病毒感染的檢測方法與防治原則

1、 病毒感染的實驗室檢查方法病毒感染的實驗室檢查方法 直接病毒診斷 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定 病毒感染的血清學診斷1.直接病毒診斷：直接病毒診斷： 細胞病理學方法細胞病理學方法:光鏡光鏡下檢查病變組織或脫落細胞中的特異性病毒下檢查病變組織或脫落細胞中的特異性病毒 包涵體包涵體，DNA病毒在核內(nèi)裝配產(chǎn)生核內(nèi)包涵體，病毒在核內(nèi)裝配產(chǎn)生核內(nèi)包涵體， RNA病毒在胞漿裝配產(chǎn)生胞漿包涵體病毒在胞漿裝配產(chǎn)生胞漿包涵體 電子顯微鏡法電子顯微鏡法:負染法（重金屬染液，電子光束通過低電子密負染法（重金屬染液，電子光束通過低電子密度的病毒顆粒但不能通過金屬背景，病毒顆粒明亮清晰，負反度的病毒顆粒但不能通過金屬背景，病毒

2、顆粒明亮清晰，負反差）、超薄切片法、差）、超薄切片法、immune electron microscope（抗體處理病毒（抗體處理病毒顆粒形成病毒抗體復合物凝聚成團，高速離心負染后觀察）顆粒形成病毒抗體復合物凝聚成團，高速離心負染后觀察） 病毒抗原檢測病毒抗原檢測:胞內(nèi)病毒抗原的檢測：胞內(nèi)病毒抗原的檢測：免疫熒光技術免疫熒光技術 、 免疫酶技術免疫酶技術 胞外（游離）病毒抗原的檢測：胞外（游離）病毒抗原的檢測：ELISA 病毒核酸檢測：病毒核酸檢測：核酸雜交技術核酸雜交技術 斑點分子雜交法、斑點分子雜交法、Southern印跡法、印跡法、 原位分子雜交法、原位分子雜交法、Northern印跡法

3、印跡法 聚合酶鏈反應技術（聚合酶鏈反應技術（PCR）（1）標本處理：）標本處理：組織、細胞：組織、細胞：粗提將沉渣、細菌、真菌等去除，釋粗提將沉渣、細菌、真菌等去除，釋 放病毒，有的還需要提純濃縮放病毒，有的還需要提純濃縮體液：體液：腦脊液、胸腔液、水泡液、尿液等直接接種培腦脊液、胸腔液、水泡液、尿液等直接接種培 養(yǎng)管養(yǎng)管拭子：拭子：咽、眼、鼻拭子直接放入含有抗生素的培養(yǎng)管咽、眼、鼻拭子直接放入含有抗生素的培養(yǎng)管 2.病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)與鑒定1 動物接種動物接種2 雞胚接種雞胚接種 雞胚對多種病毒敏感，羊膜腔、尿囊腔、雞胚對多種病毒敏感，羊膜腔、尿囊腔、 卵黃囊、絨毛尿囊膜卵黃

4、囊、絨毛尿囊膜3 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng) 傳110代二倍體細胞培養(yǎng)傳50100代傳代細胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法三大培養(yǎng)方法（2）分離培養(yǎng)方法）分離培養(yǎng)方法器官培養(yǎng)組織培養(yǎng) 細胞培養(yǎng) 常用的細胞培養(yǎng)常用的細胞培養(yǎng)病毒在細胞內(nèi)增殖的指標病毒在細胞內(nèi)增殖的指標正常細胞正常細胞病變細胞病變細胞（3）病毒的鑒定）病毒的鑒定流感病毒和某些副粘病毒感染細流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后胞后2448小時，在細胞膜上出小時，在細胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附動物及現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附動物及人的紅細胞人的紅細胞 病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起 50% 發(fā)生死發(fā)生死亡或病變的最小

5、病毒量亡或病變的最小病毒量 病毒樣本作病毒樣本作10倍連續(xù)稀釋倍連續(xù)稀釋 病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶（瓊脂限制病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶（瓊脂限制病毒的擴散），稱蝕斑。一個蝕斑是由一個感染性病毒體病毒的擴散），稱蝕斑。一個蝕斑是由一個感染性病毒體復制增殖后形成的，稱蝕斑形成單位（復制增殖后形成的，稱蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU），病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕），病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕斑形成單位來表示斑形成單位來表示 病毒的血清學診斷病毒的血清學診斷 最有特異性最有特異性中和試驗中和試驗補體結(jié)合試驗補體結(jié)合試驗血凝抑制試驗

6、血凝抑制試驗免疫擴散等免疫擴散等免疫標記技術免疫標記技術流感病毒與患者血清中抗流感病毒與患者血清中抗HA抗體（中和抗體）結(jié)合抗體（中和抗體）結(jié)合后，紅細胞表面的糖蛋白受體就不能與后，紅細胞表面的糖蛋白受體就不能與HA結(jié)合，血結(jié)合，血凝現(xiàn)象被抑制。雙份血清同時做血凝抑制試驗，恢復凝現(xiàn)象被抑制。雙份血清同時做血凝抑制試驗，恢復期抗體效價比急性期高期抗體效價比急性期高4倍或以上可確診倍或以上可確診Diagnosis Strategy for Viral Infection ELISA for HIV antibody 1、人工被動免疫、人工被動免疫（1）天然被動免疫：通過胎盤的）天然被動免疫：通過胎

