石墨烯量子點―銀納米顆粒復(fù)合物用于過氧化氫和葡萄糖比色檢測

1、石墨烯量子點銀納米顆粒復(fù)合物用于過氧化氫和葡萄糖比色檢測 摘 要 以石墨烯量子點（gqds）為還原劑和穩(wěn)定劑，在其表面原位生長銀納米粒子（agnps），制備了具有良好分散性的gqds/agnps納米復(fù)合物，其粒徑小于30 nm。gqds/agnps納米復(fù)合物具有類過氧化物酶的催化活性，能有效催化h2o2氧化3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（tmb）并發(fā)生顯色反應(yīng)。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析表明， gqds/agnps催化動力學(xué)遵循典型的michaelis-menten模型，其催化機理符合乒乓機制。與辣根過氧化物酶（hrp）相比，gqds/agnps納米復(fù)合物具有更強的親和性?；趃qds/agnps的催化活性

2、和葡萄糖氧化產(chǎn)生h2o2的原理，建立了h2o2和葡萄糖的比色檢測方法，檢出限分別為0.18和1.6 mol/l。將本方法應(yīng)用于血漿中葡萄糖的檢測分析，結(jié)果與標準方法相符。 關(guān)鍵詞 石墨烯量子點-銀納米粒子復(fù)合物； 類過氧化物酶； 過氧化氫； 葡萄糖 1 引 言 銀納米粒子（agnps）是一種重要的納米材料，在催化、電子和抗菌等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但由于agnps易氧化和發(fā)生聚集，因此在實際分析應(yīng)用中一般需加入穩(wěn)定劑（如聚合物、有機小分子和納米顆粒等）使其穩(wěn)定存在1。 氧化石墨烯（go）具有優(yōu)良的電子、機械和化學(xué)性能，已成為構(gòu)建go-貴金屬新型復(fù)合材料中廣受歡迎的基本構(gòu)件。這些go-貴金屬材料在催

3、化2、表面拉曼掃描3、抗菌4、電子運輸5、制氫6、光學(xué)和化學(xué)傳感器7，8等領(lǐng)域均表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。在一步光化學(xué)反應(yīng)制備的go/agnps復(fù)合物中，agnps在go表面均勻分布，在無外加穩(wěn)定劑的條件下，go/agnps溶液呈現(xiàn)出良好的分散性及穩(wěn)定性9，10。 石墨烯量子點（gqds）是尺寸小于100 nm的零維石墨烯納米片，其量子限域和邊界效應(yīng)帶來的優(yōu)良熒光性能使其在光電子器件、光伏和光發(fā)射器件、生物成像、傳感和電化學(xué)催化等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用1113。本研究以gqds為還原劑，發(fā)展了一種在gqds表面原位生長agnps顆粒的新方法，進而得到gqds/agnps納米復(fù)合物。gqds在充當(dāng)還原劑的同時，對

4、原位生長的agnps表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定作用。此納米復(fù)合物在h2o2氧化3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（tmb）產(chǎn)生顯色反應(yīng)的過程中呈現(xiàn)優(yōu)良的催化活性，據(jù)此構(gòu)建了一種簡單、快速的h2o2和葡萄糖定量檢測分析方法。 2 實驗部分 2.1 儀器與試劑 h-7650型透射電子顯微鏡（tem），工作電壓為80 kv； u-3900紫外可見分光光度計（日本日立公司）； labram xplora全自動顯微拉曼光譜儀（法國horiba jobin yvon公司）。 石墨粉（南京先鋒納米材料科技有限公司）；葡萄糖（glu）、葡萄糖氧化酶（gox）、agno3、h2o2等（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。除特別標注外，

