乙草胺對泥鰍生理

1、苯磺隆對鯽魚毒害效應(yīng)的苯磺隆對鯽魚毒害效應(yīng)的生物標(biāo)志物監(jiān)測技術(shù)生物標(biāo)志物監(jiān)測技術(shù) 濱州學(xué)院生命科學(xué)系濱州學(xué)院生命科學(xué)系 張彬彬張彬彬 綜述一 前言 苯磺隆的使用情況、性質(zhì)、危害、以及分析方法二 生物標(biāo)志物在監(jiān)測環(huán)境污染中的應(yīng)用 可用于監(jiān)測環(huán)境污染的生物標(biāo)志物 正文一 苯磺隆對鯽魚的毒性效應(yīng)二 苯磺隆對鯽魚內(nèi)膜系統(tǒng)的影響三 苯磺隆對鯽魚肝細(xì)胞五種酶的影響綜述一 前言1 1 使用情況：使用情況：磺酰脲類除草劑-苯磺隆是一種新型超高效的除草劑，它被廣泛用于麥類作物,有效防除一年生及多年生闊葉雜草。因其用量低、對哺乳動物低毒等特點已發(fā)展成為世界上用量最大的一類除草劑。據(jù)權(quán)威人士分析，國產(chǎn)苯磺隆將成為我

2、國麥田除草的當(dāng)家品種，僅2010年10月份苯磺隆產(chǎn)量為353.52噸，11月份為764.88噸，環(huán)比增加116.36%。未來五年，苯磺隆年產(chǎn)量仍呈上升趨勢。 2 2 苯磺隆的性質(zhì)：苯磺隆的性質(zhì)：苯磺隆在土壤中降解緩慢，降解半衰期為12個月，殘留高,隨著雨水淋洗、地下滲透等作用的影響,苯磺隆易引起對地下水的污染。3 3 危害：危害：隨苯磺隆在水中積蓄到一定量后，將對水生生物產(chǎn)生影響，甚至通過間接作用影響人類的健康。李淑梅等研究表明隨著苯磺隆濃度的提高，土壤中動物的數(shù)量和種類呈遞減趨勢。陳小玉等人研究表明苯磺隆對雄性大鼠生殖有一定的毒性作用。 4 4 分析方法：分析方法：對低毒、長期的污染，采用化

3、學(xué)分析的方法往往很難評價它的潛在毒性，傳統(tǒng)的利用指示生物的測試如急性毒性實驗、致死濃度的測定也很難有理想的結(jié)果。因此，運用生物標(biāo)志物對這種低毒、長期的污染物進(jìn)行合理的評價，是目前毒理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。 二 生物標(biāo)志物在監(jiān)測環(huán)境污染中的應(yīng)用可用于監(jiān)測環(huán)境污染的生物標(biāo)志物 （一）生物標(biāo)志物的定義（一）生物標(biāo)志物的定義 生物標(biāo)志物是：通過測量體液、組織或整個生物體，能夠表征對一種或多種化學(xué)污染物的暴露或其效應(yīng)的生化、細(xì)胞、生理、行為或能量上的變化。簡單地講，生物標(biāo)志物就是可衡量環(huán)境污染物的暴露以及效應(yīng)的生物反應(yīng)。（二）可用于監(jiān)測環(huán)境污染的生物標(biāo)志物（二）可用于監(jiān)測環(huán)境污染的生物標(biāo)志物 1 1 組織結(jié)

4、構(gòu)和亞顯微結(jié)構(gòu)組織結(jié)構(gòu)和亞顯微結(jié)構(gòu)1.1 紅細(xì)胞1.2 肝胰腺細(xì)胞1.3 線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體2 2 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)2.1 應(yīng)激蛋白2.2 金屬硫蛋白3 3 酶酶3.1 乙酰膽堿酯酶3.2 超氧化物歧化酶3.3 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶3.4 谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶正文 一 苯磺隆對鯽魚的毒性效應(yīng)（一）實驗材料和方法（一）實驗材料和方法 1 1 材料：材料： 鯽魚平均體長13.45cm，平均體重36.58g。魚缸若干個，規(guī)格為604040，充氧泵若干個，中型塑料水盆10個。粉式苯磺隆由金華市金龍化工有限公司生產(chǎn)。 2 2 方法：方法： 2.12.1實驗條件實驗條件 實驗用水為陽光曝氣7d的自來水，試驗