7、盤的IgG和初乳中的和初乳中的IgA；（2）人工被動免疫：）人工被動免疫： 1）人胎盤或人血中提取出的免疫球蛋（）人胎盤或人血中提取出的免疫球蛋（IgG）；）； 2）康復期病人的血清或高效價免疫血清（）康復期病人的血清或高效價免疫血清（SARS 病人恢復期血清）病人恢復期血清）病毒感染的防治病毒感染的防治人工主動免疫人工主動免疫滅活疫苗：滅活疫苗：乙腦疫苗乙腦疫苗 狂犬病疫苗狂犬病疫苗 流感滅活疫苗流感滅活疫苗HAV，HBV疫苗等疫苗等減毒活疫苗：減毒活疫苗：脊髓灰質(zhì)炎疫苗脊髓灰質(zhì)炎疫苗麻疹疫苗麻疹疫苗腮腺炎疫苗腮腺炎疫苗風疹疫苗風疹疫苗HAV疫苗疫苗亞單位疫苗：亞單位疫苗：流感疫苗、乙肝疫苗

8、流感疫苗、乙肝疫苗人工主動免疫病毒疫苗 減毒活疫苗（減毒活疫苗（attenuated live vaccine） 滅活疫苗（滅活疫苗（inactivated vaccine） 亞單位疫苗（亞單位疫苗（subunit vaccine） 基因工程疫苗（基因工程疫苗（gene engineered vaccine） 基因工程亞單位疫苗（基因工程亞單位疫苗（gene engineered subunit vaccine） 基因工程載體疫苗（基因工程載體疫苗（gene engineered vectored vaccine） 基因缺失活疫苗（基因缺失活疫苗（gene deleted live vacci

9、ne） 核酸疫苗（核酸疫苗（nucleic acid vaccine）。）。 合成肽疫苗（合成肽疫苗（synthetic peptide vaccine） 抗獨特型抗體疫苗（抗獨特型抗體疫苗（anti-idiotype vaccine）活疫苗（live vaccine） 減毒活疫苗減毒活疫苗 基于基因工程技術的新型活疫苗基于基因工程技術的新型活疫苗 遺傳重組活疫苗遺傳重組活疫苗 基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗 載體活疫苗載體活疫苗減毒活疫苗(attenuated live vaccine) 自然或人工選擇法（如自然或人工選擇法（如Ts株）株） 所篩選的對人低毒所篩選的對人低毒或無毒的變異株，如脊

10、灰、流感、麻疹的減毒株或無毒的變異株，如脊灰、流感、麻疹的減毒株 優(yōu)點：模擬自然感染，免疫效果好，局部優(yōu)點：模擬自然感染，免疫效果好，局部IgA。 理論上的缺點，實際工作中少見理論上的缺點，實際工作中少見 變異株可能回復到有毒力的野生株變異株可能回復到有毒力的野生株 如果機體免疫缺陷，減毒株仍可能引起感染或并發(fā)癥如果機體免疫缺陷，減毒株仍可能引起感染或并發(fā)癥 可能激活機體內(nèi)其它病毒的感染可能激活機體內(nèi)其它病毒的感染 減毒活苗可能引起持續(xù)感染減毒活苗可能引起持續(xù)感染 成功的范例：成功的范例：1961年我國應用脊灰疫苗，脊灰發(fā)年我國應用脊灰疫苗，脊灰發(fā)病率大幅度下降。病率大幅度下降。1980年天花

11、病毒滅絕年天花病毒滅絕遺傳重組活疫苗 將野毒株表面抗原基因與弱毒株其他基將野毒株表面抗原基因與弱毒株其他基因組合而獲得減毒活病毒因組合而獲得減毒活病毒 適用于基因組分節(jié)段雙鏈適用于基因組分節(jié)段雙鏈RNA病毒，如病毒，如流感病毒、輪狀病毒等流感病毒、輪狀病毒等基因缺失活疫苗 利用利用DNA重組技術，定向缺失病毒基重組技術，定向缺失病毒基因組的某一區(qū)段，使病毒喪失毒力而因組的某一區(qū)段，使病毒喪失毒力而保留增殖能力和免疫原性保留增殖能力和免疫原性 優(yōu)點：疫苗株的遺傳背景清楚，不易優(yōu)點：疫苗株的遺傳背景清楚，不易突變回到野毒株突變回到野毒株載體活疫苗 利用利用DNA重組技術，將編碼病毒抗原的重組技術，