5、所有試劑皆為分析純，實驗用水為二次去離子水（18 m cm）。 2.2 gqds/agnps的制備 2.2.1 gqds的制備 首先根據(jù)文獻14的方法制備go， 具體過程如下：將10.0 g石墨粉、10.0 g k2s2o8和10.0 g p2o5混勻后，加入30 ml濃h2so4，80反應(yīng)6 h。冷卻至室溫后用去離子水洗滌至中性，60真空干燥， 得到預(yù)氧化石墨。 將5.0 g預(yù)氧化石墨與4.0 g nano3混勻，冰浴中緩慢加入184 ml濃h2so4，控制溫度在04之間。緩慢加入25.0 g kmno4，劇烈攪拌并控制溫度在10以下；反應(yīng)1 h后，將體系升溫至35反應(yīng)30 min； 室溫陳

6、化7天。反應(yīng)結(jié)束后，加入400 ml去離子水，90下加熱15 min，滴加h2o2至懸濁液由紅褐色變?yōu)榱咙S色。用hcl （110， v/v）充分洗滌至bacl2檢測無so2 symbolm4。最后用去離子水洗至弱酸性，60真空干燥至恒重，得到go。 取25 mg go分散于5 ml去離子水中，與20 ml hno3 （65%，v/v）混合后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯密封罐中，200微波消解5 min。冷卻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去未反應(yīng)的酸，用nahco3中和至中性，再用0.22 m濾膜過濾，收集濾液透析處理（5001000 mw co），得到gqds。 2.2.2 gqds/agnps納米復(fù)合物的制備 將0.5

7、mg/ml gqds （100 ml）溶液以氨水調(diào)節(jié)至中性，并超聲20 min。將濃氨水逐滴滴加到1 ml 50 mg/ml agno3溶液中，至溶液恰好澄清為止，得到銀氨溶液。將上述兩種溶液混合，100磁力攪拌油浴回流反應(yīng)1 h，最終得到紅棕色gqds/agnps水溶液。 為進行性能比較，研究中以0.5 mg/ml go溶液取代gqds溶液，按上述過程制備了go/agnps納米復(fù)合物。 2.3 比色法測定h2o2和葡萄糖 將340 l hac-naac緩沖液（ph 4.0），100 l h2o2溶液，12 l tmb溶液（25 mmol/l）和50 l gqds/agnps溶液（250 g/

8、ml）混和搖勻，室溫下渦旋振蕩反應(yīng)40 min，在652 nm波長處測定溶液吸光度。 葡萄糖檢測時，在葡萄糖樣品溶液中加入100 l gox，37條件下水浴反應(yīng)30 min。后續(xù)檢測過程與h2o2檢測相同。 3 結(jié)果與討論 3.1 gqds/agnps納米復(fù)合物的制備與表征 本研究中將濃氨水加入agno3中得到銀氨溶液，ag（nh3）+2在靜電作用下吸附到含有oh和cooh官能團的gqds表面9。在100溫度條件下，gqds發(fā)生熱還原15，致使ag（nh3）+2在gqds表面轉(zhuǎn)化生成ag0（nh3）2。生成的ag0（nh3）2在電子供體nh3的保護下，形成低聚的ag原子簇，并隨時間延長逐漸長大

9、，最后生長成為膠體agnps 。 圖1a為gqds的透射電鏡圖，粒徑統(tǒng)計顯示gqds的平均粒徑為27 nm，與文獻14報導(dǎo)方法的結(jié)果相符。圖1b為原位生長agnps后的gqds/agnps納米復(fù)合物的透射電鏡結(jié)果，可以觀察到在gqds表面原位生成了黑色的agnps，插圖為gqds/agnps的高分辨透射電鏡照片，可以清晰地看到agnps的晶格結(jié)構(gòu)，晶格間距為0.19 nm，對應(yīng)ag納米晶的200晶面16。粒徑分布統(tǒng)計結(jié)果表明，gqds/agnps納米復(fù)合物的粒徑范圍為830 nm，比gqds的粒徑大，這是因為在gqds表面生長了一層agnps納米粒子所致。 圖2a是gqds原位生長agnps前

