《基因治療》演示PPT

1、1 第八節(jié)第八節(jié) 基因治療與基因診斷基因治療與基因診斷 2 一、基因治療的概念一、基因治療的概念 基因治療（gene therapy）就是向有功能 缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償 其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。 3 Gene Therapy Principles 4 原位修復(fù)(基因修復(fù)）：對(duì)有缺陷的基因在原來 位置上進(jìn)行修復(fù)，使該基因恢復(fù)正常 基因替代療法：治療策略是切除發(fā)生缺陷的基 因，再轉(zhuǎn)入有功能的正常 基因增強(qiáng)：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，目的基因 的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能 基因抑制：導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻斷有害基因的表達(dá) 二、基因治療的策略二、基因治療

2、的策略 5 基因治療的前景分析 基因治療：降低成本 理論上所有治療基因（包括非分泌蛋白）均可開展基因治療 基因治療：技術(shù)上難度大，有效性和安全性要求高 基因治療：僅10余年歷史，技術(shù)不夠成熟，風(fēng)險(xiǎn)大 6 三、基因治療的兩大途徑 7 1體細(xì)胞基因治療：把外源基因?qū)牖颊叩捏w細(xì)胞， 以治療或預(yù)防基因接納者個(gè)人的疾病，只有特定的個(gè) 體受益，但不能遺傳給后代。 2種系細(xì)胞的基因治療：在生殖細(xì)胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正?；蚧蛐迯?fù)缺陷基因 以校正遺傳缺陷。引入的外源基因（整合到基因組） 能遺傳給后代。 優(yōu)點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)移到機(jī)體的所有組織并遺傳給后代。 目前尚未開展，一是涉及倫理學(xué)問題；二

3、是技術(shù)困難 （診斷困難、引起新的插入突變的危險(xiǎn)） 8 又稱間接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，基本途徑是： 個(gè)體供者組織或細(xì)胞移植物 組織培養(yǎng) 治療基因或標(biāo)記基因培養(yǎng)細(xì)胞 選擇或富集轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 I.轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或受試病人的靶器官 1.通過回體（ex vivo）基因轉(zhuǎn)移的治療途徑 9 又稱直接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，將插入目的基因的表達(dá)載體直接導(dǎo)入 體內(nèi)的方法。基本途徑是： 含治療基因表達(dá)載體直接注射/與介質(zhì)結(jié)合后直接注射或用基 因槍導(dǎo)入體內(nèi) 包裝細(xì)胞系中包裝好的復(fù)制缺陷型病毒顆粒 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便省時(shí)省力，能很快觀察到外源基因的表達(dá)及作用 缺點(diǎn)：DNA在體內(nèi)不易進(jìn)入細(xì)胞，易被降解，以病毒顆粒的形 式導(dǎo)入人體則易引起免疫反應(yīng)

4、和被補(bǔ)體滅活。 2. 通過體內(nèi)（in vivo）基因轉(zhuǎn)移的途徑 10 四、基因轉(zhuǎn)移的方法 病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺病毒載體 單純皰疹病毒載體 非生物學(xué)方法 直接注射 脂質(zhì)體 受體介導(dǎo) 11 （一）基因治療的病毒載體 應(yīng)該具有的基本條件： 攜帶外源基因并能組裝成病毒顆粒 介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá) I.對(duì)機(jī)體沒有致病能力 12 充分了解載體病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能（編碼區(qū)/非編 碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白/非結(jié)構(gòu)蛋白、必須基因/非必須基因、 包裝容量等） 外源基因插入病毒基因組的非必須區(qū) 致病基因（裂解細(xì)胞、癌基因使細(xì)胞轉(zhuǎn)化）刪除 插入外源基因長(zhǎng)度受限刪除非必須基因/必須基因 （由輔助病毒或宿主細(xì)胞提供該基

