，類似人感染hp后組織的病理演變過程。而且沙鼠的胃容量比小鼠大，適宜直接進(jìn)行組織學(xué)檢查，因此雖然沙鼠存在好斗、繁殖困難、數(shù)量少等缺點，但仍不失為hp研究中具有較好發(fā)展前景的動物模型。 25 hp豚鼠模型豚鼠體內(nèi)不能合成維生素c。而維生素c的重要成分抗

10、壞血酸可抑制具有強烈致癌作用的亞硝胺的形成。另外，從免疫學(xué)角度講，豚鼠的胃能分泌il8同源物，而hp重要的致病作用特性之一就是誘導(dǎo)胃組織分泌il8，誘發(fā)以嗜中性白細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤性胃炎病變10。因此，hp人工感染豚鼠模型在模擬人hp感染時更接近人的自然感染狀態(tài)，對于研究人感染hp后相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展以及研究維生素c在其中的作用是一種理想的動物模型。缺點是豚鼠對飼養(yǎng)環(huán)境要求很高，不易飼養(yǎng)和繁殖，死亡率較高。 26 轉(zhuǎn)基因動物模型1995年falk等用fvb/n轉(zhuǎn)基因小鼠從分子水平探討hp的致病機制11。syder用缺乏壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠研究hp感染與壁細(xì)胞泌酸作用的關(guān)系12。lewis抗原是

11、hp的主要致病原因之一，hp一旦穿過粘液層，其表達(dá)的粘附蛋白baba就會與胃上皮表達(dá)的lewis血型抗原結(jié)合，使hp緊緊地粘附在上皮細(xì)胞上而致病。表達(dá)人類lewis抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠比較，hp都能定植，但轉(zhuǎn)基因小鼠能產(chǎn)生抗壁細(xì)胞的自身抗體，破壞壁細(xì)胞，使胃粘膜萎縮而發(fā)生萎縮性胃炎，能用來證明粘附蛋白的致病性13。 27 小型豬動物模型eaton14在1989年首次建立了悉生豬（無菌豬）hp模型，但技術(shù)復(fù)雜，價格昂貴，推廣困難。1997年孫桂華15等用中國1號小型豬剖腹取胎所得到的悉生乳豬成功地建立了hp感染的動物模型，找到了一種比較理想、經(jīng)濟的對hp易感的動物。實驗證明，小型豬hp感

12、染誘導(dǎo)的慢性胃炎類似于兒童自然感染hp后的胃炎，持續(xù)時間可達(dá)22個月以上。此外，小型豬對hp抗生素治療比人類敏感，因此可用于治療hp抗生素的療效鑒定及藥物評價。 3 hp感染動物模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用 31 用于脾虛證hp感染的研究中醫(yī)理論認(rèn)為：hp屬“邪氣”，且具有“毒”的性質(zhì)，“邪之所湊，其氣必虛”，“百病皆由脾胃衰而生也”。在邪氣入侵、脾胃虛弱基礎(chǔ)上形成的氣滯、血瘀、郁熱、濕阻等病理變化為hp附著、繁殖、致病提供了客觀條件。因此，復(fù)制脾虛證hp感染的動物模型，從理論上說是可行的。通常的方法是采用寒冷、饑餓或大黃等藥物先造成動物脾虛，再灌胃hp菌液。如厲蘭娜16的脾虛證大鼠hp感染模型、

13、楊俊17的脾虛蒙古沙土鼠hp感染模型等。 脾虛證hp感染動物模型復(fù)制成敗的關(guān)鍵在于“脾虛”癥狀的確定。但在中醫(yī)證候動物模型的研究領(lǐng)域，“脾虛癥狀”一直沒有規(guī)范化的指標(biāo)18，目前只是把動物出現(xiàn)豎毛、拱背、活動減少、便溏等癥狀認(rèn)為是“脾虛”，無法知道動物的具體感受（主述）是什么，而其他因素是否也可導(dǎo)致動物出現(xiàn)上述癥狀，我們無從知道。因此，對脾虛證hp感染動物模型標(biāo)準(zhǔn)化的研究還需進(jìn)一步深入。 32 用于中藥研究hp感染的動物模型可用于中藥的研究。中藥抗hp感染既可以直接抑菌，還有可能通過整體調(diào)節(jié)機體免疫力來抗hp。劉波19對5味中藥、姜成20對13味中藥的實驗證明，黃連的殺菌效果最強，當(dāng)藥物濃度為5

14、0?mgml-1時，殺菌率達(dá)998%。王印光等21發(fā)現(xiàn)hp感染陽性率在脾胃濕熱、脾胃不和、脾胃陰虛等證中出現(xiàn)遞減的規(guī)律。證明在hp相關(guān)性消化性潰瘍中濕熱證占多數(shù)。 中醫(yī)從整體出發(fā)，通過多環(huán)節(jié)、多途徑治療hp感染。近年來，hp相關(guān)性胃病的中醫(yī)藥治療研究取得很大進(jìn)展，針對hp感染的單方及復(fù)方進(jìn)行了大量的實驗及臨床研究。但該方面研究多注重于中藥對hp轉(zhuǎn)陰和病理形態(tài)的改善，對hp感染和胃酸分泌的關(guān)系及對hp感染者的餐后胃泌素顯著增高等方面的研究較少，從細(xì)胞分子水平深入研究中醫(yī)藥對hp毒力及形態(tài)學(xué)變異的影響則更少，還需進(jìn)一步探索。 參考文獻(xiàn)： 1李健，吳麗莉，馮常煒，等幽門螺桿菌發(fā)現(xiàn)簡史j中華醫(yī)史雜志，

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