固相萃取―高效液相色譜法測定漁業(yè)水體中16種多環(huán)芳烴

1、固相萃取高效液相色譜法測定漁業(yè)水體中 16 種多環(huán)芳烴摘要：漁業(yè)水體樣品經(jīng) HLB 小柱凈化和富集，采用 熒光-紫外檢測器串聯(lián)方法對多環(huán)芳烴進(jìn)行檢測，結(jié)果表明， 高效液相色譜分析方法對 16 種多環(huán)芳烴分離效果好，檢出 限（LOD ）為0.0010.01卩g/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.2% 9.5% （ n=6）,加標(biāo)回收率為 72.1%98.3%。該方法重現(xiàn)性 和選擇性較高，對水體多環(huán)芳烴的殘留測定具有很好的應(yīng)用 前景。關(guān)鍵詞：固相萃??；高效液相色譜法；多環(huán)芳烴；漁業(yè) 水體中圖分類號： X131.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1002-1302（2015） 01-0280-04收稿日期：

2、2014-01-08 基金項(xiàng)目：湖南省養(yǎng)殖業(yè)科研項(xiàng)目（編號： 201115）。 作者簡介：萬譯文（1984），男，湖南張家界人，碩 士，助理研究員， 從事食品質(zhì)量與環(huán)境分析化學(xué)研究。 E-mail ： cnjs3385。通信作者：黃向榮，副研究員，從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全和漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測研究。E-mail : 。多環(huán)芳烴（PAHs）類化合物是一種性質(zhì)穩(wěn)定、惰性較強(qiáng)的碳?xì)浠衔?，具有疏水性、半揮發(fā)性及難降解等特點(diǎn)，容易在生物體 內(nèi)富集 1-3 。 PAHs 能抑制植物的生長，對人類有明顯的致 癌、致畸、致突變效應(yīng)，已成為世界范圍的研究熱點(diǎn) 4-5 。 歐盟食品科學(xué)委員會與美國環(huán)保局（ USEPA ）

3、在 2002 年將 16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物，我國環(huán)保總局將其中7種PAHs 列入優(yōu)先控制污染物名單。我國是漁業(yè)大國，也是世界上最大的漁業(yè)養(yǎng)殖國，隨著 我國工業(yè)化及城市化的快速發(fā)展，燃煤、燃油被廣泛應(yīng)用， 產(chǎn)生的污染物不斷排入水域中，對漁業(yè)養(yǎng)殖帶來很大危害， 并影響我國水產(chǎn)品出口和人民身體健康。目前，多環(huán)芳烴的 檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS ）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法（ LC-MS ）等6-11。徐媛等采用氫火焰離子化檢測 器（FID）氣相色譜法對海水中多環(huán)芳烴進(jìn)行檢測12;牛宏亮等利用氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （

4、FID-GC-MS ）測定烤羊肉 串中的多環(huán)芳烴 13 ;林直宏等采用高效液相色譜 -紫外法測 定油漆中的 16 種多環(huán)芳烴 14，但不能滿足水體中低濃度樣 品的分析要求; 孫秀梅等采用高效液相色譜 -熒光法測定水產(chǎn) 品中的 15種多環(huán)芳烴 15 ，雖能滿足水體中低濃度樣品的分 析，但苊烯在熒光檢測器上沒有響應(yīng)，且采用單一波長不能 測定除苊烯外的15種PAHs、梯度洗脫效果不佳。氣相色譜法對高溫下易分解的高環(huán) PAHs 檢測靈敏度不高、回收率不理想； 采用氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各種 PAHs 能獲得較為理想的回收率和精密度， 但前處理復(fù)雜， 耗時(shí)長， 有機(jī)溶劑使用多；高效液相色譜法可選紫外

5、和熒光檢測器用 于環(huán)境中 PAHs 的測定。本試驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)對水樣進(jìn) 行處理，通過對試驗(yàn)條件篩選和試驗(yàn)方法改進(jìn)，利用高效液 相色譜 -熒光紫外聯(lián)測定漁業(yè)水體中的16 種多環(huán)芳烴，以期縮短前處理時(shí)間，提高試驗(yàn)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對多環(huán)芳烴的快速 檢測。1 材料與方法1.1 儀器與試劑Waters Alliance 2695 高效液相色譜儀， 配備 2489 紫外可 見光檢測器和 2475多波長熒光檢測器；4.6 mm X 250 mm、5 卩m Waters LC-PAH柱；高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司生 產(chǎn)；氮?dú)獯祾邇x，美國 Organomation 公司生產(chǎn)；固相萃取裝 置，美國 Agilen