5、因的功能） 病毒載體的產(chǎn)生 13 反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus, RV)載體 優(yōu)點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移的效率 高，細(xì)胞宿主范圍較廣 泛，DNA整合效率高于 其它病毒載體等。 缺點(diǎn)：只感染分裂狀態(tài) 的細(xì)胞，載體容量?。?8kb），目的基因在 未分化的細(xì)胞中常丟失 ，隨機(jī)整合潛在致癌的 危險(xiǎn)。 14 優(yōu)點(diǎn)： 安全，不整合到染色體上 不需要宿主細(xì)胞的分裂增殖就能進(jìn)入細(xì)胞 缺點(diǎn)： 免疫原性較強(qiáng) 不能整合到宿主細(xì)胞基因組使得外源基因 表達(dá)持續(xù)時(shí)間有限 I.插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 腺病毒(AV)載體 15 優(yōu)點(diǎn)： 嗜神經(jīng)組織 能插入較長(zhǎng)外源基因（20kb或略長(zhǎng)些 缺點(diǎn)： 較大的基因組使得遺傳操作

6、較難進(jìn)行 不整合到宿主細(xì)胞基因組，表達(dá)持續(xù)的時(shí)間 受限 I.包含大量功能基因，安全水平尚待進(jìn)一步觀 察 皰疹病毒（HSV）載體 16 優(yōu)點(diǎn)： 安全，痘病毒在人類歷史上已經(jīng)廣泛應(yīng)用 外源基因的容量可達(dá)30 kb 適用廣泛的細(xì)胞型（可感染非分裂的細(xì)胞） 缺點(diǎn)： 不整合入細(xì)胞基因組，故外源基因表達(dá)的時(shí)間不能持久 載體過大，受免疫系統(tǒng)的影響也較大。 痘病毒（Poxvirus, PV）載體 17 （二）非病毒載體 1. 裸裸DNA 2. 脂質(zhì)體脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物復(fù)合物 3. 多聚物多聚物/DNA復(fù)合物復(fù)合物 4. 其它方法其它方法 18 1. 裸DNA 方法：直接注射或基因槍轟擊 溶液類型對(duì)基因表達(dá)有

7、影響： 重組DNA可貯存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理鹽水或PBS 19 2. 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物 形成高效包裝DNA的人造膜，與細(xì)胞膜極為相似。 形成脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球，與細(xì)胞融合后被 細(xì)胞內(nèi)吞。 20 無毒性和免疫原性 可生物降解，不會(huì)在體內(nèi)堆積 可制成球狀(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可帶有不同的電荷 具有不同的膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適 應(yīng)不同的生理要求 人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn) 21 陽離子多聚體 DNA帶負(fù)電 細(xì)胞表面帶負(fù)電 3. 多聚物/DNA復(fù)合物 22 受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 磷酸鈣共沉淀法 電穿孔法 顯微注射法 4.其它方法

8、23 轉(zhuǎn)入功能基因（單基因遺傳?。?血友病B 薛京倫等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將IX因 子的cDNA至血友病B患者的皮膚成纖維細(xì)胞中， 再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表達(dá)明 顯增高，癥狀得到改善 重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID） 五、基因治療的應(yīng)用 24 n腺苷脫氨酶（腺苷脫氨酶（ADAADA）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的 致死性疾病，患者由于致死性疾病，患者由于ADAADA缺乏導(dǎo)致脫苷腺氨酸增多，缺乏導(dǎo)致脫苷腺氨酸增多， 改變了甲基化能力，致使淋巴細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致改變了甲基化能力，致使淋巴細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致 免疫缺陷免疫缺陷 n19901990年，首次將年，首次將AD