10、后的紫外-可見吸收光譜。gqds在230 nm處有最大吸收，對應(yīng)芳香環(huán)sp2雜化的-*躍遷。而gqds/agnps納米復(fù)合材料除230 nm處的吸收峰外，在403 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，為agnps的表面等離子體共振特征吸收峰16，說明agnps成功原位生長于gqds表面。 由gqds和gqds/agnps納米復(fù)合物的x射線光電子能譜（xps）全圖分析結(jié)果（圖2b）可以看到，gqds和gqds/agnps譜圖中均有位于284 ev處的c1s峰和532 ev處的o1s峰，但gqd/agnps在370 ev附近出現(xiàn)了ag的特征能譜峰。從ag3d的高分辨譜圖（圖2c）可以看出，gqds/agnps納

11、米復(fù)合物中ag的特征峰分別位于368和374 ev處，對應(yīng)ag的3d5/2和3d3/2。這兩個峰差值為6.0 ev，與金屬形態(tài)銀的兩峰理論差值相符17。 gqds和gqds/agnps納米復(fù)合物的拉曼光譜如圖2d所示。gqds和gqds/agnps在1344和1597 cmsymbolm 1附近均出現(xiàn)d帶和g帶的特征峰。由于agnps的表面拉曼增強效應(yīng)，gqds/agnps納米復(fù)合物d帶和g帶強度均明顯增強；同時gqds/agnps納米復(fù)合物id/ig的比值（1.59）遠高于gqds（0.90），說明由于gqds還原ag（nh3）+2過程中，gqds表面含氧基團的消耗和agnps的原位生成促使

12、gqds表面缺陷位點增多，導(dǎo)致其無序程度增大。 3.2 gqds/agnps的催化活性 以過氧化物酶底物tmb為顯色底物，h2o2為氧化底物，gqds/agnps為催化劑，通過監(jiān)測體系中tmb氧化物在652 nm處的吸光度，考察gqds/agnps納米復(fù)合物的類過氧化物酶的催化特性；同時，考察go/agnps的催化特性，h2o2濃度： 0.5 mmol/l； go/agnps和 gqds/agnps濃度： 250 g/ml。 concentration of h2o2： 0.5 mmol/l； concentrations of go/agnps and gqds/agnps： 250 g/m

13、l.并進行性能比較。go/agnps和gqds/agnps均可催化h2o2氧化tmb產(chǎn)生經(jīng)典的顯色反應(yīng)，其氧化產(chǎn)物顯藍色，在652 nm處有一個特征吸收峰。go/agnps和gqds/agnps均表現(xiàn)出快速的顏色響應(yīng)，這是因為石墨烯材料的芳香平面結(jié)構(gòu)和表面羧基基團使其具有較強的類過氧化物酶活性18。但在強酸條件下，由go割裂形成gqds時，其邊緣形成了更加豐富的羧基基團，gqds因而呈現(xiàn)出更強的類過氧化物酶活性，故gods/agnps在催化氧化tmb時，表現(xiàn)出更靈敏的催化氧化效果，在同樣條件下得到更高的響應(yīng)信號，如圖3所示。 催化反應(yīng)體系的ph值和反應(yīng)溫度對酶催化活性產(chǎn)生決定性影響，本研究對這

14、些影響因素進行了詳細考察，結(jié)果如圖4。當(dāng)溫度高于25時，gqds/agnps的類過氧化物酶活性隨溫度升高而略有下降。在ph 24范圍內(nèi)，gqds/agnps的催化性能隨ph值增大而增強，但ph 46時，隨著ph增大，其催化性能急劇降低，并在ph 6時完全失去催化作用。其原因可能是ph過大導(dǎo)致h2o2加速分解。后續(xù)研究中選擇ph 4.0的hac-naac緩沖液在25下進行反應(yīng)。 為分析gqds/agnps的催化機理，分別通過改變體系中tmb和h2o2濃度測定了顯色反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)。由圖5a和5b可知，gqds/agnps納米復(fù)合物催化反應(yīng)遵循典型酶催化反應(yīng)歷程即michaelis-mente

