陰溝腸桿菌高產(chǎn)AmpC酶基因檢測及分子流行病學研究

1、陰溝腸桿菌高產(chǎn)AmpC酶基因檢測及分子流行病學研究 作者：楊紹敏 胡大春 邵劍春 李超 蘇平 “【摘要】 目的 研究醫(yī)院陰溝腸桿菌高產(chǎn)AmpC酶及分子流行病學特征。方法 采用KB法藥敏試驗，雙紙片增效試驗和酶提取物三維試驗檢測陰溝腸桿菌高產(chǎn)AmpC酶，聚合酶鏈反應檢測AmpC酶基因、ERIC重復序列repPCR，研究昆明市第一人民醫(yī)院2002年7月2004年12月臨床分離的84株陰溝腸桿菌的耐藥性、AmpC酶基因型和克隆傳播狀況。結(jié)果 表型初篩試驗和ESBLs確認試驗，高產(chǎn)AmpC酶檢出率為27.38%(23/84)，ESBLs檢出率16.67%(14/84)，同時高產(chǎn)AmpC酶和ESBLs檢

2、出率44.05%(37/84)。AmpC酶基因檢出率43.75%(28/64)。三維試驗高產(chǎn)AmpC酶檢出率為47.62%(40/84)?？寺鞑シ治?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株編號EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分別具有相同的DNA指紋圖，其余菌株間未見DNA指紋圖。結(jié)論 陰溝腸桿菌的耐藥性較為復雜。表現(xiàn)出去阻遏高產(chǎn)AmpC酶、產(chǎn)ESBLs、同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶多種耐藥表型。分子流行病學結(jié)果顯示，雖然陰溝腸桿菌的傳播與抗生素的誘導和選擇作用、患者機體抵抗力下降及腸道內(nèi)寄居菌的內(nèi)源性感染等因素有關(guān)，但仍然要警惕醫(yī)院感染的發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】 陰溝腸桿菌 AmpC

3、 內(nèi)酰胺酶酶 提取物三維試驗 重序序列引物聚合酶鏈反應(ERIC repPCR) Gene detection and the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae with hyperproduction of AmpC lactamase ABSTRACT Objective To investigate the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae with hyperproduction of AmpC lactamase. Methods Using the KirbyBa

4、uer (KB) antibiotic susceptibility test, cloxacillinsynergistic disc diffusion and the modified threedimensional extraction test, E.cloacae hyperproducing AmpC lactamase were examined. The differential genotypes of AmpC lactamase were investigated using the Enterobacter repetitive intergenic consens

5、us (ERIC) for repetitive extragenic palindromic elementbased PCR (repPCR). The study was carried on in the First Peoples Hospital of Kunming from July, 2002 to December, 2004 in 84 clinically separate cases of E.cloacae. We determined the drugresistance profile, genotype and molecular epidemiology o

6、f each strain. Results Using phenotypic screening and extendedspectrum lactamases (ESBLs) confirmatory test, twentythree strains (23/84, 27.38%) of E.cloacae were found to have hyperproduction of AmpC lactamase. The rate of ESBLs positive samples was 16.67% (14/84) and 44.05% had elevated AmpC lacta

7、mase and ESBLs (37/84). The rate of AmpC lactamase gene detection was 43.75% (28/64). Using the threedimensional extract test, we observed AmpC lactamase detection rate of 47.62% (40/84). Through molecular epidemiology analysis, the results showed that the strains EC2 and EC11, EC13 and EC14, EC19 a

8、nd EC20, had the same genotypic trees respectively. The rest of the strains did not exhibit this trait. Conclusion The drug resistance profile of E.cloacae is quite complex. The strains that expressed hyperproduction of AmpC lactamase only, ESBLs only, or both at the same time, demonstratedvariable

9、drug resistance between them. The results of the molecular epidemiological research demonstrated that even the transmission of E.cloacae resistance was often induced by the improper therapeutic option of drug, but also related to the decrease of the autoimmune condition of the patients and the enter

10、ic endogenous infections, whereas vigilant attention to the incidence of community/hospital acquired infections couldnt be ignored. KEY WORDS Enterobacter cloacae; AmpC lactamase; Modified threedimensional extract test; ERIC repPCR 近年來頭孢菌素在我國的廣泛使用和其對陰溝腸桿菌的選擇作用，陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs1和AmpC酶2已成為臨床關(guān)注的焦點。馬越等報道3，陰溝