9、AADA轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因T T淋巴細(xì)胞注射到淋巴細(xì)胞注射到 人體骨髓組織人體骨髓組織（患有腺苷脫氨酶（患有腺苷脫氨酶（ADAADA） 缺乏癥的缺乏癥的4 4歲兒童歲兒童） ，治療SCID 25 基因治療基因治療SCID的過程的過程 26 轉(zhuǎn)基因治療的問題與危險(xiǎn)性轉(zhuǎn)基因治療的問題與危險(xiǎn)性 有效的目的基因過少；有效的目的基因過少； 安全性安全性: :導(dǎo)入的基因缺乏調(diào)導(dǎo)入的基因缺乏調(diào) 控手段；控手段； 有效性和穩(wěn)定性：有效性和穩(wěn)定性：缺少高效缺少高效 和導(dǎo)向的載體系統(tǒng)；和導(dǎo)向的載體系統(tǒng)； 目前人們多重視分子水平的目前人們多重視分子水平的 研究而忽略了整體研究，對(duì)研究而忽略了整體研究，對(duì) 整體宏觀水平缺乏

10、了解。整體宏觀水平缺乏了解。 1999年年9月月17日，美日，美 國國Arizona州州18歲的歲的 青年青年格爾辛格格爾辛格在賓夕在賓夕 法尼亞大學(xué)人類基因法尼亞大學(xué)人類基因 治療研究所接受基因治療研究所接受基因 治療治療4天后不幸死亡，天后不幸死亡， 成為基因治療實(shí)施以成為基因治療實(shí)施以 來第來第1個(gè)直接死于這個(gè)直接死于這 種試驗(yàn)的病人。種試驗(yàn)的病人。 生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生 27 六、基因治療關(guān)鍵問題 1.靶向性基因?qū)胂到y(tǒng) 基因治療的關(guān)鍵問題是將治療基因送入特定得靶細(xì) 胞，并在該細(xì)胞中得到高效表達(dá)； 2.外源基因表達(dá)的可控性 導(dǎo)入基因后無調(diào)控表達(dá)將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果。最理想

11、的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控形式； 3.治療基因過少 28 29 30 31 Fig.1.MapofrecombinantAd.RGD.mda-7and Ad.RGD.pK7.mda-7adenovirusvectorsgenomes encodingmda-7. 32 Fig.2.Figureshowingtheenhancedtumorkillingeffectof geneticallymodifiedAd.RGD.pK7.mda-7andAd.RGD.mda-7 virusescomparedtounmodifiedAd.mda-7. 33 Fig.3.PBS(A)orcontr

12、olvirus Ad.GFPtreatedanimals(B),or Ad.RGD.Pk7.GFPtreated animals 34 Fig.4.Significantinhibitionoftumorgrowthand bloodyasciteswasshowninAd.mda-7treated animals(C)andAd.RGD.pK7.mda-7treated animals(E). 35 基因治療在未來人類重大疾基因治療在未來人類重大疾 病的預(yù)防和治療上必將發(fā)病的預(yù)防和治療上必將發(fā) 揮越來越大的作用！揮越來越大的作用！ 36 七、基因診斷（七、基因診斷（Gene Diagnosi

13、sGene Diagnosis） G G到到T T一個(gè)堿基的改變，決定了一個(gè)堿基的改變，決定了 一個(gè)人的命運(yùn)一個(gè)人的命運(yùn) 小皓珩出生小皓珩出生2323個(gè)月就出現(xiàn)皮疹、個(gè)月就出現(xiàn)皮疹、 便血等病狀，患上了罕見的原發(fā)便血等病狀，患上了罕見的原發(fā) 性免疫缺陷病。性免疫缺陷病。 DNADNA序列分析，證實(shí)了小皓珩序列分析，證實(shí)了小皓珩WASWAS 蛋白基因的蛋白基因的13881388位核苷酸由位核苷酸由G G突突 變?yōu)樽優(yōu)門 T，使編碼谷氨酸的密碼，使編碼谷氨酸的密碼GAGGAG 突變?yōu)榻K止密碼突變?yōu)榻K止密碼TAGTAG WASWAS蛋白突變?yōu)闊o功能的蛋白突變?yōu)闊o功能的WASWAS蛋白，蛋白， 導(dǎo)致患