15、n動力學(xué)模型。利用lineweaver-burk雙倒數(shù)方程1/v=km/vmax（1/s+1/km）計算得到gqds/agnps催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率vmax和米氏常數(shù)km， 如表1所示。gqds/agnps對底物tmb和h2o2的km與其它報道的類過氧化物酶納米材料相當(dāng)，但均遠小于hrp。由于米氏常數(shù)km可反映酶與底物之間的親和性能， km值越大，親和能力越弱，反之亦然。上述結(jié)果說明gqds/agnps對tmb和h2o2的親和力較強。 圖5c和5d為不同tmb和h2o2濃度時得到的lineweaver-burk雙倒數(shù)曲線。gqds/agnps催化底物h2o2（tmb）顯色反應(yīng)的3條雙倒數(shù)曲線

16、基本平行。這表明以h2o2（tmb）為底物時，改變tmb（h2o2）濃度，lineweaver-burk雙倒數(shù)的斜率基本不發(fā)生變化，只有截距隨著tmb（h2o2）濃度的增大而減小。gqds/agnps納米復(fù)合物的催化反應(yīng)符合乒乓機理21，即gqds/agnps先與第一種底物結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，且在第二種底物反應(yīng)之前釋放出第一種底物。 3.3 分析應(yīng)用 基于gqds/agnps納米復(fù)合物的類過氧化物酶催化性質(zhì)，建立了簡單的h2o2比色定量分析方法。由圖6a可見，反應(yīng)生成的藍色產(chǎn)物的顏色隨h2o2濃度的增大而加深。在最優(yōu)實驗條件下，h2o2檢測分析的線性曲線如圖6b所示，在h2o2濃度0.5100 m

17、ol/l范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.18 mol/l。表2列出了一些納米粒子作為類過氧化物酶在h2o2檢測的分析性能，可以看到， gqds/agnps納米復(fù)合物的檢測性能較為優(yōu)良，同時相較于單一的n-gqds體系而言，gqds/agnps納米復(fù)合物由于表面agnps的原位生成，導(dǎo)致其類過氧化物酶活性更強，因而對h2o2表現(xiàn)更高的檢測靈敏度。 基于gox能夠催化葡萄糖產(chǎn)生h2o2，本方法也可用于對葡萄糖的分析檢測。圖7a為葡萄糖定量分析的標準曲線，在6200 mol/l范圍內(nèi)， 葡萄糖濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系，檢出限為1.6 mol/l。圖7b表明葡萄糖濃度為0.2 mmol/l

18、時，2 mmol/l果糖（fru）、乳糖（lac）、蔗糖（sac）、纖維二糖（cel）和麥芽糖（mal）對葡萄糖測定的干擾情況。由于gox酶催化的專一性，本方法對葡萄糖的檢測具有良好的選擇性。 fru： 果糖， lac： 乳糖， sac： 蔗糖， cel： 纖維二糖， mal： 麥芽糖。 fru： fructose， lac： lactose， sac： saccharose， cel： cellobiose， mal： maltose. 將本方法用于人體血清樣品中葡萄糖含量的分析測定，結(jié)果見表3，測定結(jié)果與標準方法的測定結(jié)果一致，說明本方法能夠應(yīng)用于實際樣品中葡萄糖的檢測分析。 4 結(jié) 論

19、以石墨烯量子點（gqds）為還原劑和穩(wěn)定劑，在其表面原位生長銀納米粒子（agnps），制備了gqds/agnps納米復(fù)合物。gqds/agnps具有優(yōu)良的類過氧化物酶催化活性，能夠快速催化h2o2氧化tmb顯色，其催化動力學(xué)遵循michaelis-menten動力學(xué)模型，催化機理符合乒乓機制。gqds表面和邊緣豐富的羧基基團，使gqds/agnps較go/agnps具有更強的催化性能。基于gqds/agnps的酶催化活性建立了h2o2和葡萄糖的比色檢測方法，可成功用于血樣中葡萄糖的測定。gqds表面原位生長納米粒子的方法不僅為納米粒子的穩(wěn)定制備提供了一種有效方案，并為進一步拓展gqds的應(yīng)用范

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