11、腸桿菌對臨床常用抗生素的耐藥率，除亞胺培南和美羅培南外，8年間都有不同程度的增加。頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素和阿米卡星等抗生素的耐藥率都增加了20%以上。本研究采用表型初篩試驗、雙紙片增效試驗和酶提取物三維試驗，檢測從臨床感染標本中分離的84株陰溝腸桿菌高產(chǎn)AmpC酶和ESBLs，同時用聚合酶鏈反應檢測AmpC酶基因，用腸桿菌間的重復序列(Enterobacter repetitive intergenic consensus，ERIC)對引物進行擴增，研究其克隆傳播狀況，結(jié)果報告如下。 1 材料與方法 1.1 菌株來源及鑒定 收集2002年7月2004年12月昆明市第一

12、人民醫(yī)院住院及門診感染患者送檢的各類標本中分離的陰溝腸桿菌84株，排除同一患者同一部位重復分離的菌株。其中來自痰液標本68株(80.95%)，咽拭3株(3.57%)，尿液標本4株(4.76%)、膿性分泌物5株(5.95%)、腦脊液1株(1.19%)院內(nèi)感染監(jiān)測標本3株(3.57%)。標本主要來自醫(yī)院ICU(40%)、神經(jīng)外科(22%)和老干科(16%)。按照全國臨床檢驗操作規(guī)程第二版常規(guī)培養(yǎng)分離，菌株采用BD BBL Crystal ENF鑒定系統(tǒng)鑒定到種。 1.2 AmpC酶表型篩選法 采用CLSI/NCCLS(1999年)推薦的KirbyBauer紙片擴散法，廣東樂通泰公司提供法國BioM

13、erieux公司MuellerHinton瓊脂、英國Oxoid生產(chǎn)的藥敏紙片，亞胺培南(IMP)、頭孢吡肟(CPE)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CD03，30g/10g)、頭孢他啶/克拉維酸(CD02，30g/10g)。CFX和AMPC耐藥作為初篩指標4。再用IMP、CPE、CD02、CD03、CRO 5種紙片進一步判別5。結(jié)果顯示，CPE、IMP表現(xiàn)敏感，而CRO、CD02和CD03耐藥或其抑菌環(huán)內(nèi)存在少數(shù)菌落，為去阻遏持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶，提示IMP敏感其余均耐藥，判斷為高產(chǎn)AmpC酶和ESBLs同時存在。 1.3 頭

14、孢西丁三維試驗 采用改良酶提取物三維試驗6。 (1)制備內(nèi)酰胺酶粗提取物 將35培養(yǎng)過夜的測試菌制成1.5108CFU/ml菌液，取50l加入12ml胰蛋白胨肉湯。置35恒溫搖床上(200r/min)孵育46h，3000r/min離心25min，棄上清液。取沉淀加入0.01mol/L的PBS(pH7.4)1.0m1，旋渦混勻，置-170液氮及37反復凍融5次，4 12000r/min離心1h，上清即為酶提取物。取制備好的酶提取物接種于普通瓊脂平板，35孵育1824h，確認無細菌生長，-25保存。 (2)三維試驗(間接法) 將大腸埃希菌ATCC25922按KB法涂布MH瓊脂平皿，在其中央貼CFX

15、(30g)紙片，用無菌刀片在離紙片邊緣5mm處放射狀切1條狹縫，取2540l酶提取物加入狹縫內(nèi)，待稍干后置35 1824h。若在狹縫與抑菌環(huán)的交界處出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)域，判為AmpC酶陽性，說明受試菌為高產(chǎn)AmpC酶菌株，陰溝腸桿菌029為陰性對照，陰溝腸桿菌029M(解放軍301醫(yī)院微生物科贈送)為陽性對照。 1.4 ESBLs的檢測 ESBLs初篩和確認試驗按CLSI/NCCLS(1999年)推薦方法，CTX27mm、CAZ25mm、CRO25mm、ATM27mm四個紙片有兩個或以上小于上述標準為初篩陽性可疑菌株，需進行確認試驗。CD02與CAZ、CD03與CTX抑菌環(huán)直徑之差5mm，確認為