6、t 公司生產(chǎn)；整套過濾抽濾裝置，天津奧特 賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)；循環(huán)水式多用真空泵 SHZ-D（川），鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)。 萘、苊、菲、蒽、芴、芘、 、熒蒽、苊烯、苯并 a 蒽、 苯并b熒蒽、苯并k熒蒽、苯并a芘、二苯并a, h蒽、苯 并g , h, i?p和茚并1 , 2, 3-cd芘共16種多環(huán)芳烴混合標(biāo) 液，濃度 200 mg/L ，美國 Accustandard 公司生產(chǎn)；甲醇色譜 純、乙腈色譜純,德國 Merck 公司生產(chǎn)；二氯甲烷色譜純,美國Tedia公司生產(chǎn)；HLB 6 mL/500 mg 固相萃取小柱，美國 Waters 公司生產(chǎn)。1.2 樣品前處理樣品采集與改性劑用

7、量篩選取樣點(diǎn)水深1.53 m,將采集的水樣用干凈的棕色玻璃容器盛裝，加入不同濃度甲 醇作為有機(jī)改性劑并進(jìn)行篩選。水樣置于暗處，4 C冰箱保存，并在 24 h 內(nèi)盡快進(jìn)行樣品預(yù)處理。樣品處理?xiàng)l件篩選將 1 L水樣加標(biāo)樣通過 0.45卩 m 水相濾膜過濾；分別取 C18、HLB、MCX、Alumina-N4 種固相萃取柱 500 mg/6 mL 依次通過 5 mL 甲醇、10 mL 水 活化小柱，將過濾好的水樣分別以5、8、10、20 mL/min 左右流速通過萃取柱； 依次用 5 mL 水、2 mL 5% 甲醇淋洗以除 去水溶性干擾物質(zhì)， 抽干小柱， 使吸附好的 SPE 柱徹底干燥； 分別采用

8、4 mL 二氯甲烷 1 次、4 mL 二氯甲烷 2次和 9 mL 二氯甲烷 3 次共 3 種方式進(jìn)行洗脫，洗脫液用不同溫度氮?dú)?將溶劑吹干或濃縮至約 0.5、0.1 mL 3 種情況，加入 1.0 mL 乙腈混勻，過0.22卩m濾膜。1 L待測水樣用最佳條件進(jìn)行 處理。1.3色譜條件優(yōu)化歐盟規(guī)定 16 種多環(huán)芳烴采用 Waters 2695熒光檢測器檢 測，由于苊烯熒光響應(yīng)值低， 但在紫外檢測器中響應(yīng)值較高， 因此，采用熒光和紫外串聯(lián)的方法對 16 種多環(huán)芳烴進(jìn)行檢測，通過試驗(yàn)分析對色譜條件予以優(yōu)化1.4 多環(huán)芳烴測定采用 2475 多波長熒光檢測器，程序定時(shí)控制熒光檢測 波長變化，測定除苊烯

9、以外的 15 種多環(huán)芳烴（表 1）；采用 2489 紫外可見光檢測器， 與熒光檢測器串聯(lián)， 于波長 229 nm 處檢測定苊烯。2 結(jié)果與分析 2.1 改性劑用量篩選PAHs 在水中溶解度較低，在水樣采集過程中加入甲醇 作為改性劑，可以改變目標(biāo)物在水中的溶解性，增加 PAHs 在固相萃取柱填料表面的吸附能力，可以提高對目標(biāo)物的提 取效率。比較水樣中分別加入 0%、5%、10%、15% 4 種甲 醇用量對 PAHs 回收率的影響，由圖 1 可見，水樣不加入甲 醇，16種PAHs回收率為47.6%68.3% ;分別加入5%、10%、 15%甲醇，16種PAHs回收率分別為 51.8%73.5% 6

10、8.6% 902%、59.7%79.3%;添加 10%甲醇作為改性劑可使 16種 PAHs 溶解度得到較大改善， PAHs 回收率提高，但當(dāng)甲醇加 入量過大時(shí)，部分 PAHs 會隨水樣直接通過小柱而不被小柱 吸附，導(dǎo)致回收率降低。2.2 水樣固相萃取處理?xiàng)l件篩選HLB 固相萃 取小柱對 16 種 PAHs 的回收相對最好，回收率為 60.8%88.6%；普通 C18 柱對 PAHs 中菲和蒽、苯并 b 熒蒽和苯并 k 熒蒽的分離效果不好。 HLB 固相萃取柱是一種高效、 通用 的反相吸附劑，可提取各種不同樣品基質(zhì)中酸性、中性及堿 性物質(zhì)，操作性能穩(wěn)定且具有大的樣品容量，可獲得較高的 回收率。2

