亞細(xì)胞核地分離和鑒定

1、亞細(xì)胞核的分離和鑒定關(guān)鍵詞：細(xì)胞試劑試劑盒甲苯胺藍(lán)試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)1、細(xì)胞核的分離 細(xì)胞核作為一個功能單位，完整地保存遺傳物質(zhì)，并指 導(dǎo)RNA合成，進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的蛋 白，在一定程度上細(xì)胞核控制著細(xì)胞的代謝、 生長、分化和繁殖活動。因此細(xì)胞核的分離是研究基 因表達(dá)及細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)的 首要步驟。不同組織來源的細(xì)胞經(jīng)勻漿后，可用分級離心等方法將 細(xì)胞核進(jìn)行分 離純化。細(xì)胞核的分離目前較常采用以蔗糖為介質(zhì)的差速離心法，可分為細(xì)胞核分離和純化兩大步驟。細(xì)胞勻漿后，先以0. 25mol /L。的蔗糖1000g離心洗滌， 然后在0. 34mol /L和0. 88mol /L的蔗糖梯度中1500g

2、離心1520分鐘, 沉淀即為純化的細(xì)胞核。現(xiàn)在細(xì)胞核的提取 試劑已商業(yè)化生產(chǎn)，公司試劑盒中會 提供詳細(xì)的操作步驟。細(xì)胞核被分離后，可經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色在光學(xué)顯微鏡下觀察， 或直接在電子顯微鏡下觀察核內(nèi)染色質(zhì)的分布情況。2、細(xì)胞核的鑒定(1) 光鏡直接觀察：普通光學(xué)顯微鏡下，貼壁細(xì)胞的細(xì)胞核為位于細(xì)胞中央 的一團(tuán)較深物質(zhì)，懸浮細(xì)胞會顯得更模糊，且都無法清晰分辨細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。 常用于細(xì)胞核的化學(xué)染料包括甲紫、蘇木精、醋酸洋紅、甲基綠等。蘇木精.伊 紅染色簡稱HE染色，是組織學(xué)、胚胎學(xué)和病理學(xué)最常用最基本的細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì) 染色方法，細(xì)胞核嗜堿被蘇木精染成藍(lán)色(圖5-3-1) o(2) 電鏡觀察：電鏡能清

3、晰地觀察到細(xì)胞核基質(zhì)的基本形態(tài)，以及核膜、核 仁、核染色質(zhì)等，所以可以被應(yīng)用到細(xì)胞核的可視化研究中。比如細(xì)胞凋亡，電 鏡下清晰可見，核基質(zhì)由結(jié)構(gòu)完整到出現(xiàn)紊亂，到凋亡小體的形成并由核內(nèi)排出。 因此，電鏡掃描可以清晰展示出細(xì)胞核的各個階段的狀態(tài)，能更形象化地應(yīng)用于 細(xì)胞核功能學(xué)、發(fā)育學(xué)以及細(xì)胞凋亡等研究中(圖5-3-2)。(3) 細(xì)胞學(xué)鑒定：核酸熒光染色后，可采用熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描熒 光顯微鏡以及流式細(xì)胞儀檢測。常用的三大經(jīng)典核酸染料包括：插入性染料，如: ethidium bromide(EB)和 propidiumiodide(PI) ； DNA 小溝結(jié)臺染料，如： DAPI和Hoe

4、chst :以及其他類核酸染料，如：吖啶橙、7-AAD、LDS751等。DAPI是一種具有膜通透性的強力 DNA熒光染料，可用于活細(xì)胞以及死細(xì) 胞的細(xì)胞核染色。熒光顯微鏡下，DAPI可被紫外光激發(fā)出藍(lán)色熒光，其熒光激 發(fā)光358nm以及發(fā)射光461 nm。因為彼此的發(fā)射光很少重疊，DAPI通常與綠 色熒光（如GFP）和紅色熒光（如RFP）結(jié)合，三者被用于細(xì)胞的多重?zé)晒馊旧▓D 5-3-3）。Hoechst 染料常用的有 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342，其激發(fā) 光和發(fā)射光與DAPI非常相似，都可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的標(biāo)記。DAPI和Hoechst染料是科研人員最常使用

5、的用于細(xì)胞核標(biāo)記的熒光染料。此外，在細(xì)胞增殖的研究中，人們常常將 Brdu /Edu等底物摻入到增殖的 細(xì)胞核DNA鏈中，再通過熒光素標(biāo)記Brdu/Edu，繼而顯色增殖細(xì)胞的細(xì)胞核。 在細(xì)胞凋亡研究中，人們常采用 TUNEL染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核。由于三維重建等優(yōu)點，共聚焦顯微鏡在細(xì)胞成像技術(shù)中的地位逐漸突出。：DAPI雖然常用，但是多數(shù)共聚焦顯微鏡沒有紫外線波段的激發(fā)光，所以其他一系列更適用于共聚焦的核酸熒光染料被開發(fā)出來，比如TOTO系列，TO-PRO系列，SYTOX系列以及SYTO系列等。3、方法優(yōu)缺點比較與選擇 細(xì)胞核檢測較少采用細(xì)胞免疫熒光或原位免疫 組化的檢測方法，而普遍采用熒光

6、染料與核酸物質(zhì)直接結(jié)合而顯色。 組織染色中， 細(xì)胞核的常規(guī)光鏡觀察優(yōu)先選擇蘇木精染色，簡單方便，普通光鏡就能得到胞質(zhì)區(qū)別明顯的組織切片圖片，但分辨率差，常常僅限于低倍鏡下觀看，且細(xì)胞核輪 廓不清晰，染色特異性差。在多重細(xì)胞熒光染色時，DAPI和Hoechst染色為核酸染色首選，活細(xì)胞以 及固定后的細(xì)胞上都可以得到特異性的細(xì)胞核成像， 且輪廓清晰，染色高效快捷， 由紫外光激發(fā)，與其他常用激發(fā)波段的波長基本不重疊。但DAPI為半透膜染料， 組織核酸標(biāo)記并不理想，并且其紫外激發(fā)波段也不適用于所有共聚焦顯微鏡。TOTO和TO-PRO等系列的核酸熒光染料常常用于共聚焦顯微鏡 細(xì)胞成像, 并且遠(yuǎn)紅外激發(fā)波段的染料更常見。遠(yuǎn)紅