16、ESBLs陽性。 1.5 陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶基因型研究 (1)細菌DNA提取 采用堿裂解法，試劑盒(ACT1、MIR1和DHA1、DHA2)由無錫遺傳技術(shù)研究所提供。取菌落置入內(nèi)含100l生理鹽水的0.5ml離心管內(nèi)，離心(15000r/min)5min，棄上清液，加裂解液A 50l，裂解液B 2l，混勻后置入55保溫1h，再置入95保溫5min，離心(10000r/min)30s，上清液即為擴增的模板液。 (2)PCR擴增反應體系 按照試劑盒說明進行，取5l模板液加入15l耐熱熱管中加蓋石蠟油二滴即可。 (3)PCR擴增條件 93預變性2min，然后按93 30s55 20s72 60s

17、共循環(huán)35個周期，最后一個72延長到2min。取擴增產(chǎn)物10l與2l溴酚蘭指示劑混勻，點樣于2%瓊脂糖凝膠中，以100V電壓電泳2030min，出現(xiàn)與陽性模板分子相同的條帶(302bp)為ACT1、MIR1陽性。DHA1DHA2條帶為405bp。 1.6 重復序列引物聚合酶鏈反應(repPCR) (1)菌株來源 細菌DNA的提取、主要儀器均同上。 (2)寡核苷酸引物 腸桿菌屬基因重復序列(ERIC)7為：ERIC1 5ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3，ERIC2 5AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。 (3)試劑 Taq酶、dNTP、M

18、gCl2、10PCR Buffer均為上海博亞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。DNA分子大小Marker為Fermentas LIFE SCIENCE產(chǎn)品：GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus，分子大小范圍在1003000bp。瓊脂糖為REGULAR產(chǎn)品。 (4)PCR擴增反應體系 參照文獻8進行。10Buffer 2.5l、Mg2+ 50mmol/L 1.25l，dNTP(10mmol/L) 0.5l，Taq DNA polymerase 2.0U，引物(50pmol)0.5l，滅菌去離子水14.75l，樣品DNA 5l，總體積25l。 (5)PCR擴增條件 參照文獻8設

19、計，預變性95 7min，變性90 30s，退火52 1min，延伸65 8min，熱循環(huán)數(shù)30，最后變性90 30s，退火52 1min，延伸65 16min。 (6)PCR擴增產(chǎn)物檢測 用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，溴化乙啶(EB)染色，Gel Doc 2000TM凝膠成像分析系統(tǒng)分析DNA條帶，并用Quantity One軟件對repPCR指紋(條帶)進行細菌同源性分析。 2 結(jié)果 2.1 表型初篩試驗確認試驗高產(chǎn)AmpC酶、單產(chǎn)ESBLs、同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的檢出率分別為27.38%(23/84)、16.67%(14/84)、44.05%(37/84)；有11

20、.9%(10/84)菌株AmpC酶、ESBLs均陰性。單純高產(chǎn)AmpC酶和同時產(chǎn)AmpC酶與ESBLs兩種酶的菌株占71.43%(60/84)。 2.2 頭孢西丁三維試驗 AmpC酶陽性40株，即靠近指示紙片頭孢西丁的一側(cè)出現(xiàn)明顯抑菌環(huán)減小而形成的切跡，陽性率為47.62%(40/84)，其中AmpC酶表型篩選試驗檢出單純高產(chǎn)AmpC酶和同時產(chǎn)AmpC酶與ESBLs兩種酶的60株細菌中有38株三維試驗AmpC酶陽性，占63.33%(38/60)，14株雙紙片增效試驗檢出單產(chǎn)ESBLs細菌中，2株三維試驗AmpC酶陽性，占14.29%(2/14)。 2.3 AmpC酶基因 AmpC酶基因檢出率4

21、3.75%(28/64)。64株陰溝腸桿菌AmpC酶基因檢測陽性結(jié)果與表型初篩法及三維試驗陽性結(jié)果比較見表1。 2.4 克隆轉(zhuǎn)播狀況 對64株陰溝腸桿菌進行repPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株編號EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分別具有相同的DNA指紋圖；其余菌株間未見DNA指紋圖。表1 64株陰溝腸桿菌表型初篩法與三維試驗、AmpC酶基因檢測結(jié)果分析 3 討論 AmpC 內(nèi)酰胺酶可存在于染色體或質(zhì)粒上9。染色體AmpC酶分為誘導型和持續(xù)高產(chǎn)型；而質(zhì)粒AmpC酶無論有無誘導劑，均可持續(xù)大量生產(chǎn)10，11，還經(jīng)常攜帶多重耐藥基因如對氨基糖苷類、氯霉素、氟喹諾酮類和其他類型的內(nèi)酰