11、.2.2 洗脫方式篩選對目標(biāo)物洗脫方式進(jìn)行試驗(yàn)， 結(jié)果表 明，4 mL 二氯甲烷進(jìn)行 1次洗脫， 目標(biāo)物洗脫不完全， 還有 部分目標(biāo)物殘留在組合 SPE 柱上； 4 mL 二氯甲烷分 2 次( 2 x 20 mL )洗脫，目標(biāo)物被完全洗脫，回收率良好；9 mL二氯甲烷分3次(3X 3.0 mL)洗脫，回收率與2次洗脫淋洗幾 乎相同。因此，試驗(yàn)選擇操作簡單、節(jié)約試劑的 2 次洗脫方 式。2.2.3 水樣上樣流速篩選比較上樣流速分別為5、8、10、20 mL/min 對目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)流速小于10 mL/min 時(shí)，回收率比較穩(wěn)定；流速大于 10 mL/min ，部 分 PAHs

12、的回收率降低，這可能是由于流速過快，部分目標(biāo) 物來不及吸附在小柱填料上。因此，試驗(yàn)采用上樣流速為 8 mL/min 。224氮吹條件的考察將 PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度 水浴中進(jìn)行氮吹，結(jié)果表明，水浴溫度高低對 PAHs 無明顯 影響；水浴溫度適當(dāng)提高，能夠加快氮吹速度，縮短前處理 時(shí)間，因此，為減少氮吹過程帶來的影響，試驗(yàn)采用60 C水浴氮吹。比較氮吹過程中溶劑濃縮程度對 PAHs 回收率的 影響，結(jié)果表明， 溶劑吹干會大大降低萘、 苊、芴、菲等 PAHs 的回收率，將溶劑濃縮至約0.1 mL時(shí)PAHs回收率較好。2.3 色譜條件優(yōu)化采用Waters的PAH專用柱，對流動相、柱溫及流速等

13、 因素進(jìn)行優(yōu)化。 由圖 3、圖 4可見，色譜條件為 Waters LC-PAH 色譜柱，柱溫30 C,進(jìn)樣量20卩L,流動相A為乙腈，B 為超純水，流速為1.2 mL/min ,洗脫梯度為011 min 60%A、 11 20 min 60 %A 90%A、21 32 min 90%A , 16 種多環(huán)芳 烴均能得到較好的分離。2.4 線性方程與檢出限配制 0.001、 0.005、 0.01、 0.02、 0.05、 0.1 mg/L 系列標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液，以待測物濃度X ( mg/L )為橫坐標(biāo)，待測物峰面積 Y 為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到 PAHs 回歸方程和相 關(guān)系數(shù)。由表 2可知，P

14、AHs在0.0010.1 mg/L范圍內(nèi)，線 性關(guān)系良好，可滿足定量分析要求。以苯并(a)芘計(jì)，在500 mL純水中添加 0.1 mg/L PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 2卩g,對 樣品進(jìn)行處理和濃縮， 3 倍信噪比( S/N=3 )得到檢出限 LOD 為 0.001 001 卩 g/L。2.5回收率與精密度以苯并(a)芘計(jì)，在空白樣品中添加1.0 mg/L PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0、100卩L,每個(gè)添加水平重復(fù) 3次，每次平行測定6次，由表3可見，PAHs回收率為72.1%98.3% , 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.2%9.5%。2.6實(shí)際樣品測定由表 4 可見，經(jīng)檢測，長沙市水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地水樣中含 有

15、萘、苊、芴、菲、熒蒽、芘、共 7 種多環(huán)芳烴物質(zhì)，其中， 以芘含量最高，為 38.9 ng/L。3 結(jié)論 通過對固相萃取過程及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立固相萃 取-高效液相色譜法檢測漁業(yè)水體中PAHs 的含量。結(jié)果表明，在0.0010.1 mg/L范圍內(nèi)，該方法檢測PAHs線性關(guān)系良好， 檢出限LOD在0.0010.01卩g/L之間；在不同添加水平下， PAHs各組分平均回收率為 72.1%98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.2%9.5%， 可滿足漁業(yè)水體中微量和痕量 PAHs 表 216 種 PAHs 的線性范圍和靈敏度目標(biāo)物線性范圍(mg/L )線性方程 r2LOD(卩 g/L )萘 (NAP )