5、期間水溫2210，PH6.57.5。每個魚缸中投放30尾魚暫養(yǎng)，每天上午10：00換一次水。 2.2 2.2 半數(shù)致死濃度和安全濃度的測定半數(shù)致死濃度和安全濃度的測定 設(shè)計19mg/L、20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L的藥液共5個濃度組，每個塑料盆里按照設(shè)計的濃度加入苯磺隆處理液，然后在每個濃度組里投放8條鯽魚，分別記錄24hr、48hr各濃度組內(nèi)鯽魚的死亡數(shù)目。根據(jù)加權(quán)概率法計算半數(shù)致死濃度TLm，進(jìn)而求得安全濃度。 安全濃度=注： TLm48為“48小時半數(shù)致死濃度”的縮寫； TLm24為“24小時半數(shù)致死濃度”的縮寫1 1 苯磺隆對鯽魚的急性毒性試驗結(jié)果見表苯磺隆對

6、鯽魚的急性毒性試驗結(jié)果見表1 1 根據(jù)24hr、48hr的鯽魚死亡數(shù)（表1）,利用加權(quán)概率單位法，采用SAS8.2 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，分別求得24hr、48hr的半數(shù)致死濃度。結(jié)果如下： 24hr的半數(shù)致死濃度為20.27mg/L，95%置信區(qū)間為（18.21,21.31）mg/L 48hr的半數(shù)致死濃度為19.24mg/L，95%置信區(qū)間為（15.08,20.20）mg/L2 2 安全濃度安全濃度 （二）實驗結(jié)果（二）實驗結(jié)果二 苯磺隆污染液對鯽魚內(nèi)膜系統(tǒng)的影響 線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是對損傷極為敏感的兩種細(xì)胞器。溶酶體內(nèi)含多種水解酶，其次級溶酶體的異噬溶酶體通過消化外源物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞。0組與15

7、組濃度組對比發(fā)現(xiàn)，濃度組肝細(xì)胞主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、嵴減少、空泡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，異噬型溶酶體增多等一系列的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)病變。這些改變大多是細(xì)胞不可修復(fù)性損傷的標(biāo)志，預(yù)示著活體細(xì)胞死亡或壞死的出現(xiàn)。同時還發(fā)現(xiàn)，隨苯磺隆質(zhì)量濃度的增大，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度也呈現(xiàn)漸進(jìn)的變化：1、2組細(xì)胞中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量增生，說明低濃度苯磺隆刺激，肝細(xì)胞出現(xiàn)暫時的應(yīng)激反應(yīng)。同時在1、2組肝細(xì)胞吸收的苯磺隆中的有機成分，被溶酶體吞噬，而溶酶體不能對其消化分解掉，因而異噬型溶酶體大量形成。此種溶酶體的增多，將影響肝細(xì)胞的功能。隨著苯磺隆質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，在3、4、5組，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)空泡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的損

8、傷。 三 苯磺隆對鯽魚五種酶的影響苯磺隆對鯽魚五種酶的影響1 1 試劑試劑 本實驗所用藥品試劑為南京建成生物工程研究所所提供的酶活力測試試劑盒，試劑配制按試劑盒說明書中配制方法配制。2 2 組織勻漿的制備組織勻漿的制備:24h:24h、48h48h、96h96h 2.1 稱量 2.2 研磨 2.3 離心 2.4 取上清液 2.5 測各種酶的活力 2.6 考馬斯亮蘭測組織蛋白的含量 2.7 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)用SAS 8.2軟件進(jìn)行處理。所得結(jié)果均為平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差；用GLM程序進(jìn)行析因設(shè)計的方差分析，分析不同濃度間、不同時間及濃度與時間的交互作用。3 3 苯磺隆對鯽魚肝臟五種酶的影響苯磺隆對鯽魚肝

9、臟五種酶的影響3.1 3.1 苯磺隆對鯽魚轉(zhuǎn)氨酶活性的影響苯磺隆對鯽魚轉(zhuǎn)氨酶活性的影響3.1.1 3.1.1 對谷丙轉(zhuǎn)氨酶（對谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPTGPT）活性的影響）活性的影響 經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，不同濃度間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=170.43，P0.001），不同的時間點差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.56，P0.001），且濃度與時間之間存在交互作用（F=11.89，P0.001），即不同濃度不同時刻GPT的變化是不同的。24h的2、4濃度組，48h的1、5濃度組和96h的第3濃度組與對照組相比，差異顯著（P0.05）；24h的3濃度組，48h的2、3、4濃度組以及96h的2濃度組與對照組相比，