22、胺酶(如ESBLs)等，使其耐藥性日趨復雜。本研究采用紙片初篩法，確認試驗和三維試驗檢測臨床分離的84株陰溝腸桿菌的耐藥表型，檢出去阻遏突變高產(chǎn)AmpC酶菌株23株(27.38%)，單產(chǎn)ESBLs 14株(16.67%)，同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs 37株(44.05%)。北京顧怡明12的結(jié)果分別為65.32%、13.79%和20.69%，西安劉冬的結(jié)果13分別為42.48%、26.55%和9.73%，武漢施金玲14的結(jié)果為16.0%、10.4%和13.2%。本研究結(jié)果顯示，昆明市第一人民醫(yī)院臨床分離陰溝腸桿菌去阻遏突變高產(chǎn)AmpC酶的檢出率低于北京和西安地區(qū)，高于武漢；單產(chǎn)ESBLs的結(jié)果

23、與顧怡明比較接近；同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs高于國內(nèi)報道，分析原因有二：與標本的主要來源有關(guān)。本研究的標本主要來自醫(yī)院ICU(40%)、神經(jīng)外科(22%)和老干科(16%)；由于臨床抗生素的使用習慣及耐藥菌株的差異導致耐藥基因的地區(qū)差異性。本文結(jié)果表明，高產(chǎn)AmpC酶和產(chǎn)ESBLs已成為陰溝腸桿菌耐藥的二個主要因素。陰溝腸桿菌同時產(chǎn)生AmpC酶和ESBLs時，耐藥情況極為嚴重，除亞胺培南外，幾乎對所有抗生素耐藥。 三維試驗AmpC酶總陽性率為47.62%(40/84)。酶提取物三維試驗雖然能夠檢出AmpC 內(nèi)酰胺酶，但是不能區(qū)分是染色體還是質(zhì)粒介導的。其原因一是質(zhì)粒AmpC酶的種類較多，對頭

24、孢西丁的水解活性不盡相同，二是酶提取物的量也會影響檢測結(jié)果。 分析64株陰溝腸桿菌AmpC酶基因檢測結(jié)果。在表型檢測為去阻遏突變高產(chǎn)AmpC酶陽性的12株菌中有7株AmpC酶基因(blaACT1、blaMIR1或/和blaDHA1DHA2)擴增陽性，占58.33%；12株單產(chǎn)ESBLs中只有1株AmpC酶基因陽性(8.33%)；34株同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株中AmpC酶基因陽性率為44.12%(15/34)。表明陰溝腸桿菌耐藥表型比較復雜，實驗室耐藥性檢測仍然亟待提高和改進。 重復序列片段基因擴增是通過PCR擴增細菌重復DNA片段來獲得菌株特異性基因圖譜。腸桿菌屬基因間重復序列(ERI

25、C)長度為126bp，位于染色體上非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)，包含一段高度保守的中央倒置重復區(qū)和位于細菌基因外區(qū)域，由于不同的細菌ERIC在基因中的位置不同，所以分型效果較好，其分辨率較隨機引物PCR，核糖體分型的效率好7。EC2和EC11、EC13和EC14、EC19和EC20分別具有相同的DNA指紋圖，表現(xiàn)出垂直傳播特征。臨床資料顯示同為ICU來源的標本，EC2與EC11號為2002年11月、2003年1月的標本；EC13、EC14是2003年2月的標本；EC19、EC20號為2004年3月、4月的標本，有明顯的時間一致性。提示應加強醫(yī)院感染控制，切斷各種傳播途徑。 有90.63%(58/64)的陰溝腸桿菌未見相同的DNA指紋圖，表明陰溝腸桿菌的傳播與大量使用頭孢菌素和其他廣譜內(nèi)酰胺類抗生素的誘導和選擇作用，有嚴重的基礎疾病，接受侵入性診療手段如