16、 0.001 0.1丫=3.301 42+0.23126X0.999 60.010 苊烯 (ACY)0.0010.1Y=-1.425 11+1.03091X0.999 80.010 苊53X0.999 80.003 芴33X0.999 80.003 菲149X0.999 60.001 蒽(ACE ) 0.001 0.1丫=39.763 10+2.337 (FLU ) 0.001 0.1Y二3.528 34+3.174 (PHE) 0.001 0.1丫=0.216 84+0.326(ANT ) 0.001 0.1丫=44.000 7+10.34853X0.999 80.003 熒蒽(FLT) 0

17、.001 0.1丫=11.256 4+1.75375X0.999 60.002 芘 (PYR) 0.001 0.1丫=3.529 52+0.552 13X0.999 90.001 苯并a蒽 BaA0.001 0.1丫=0.027 65+2.838 61X0.999 90.002(CHR)0.0010.1Y=0.271 23+1.46083X0.999 90.002 苯并b熒蒽 (BbF) 0.001 0.1Y=0.199 36+0.735 16X0.999 90.002 苯并k熒蒽(BkF ) 0.001 0.1Y二0.107 48+5.568 51X0.999 70.001 苯并a芘 (Ba

18、P) 0.001 0.1Y二0.173 02+4.369 15X0.999 90.001 二苯并a , h 蒽 (DBA)0.0010.1Y=-0.162 36+2.346 33X0.999 90.002 苯并g, h, i?p ( BPY) 0.001 0.1Y二0.138 87+1.018 97X0.999 80.002 茚并1 , 2, 3-cd芘 (IND ) 0.001 0.1Y二0.052 488+0.225 11X0.999 70.010表 3PAHs 在空白樣品中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( n=6 )目標(biāo)物10.0卩g/L100卩g/L回收率( % )相對標(biāo)準(zhǔn) 偏差( %)回

19、收率( % )相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( %)萘苊烯 (ACY)芴 (FLU) 蒽 (ANT) 芘 ( PYR )85.94.988.15.4 苯并a蒽 (BaA) (CHR )92.62.780.74.8 苯并b熒蒽 (BbF) 苯并k熒 蒽(BkF ) 苯并a芘 (二苯并a ,h蒽(苯并g,h,?p (BPY )84.62.985.43.8 茚并1 , 2, 3-cd芘 (IND ) 的分析要求。參考文獻(xiàn)：1 Bertolotto R M ，Ghioni F，F(xiàn)rignani M ，et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons in surficial coastal

20、 sediments of the Ligurian SeaJ. Marine Pollution Bulletin ， 2003， 46( 7)： 907-913.2 Tripathi R ，Kumar R，Mudiam M K ，et al. Distribution ， sources and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in the sediment of the river Gomti ， Lucknow ， IndiaJ. Bulletin of Environmental Contamination a

21、nd Toxicology ， 2009， 83(3)：449-454.3 盧騰騰，林欽，柯常亮，等. 珠江口伶仃洋水域沉積物中多環(huán)芳烴及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià) J. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2012， 19( 2)：336-347.4 陳世軍，祝賢凌，馮秀珍，等. 多環(huán)芳烴對植物的影響J.生物學(xué)通報(bào)，2010, 45 (2): 9-11.表 4 漁業(yè)水體中 PAHs 的含量( n=3)目標(biāo)物含量(ng/L )萘(NAP ) 25.4 6.79 苊烯 (ACY )ND 苊 (ACE)13.24.06 芴 (FLU )16.57.20 菲 (PHE) 33.0 土 1.06 蒽(ANT )ND 熒蒽(FLT)3

22、3.5 土 3.92 芘(PYR) 38.9 土 2.74 苯并a蒽 (BaA) ND (CHR) 8.41 2.10 苯并 b熒蒽(BbF) ND 苯并k熒蒽(BkF ) ND 苯并a芘(BaP) ND 二苯并a, h蒽 (DBA ) ND 苯并g , h, i?p ( BPY) ND茚并1 , 2, 3-cd芘 (IND ) ND注：ND表示未檢測到。5 Doong R A ， Lin Y T. Characterization and distribution of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminations in surface sediment and water from Gaoping River , TaiwanJ. Water Research, 2004, 38(7)： 1733-1744.6 肖海清,王宏偉,王超,等. 氣相色譜質(zhì)譜法測定化妝品中 9 種多環(huán)芳烴 J. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2012, 31( 7)： 43-46.7 蔡素婷,楊三明,郭志順 . 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測