10、差異極顯著（P0.01）。 3.1.2 3.1.2 對谷草轉(zhuǎn)氨酶（對谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOTGOT）活性的影響）活性的影響 注：“*”表示與對照組差異顯著（P0.05）,“*”表示與對照組差異極顯著（P0.01）。 經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，不同濃度間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=114.84，P0.001），不同的時間點差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.58，P0.001），且濃度與時間之間存在交互作用（F=14.37，P0.001）,即不同濃度不同時刻GOT的變化是不同的。24h的1濃度組，48h的4濃度組和96h的第1濃度組與對照組相比，差異顯著（P0.05）；24h的2、3、4濃度組，48h的1、2、3濃度組

11、以及96h的2濃度組與對照組相比，差異極顯著（P0.01）。3.1.3 3.1.3 討論討論 苯磺隆處理后GPT活性變化見表2。由表1可以看出，5個濃度組測得的酶活力均高于對照組，反映了短時間苯磺隆處理可誘導(dǎo)GPT升高，加強對毒物的排出。但每組的96h的酶活力均低于同一濃度組48h的酶活力，反映出肝細(xì)胞長期處于苯磺隆這一不良的狀態(tài)下，功能開始下降，說明鯽魚肝中GPT活力與染毒質(zhì)量濃度和時間長短有關(guān)。 苯磺隆處理后GOT活性變化見表3。試驗結(jié)果顯示GOT的活力變化趨勢與GPT的相似：除去96h的第5濃度組，GOT活力低于對照組，誘導(dǎo)率為-10.51%以外，其余苯磺隆處理組，從相同時間段不同濃度來

12、看， GOT活性均被誘導(dǎo)，但隨著處理時間的延長，誘導(dǎo)率有所下降，96h的GOT活性低于48h處理組。從相同濃度不同時間段來看，各組都表現(xiàn)為隨時間延長誘導(dǎo)率下降的趨勢。該試驗結(jié)果說明肝細(xì)胞隨著處于不良狀態(tài)下時間的延長，肝組織受到一定程度的損傷，抑制了肝細(xì)胞中GOT酶的活力。 轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，普遍存在于動物、植物組織和微生物中，心肌、腦、肝等動物組織中含量較高，轉(zhuǎn)氨酶參與氨基酸的分解和合成，其中GPT和GOT是肝臟中活力比較大的2種重要轉(zhuǎn)氨酶。轉(zhuǎn)氨酶活性高低能反映出生物體內(nèi)氨基酸代謝情況，是衡量肝臟功能的生理指標(biāo)。肝臟既是營養(yǎng)物質(zhì)消化的主要腺體，也是尿素合成的主要場所

13、，有解毒功能。GPT和GOT活性顯著提高，能夠加快尿素生成，減少氨基酸代謝產(chǎn)物對機體的毒害。結(jié)果表明：結(jié)果表明：各苯磺隆處理組GPT和GOT的活性在24、48h都高于0組，反映了短時間苯磺隆處理可誘導(dǎo)這2種酶提高，加強對毒物的排出。各處理組2種酶的活力在96h呈現(xiàn)下降趨勢，其中5組酶的活力明顯小于4組的活力。反映出肝細(xì)胞長期處于不良的狀態(tài)下，功能開始下降。3.2 3.2 苯磺隆對鯽魚谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶苯磺隆對鯽魚谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs(GSTs) )活性的影響活性的影響 由表4可以看出，不同時間、不同濃度處理的鯽魚GSTs活性均被誘導(dǎo)，隨污染物濃度的升高，GSTs活性先升高而后開始下降，但仍

14、高于對照組。 經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，不同濃度間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=187.62，P0.001），不同的時間點差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.33，P0.001），且濃度與時間之間存在交互作用（F=4.48，P0.001），即不同濃度不同時刻GSTs的變化是不同的。 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶是廣泛分布于哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶,其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián),增加其疏水性使其易于穿越細(xì)胞膜,分解后排出體外,從而達(dá)到解毒的目的。而親電子有毒化合物與GSTs的結(jié)合反應(yīng)，主要是將親電子底物中的基團(tuán)轉(zhuǎn)移到還原性谷胱甘肽的S原子上，