12、將編碼病毒抗原的基因插入到另一無毒力的載體病毒，使基因插入到另一無毒力的載體病毒，使之高效表達之高效表達 易建立多價疫苗易建立多價疫苗 載體病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、載體病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、HSV-1滅活疫菌（inactivated vaccine） 滅活全病毒疫苗滅活全病毒疫苗 亞單位疫苗亞單位疫苗 合成肽病毒疫苗合成肽病毒疫苗 基因工程疫苗基因工程疫苗 獨特型病毒疫苗獨特型病毒疫苗 核酸疫苗核酸疫苗滅活全病毒疫苗 物理或化學方法滅活病毒。適用物理或化學方法滅活病毒。適用烈性或易變異烈性或易變異病毒如乙腦病毒、狂犬病病毒、流感病毒，常病毒如乙腦病毒、狂犬病病毒、流感病毒，常用用

13、甲醛甲醛液作為滅活劑液作為滅活劑 優(yōu)點：生產(chǎn)簡單、易保存運輸優(yōu)點：生產(chǎn)簡單、易保存運輸 缺點缺點 需要大量培養(yǎng)病毒，成本高需要大量培養(yǎng)病毒，成本高 無局部抗體，不激活無局部抗體，不激活CTL，可激活，可激活TDTH 甲醛滅活的麻疹病毒和甲醛滅活的麻疹病毒和RSV疫苗可加重疾病，機制疫苗可加重疾病，機制不詳不詳亞單位疫苗（subunit vaccine） 種類種類 化學方法制備：如化學方法制備：如HBsAg和流感和流感HA 基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗 優(yōu)點優(yōu)點 不含病毒核酸，僅有能誘導中和抗體的衣殼不含病毒核酸，僅有能誘導中和抗體的衣殼蛋白或包膜表面抗原。蛋白或包膜表面抗原。免除了回復

14、突變和交免除了回復突變和交叉復活的可能叉復活的可能 消除腫瘤病毒的潛在的致癌作用消除腫瘤病毒的潛在的致癌作用合成肽病毒疫苗 人工合成病毒保護性抗原決定簇肽段人工合成病毒保護性抗原決定簇肽段 優(yōu)點優(yōu)點 制備容易，可大量生產(chǎn)，易保存，副作用少制備容易，可大量生產(chǎn)，易保存，副作用少 理論與實踐上的缺點理論與實踐上的缺點 合成肽不具有高級結(jié)構(gòu)，免疫原性弱，使用合成肽不具有高級結(jié)構(gòu)，免疫原性弱，使用時需要加佐劑。時需要加佐劑。 不同肽免疫活性有差異。不同肽免疫活性有差異。 部分肽只激發(fā)部分肽只激發(fā)B細胞表位，缺乏激發(fā)細胞表位，缺乏激發(fā)TH細胞細胞的表位的表位基因工程疫苗 利用利用DNA重組技術制備的生物

15、制品。如將編重組技術制備的生物制品。如將編碼病毒特異抗原的基因用適當?shù)妮d體將此基碼病毒特異抗原的基因用適當?shù)妮d體將此基因帶入大腸桿菌或真核細胞，使之表達并純因帶入大腸桿菌或真核細胞，使之表達并純化表達產(chǎn)物化表達產(chǎn)物 研發(fā)成本高，生產(chǎn)成本低，下游工程復雜研發(fā)成本高，生產(chǎn)成本低，下游工程復雜核酸疫苗 將病毒基因?qū)雽⒉《净驅(qū)隓NA載體（通常是帶有真載體（通常是帶有真核表達調(diào)控基因的質(zhì)?；虿《荆瑢⒅亟M核表達調(diào)控基因的質(zhì)?；虿《荆?，將重組DNA導入動物或人體，重組導入動物或人體，重組DNA可以在細可以在細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達出目的蛋白胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達出目的蛋白 優(yōu)點：同時刺激產(chǎn)生體液和細

16、胞免疫，能優(yōu)點：同時刺激產(chǎn)生體液和細胞免疫，能誘導誘導CTL活性，易生產(chǎn)，易保存活性，易生產(chǎn)，易保存 理論上缺點：安全性尚待考察理論上缺點：安全性尚待考察 目前僅在實驗研究中，尚未投放市場目前僅在實驗研究中，尚未投放市場獨特型病毒疫苗（idiotype vaccine） 基于基于Jerne的免疫網(wǎng)絡學說，內(nèi)影像組抗體中含有與抗的免疫網(wǎng)絡學說，內(nèi)影像組抗體中含有與抗原一致的表位序列，又稱抗獨特型抗體疫苗。將病毒抗原一致的表位序列，又稱抗獨特型抗體疫苗。將病毒抗原接種動物，產(chǎn)生原接種動物，產(chǎn)生Ab1；Ab1接種另一動物，產(chǎn)生接種另一動物，產(chǎn)生Ab2； Ab2接種人產(chǎn)生接種人產(chǎn)生Ab3 Ab1與與Ab2互補，互補， Ab2與與Ab3互互補，補，Ab3在結(jié)構(gòu)上與在結(jié)構(gòu)上與Ab1相似，相似，