14、兒血小板減少，淋巴細(xì)胞導(dǎo)致患兒血小板減少，淋巴細(xì)胞 形態(tài)和功能異常形態(tài)和功能異常 希望：希望：WASWAS目前已經(jīng)可以用骨髓目前已經(jīng)可以用骨髓 移植或干細(xì)胞移植根治移植或干細(xì)胞移植根治 通過從患者體內(nèi)提取樣本 (DNA)用基因檢測(cè)方法來 判斷患者是否有基因異常 或攜帶病原微生物的方法， 就是基因診斷。 生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生 37 傳統(tǒng)與基因診斷的比較 傳統(tǒng)的診斷 望 問 聽 觸經(jīng)驗(yàn) 化驗(yàn)/檢驗(yàn)微生物、 免疫學(xué)、生物化學(xué)、病 理學(xué)等對(duì)細(xì)胞、組織、 酶、代謝物等檢測(cè) 影像學(xué)X線、B超、CT、 核磁共振、內(nèi)窺鏡等 特殊檢查肌電/腦電/ 心電、骨密度等 基因診斷 應(yīng)用分子生物學(xué)方法：如

15、應(yīng)用分子生物學(xué)方法：如 PCRPCR技術(shù)或技術(shù)或PCRPCR與分子雜交與分子雜交 標(biāo)記標(biāo)記 主要應(yīng)用于主要應(yīng)用于 先天遺傳性疾患（苯丙酮尿先天遺傳性疾患（苯丙酮尿 癥、血紅蛋白?。┌Y、血紅蛋白?。?后天基因突變引起的疾病后天基因突變引起的疾病 （腫瘤、糖尿?。[瘤、糖尿病） 病原生物的侵入（流感、肝病原生物的侵入（流感、肝 炎、艾滋?。┭住滩。?個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證 生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生 38 感染性疾病檢測(cè)感染性疾病檢測(cè) n 利用PCR技術(shù)或PCR與分 子雜交標(biāo)記相結(jié)合，可以 快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原性 物質(zhì) n乙型肝炎病毒 n丙型肝炎病毒 n結(jié)核桿菌和瘧原

16、蟲的分型 39 公安司法系統(tǒng)公安司法系統(tǒng)罪犯及受罪犯及受 害人的身份識(shí)別及親子鑒定害人的身份識(shí)別及親子鑒定 部隊(duì)部隊(duì) 傷亡士兵的身份傷亡士兵的身份 識(shí)別；印尼海嘯中死難人員識(shí)別；印尼海嘯中死難人員 身份識(shí)別身份識(shí)別 保安保安 個(gè)人個(gè)人DNADNA身份證，身份證， 用于人員識(shí)別用于人員識(shí)別 個(gè)體識(shí)別個(gè)體識(shí)別 14歲智障少女懷孕 親子鑒定牽出70歲嫌犯 40 作業(yè)：作業(yè)： “英國研究人員英國研究人員2007年年4月月12日宣布，他們?cè)谑澜缟鲜状稳招迹麄冊(cè)谑澜缟鲜状?確認(rèn)了一個(gè)與肥胖相關(guān)的等位基因，他們將之稱為確認(rèn)了一個(gè)與肥胖相關(guān)的等位基因，他們將之稱為FTO。 這一研究成果發(fā)表在這一研究成果發(fā)表在科學(xué)科學(xué)雜志上。雜志上。”如果你是一名肥如果你是一名肥 胖癥患者，你將如何根據(jù)這一新發(fā)現(xiàn)對(duì)自己進(jìn)行治療？請(qǐng)胖癥患者，你將如何根據(jù)這一新發(fā)現(xiàn)對(duì)自己進(jìn)行治療？請(qǐng) 簡(jiǎn)要寫出治療方案。簡(jiǎn)要寫出治療方案。 “統(tǒng)計(jì)表明，全世界統(tǒng)計(jì)表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和攜帶者達(dá)（乙型肝炎）感染者和攜帶者達(dá) 3.5億人之多。我