15、使親電子的化合物變成親水的物質(zhì)，就是通過這種方式將體內(nèi)的親脂化合物及各種有潛在毒性的物質(zhì)降解排出體外。當(dāng)鯽魚接觸環(huán)境中的苯磺隆后，其肝臟內(nèi)的GSTs作為一種生物標(biāo)志酶其活性會發(fā)生明顯變化，并與暴露的時間和苯磺隆的濃度有關(guān)。本試驗結(jié)果表明：當(dāng)?shù)蜐舛缺交锹√幚頃r，肝臟內(nèi)的GSTs出現(xiàn)暫時的激活現(xiàn)象以消除體內(nèi)的過氧化物；隨著苯磺隆濃度的增大，鯽魚體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧化產(chǎn)物，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加之抗氧化酶類活性的普遍降低，肝臟GST的活力又會出現(xiàn)下降，從而對鯽魚產(chǎn)生危害，造成鯽魚出現(xiàn)中毒癥狀或者死亡。3.3 3.3 苯磺隆對鯽魚超氧化物歧化酶苯磺隆對鯽魚超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)活性的影響活性的

16、影響 由表5可以看出，24、48h處理的鯽魚SOD活性均被誘導(dǎo)，隨污染物濃度的升高，SOD 活性先升高而后開始下降；96 h處理的鯽魚SOD 活性先被誘導(dǎo)，而后誘導(dǎo)率降低，在5濃度組反而出現(xiàn)抑制效應(yīng)。 經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，不同濃度間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=359.73，P0.001），不同的時間點差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=199.49，P0.001），且濃度與時間之間存在交互作用（F=37.55，P0.001），即不同濃度不同時刻SOD的變化是不同的。 當(dāng)污染物進(jìn)入生物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時，可形成多種中間產(chǎn)物，其中許多中間產(chǎn)物可進(jìn)入氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生比母體污染物危害性更大的中間代謝產(chǎn)物，同時伴隨著大

17、量的活性氧自由基的產(chǎn)生。SOD是歧化超氧陰離子的專一性酶,是一種重要的氧自由基清除劑,可以保護(hù)生物體免受自由基的攻擊,其活性高低可反映體內(nèi)抗自由基水平。SOD 活性升高,可清除體內(nèi)多余的自由基,從而保護(hù)臟器功能。這些活性氧自由基若不及時被清除， 就會引起DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷，對機體造成氧化脅迫。SOD 普遍存在于動植物體內(nèi)，是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，其活性成分或含量可由于污染的脅迫而發(fā)生改變，因而可間接反映環(huán)境中氧化污染的存在，可作為機體受到氧化脅迫的指標(biāo)。試驗中低濃度苯磺隆溶液中鯽魚SOD 活性隨污染物濃度的升高而升高， 以清除過量的自由基。隨著濃度的繼續(xù)升高，

18、到第3、45濃度組濃度組，酶活性受到開始下降。甚至隨著處理濃度的升高、處理時間的延長，酶活性開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，如96h的第5濃度組。這可能是污染物產(chǎn)生的大量活性氧中間體已經(jīng)超出了機體清除活性氧的能力。結(jié)果大量的活性氧中間體作用于酶蛋白質(zhì)分子關(guān)鍵性氨基酸殘基，從而使酶活性受到抑制所導(dǎo)致的結(jié)果。 該實驗結(jié)果表明：動物細(xì)胞在低水平污染脅迫下會產(chǎn)生大量自由基，SOD的活性在自由基的誘導(dǎo)下也隨之升高，以清除過量的自由基；當(dāng)污染物長時間作用于機體后，或者污染物濃度過大，產(chǎn)生的大量活性氧中間體已超出了機體清除活性氧的能力，結(jié)果大量的活性氧中間體作用于酶蛋白質(zhì)分子的關(guān)鍵性氨基酸殘基，使酶活性受到抑制。 3.4 3.4 苯磺隆對鯽魚乙酰膽堿酯酶苯磺隆對鯽魚乙酰膽堿酯酶(AChE(AChE) )活性的影響活性的影響 經(jīng)24、72、96h測定的AChE活性及苯磺隆對其活性的抑制率見表6。析因設(shè)計的方差分析表明，不同濃度間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.86，P0.001），不同時間點間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.19，P=0.83），且濃度與時間之間不存在交互作用（F=0.27，P=0.98），即不同濃度不同時刻AChE活性的變化是不同的。 由表6可看出，苯磺隆處理液對鯽魚AChE活性幾乎呈抑制效應(yīng)，同一濃度抑制率一般隨時間的延長而增大（2組抑制率呈現(xiàn)先增大而后又減少的趨