免疫熒光雙標操作方法及注意事項

1、在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染 色。雙 重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直 接法和間接法。(1) 直接法雙重免疫熒光標記：將標記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，滴加在標本上孵育，然后洗去未結(jié)合的熒光抗 體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀察，即可對兩種抗原進 行定位和定量。直接法簡便可靠，但靈敏度較低。(2) 間接法雙重免疫熒光標記：用未標記的兩種特異性第一抗體孵育組織或 細胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗 體孵育組織或細胞，洗

2、去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種 相應的激發(fā)濾片觀察，從而對兩種抗原進行定位和定量。使用此法應注意兩 種特異性第一抗體必須來源于不同種屬，且熒光標記第二抗體的種屬必須與 第一抗體的種屬相匹配。免疫熒光雙標技術(shù)中操作要點和注意事項一、免疫熒光技術(shù)中標本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點如下：K免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據(jù)抗體的工 作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、免疫熒光在封片時常使用專用封片劑或甘油：0.01M PBS (1 ： Do 條件許可，建議購買抗淬滅的封

3、片液，使標本可以保存更久。5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。6、熒光抗體染色假陽性可能會多，需要分別設定陽性和陰性對照。二、注意事項K熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4C保存4h ,時間過長，可 能會使熒光提前衰退。2、每次試驗均需設置以下三種對照：(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物；(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物；(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。三、免疫熒光雙標的經(jīng)驗之談1、選取一抗時，要求來源于兩種不同的動物，我用的是來源于家兔和大鼠 的抗體,二抗則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey ant i- rabb it-FITC(綠)和 donkey a

4、nt i-rat-Tex-Red(紅)。2、我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育。抗體濃度 孵育時間要自我摸索，我感覺一抗4C孵育過夜比較好，背景比較清晰。3、我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠 的IgG ,熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。4、封閉血清是二抗來源動物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。5、其余事項同免疫熒光單標操作。免疫組化雙重染色方法和步驟在生物醫(yī)學和臨床研究實踐中，經(jīng)常需要檢測8. 滴加生物素化二抗（如抗兔二抗）,室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘；9. 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白一堿性磷酸酶，室溫孵育10

5、分鐘，PBS沖 洗3次，每次5分鐘10. 堿性磷酸酶顯色液（BCIP/NBT）顯色（紫藍色）.PBS沖洗3次，每 次5分鐘；11. 滴加0.05%鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）；12. 滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37C孵育10分鐘；13.滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體）4飛過夜孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘；14. 滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次,每次5分鐘：15. 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘16.過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）.PBS沖洗3次，每次5分鐘17. 蘇木精復染細胞核;18. 水溶性封片劑封片。在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設計。購買免疫組化雙染試劑盒時；應選擇與設 計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應避免定位在細胞的同一部位（如胞 核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，最好選擇免疫熒光組織細胞 化學雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光）,它比SP法的顯