土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選及淀粉酶活力的測定

1、微生物綜合實驗報告土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選及淀粉酶活力的測定學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院班級：生物技術(shù)121班姓名：學(xué)號： 一， 摘要本次實驗選取廣大的土壤，使用五點法采樣，并制備出土壤懸液。然后將土壤懸液的上清液分四個梯度稀釋，使用平板劃線法反復(fù)進行分離純化，得到純凈的菌株。我們得到菌株后，采用形態(tài)學(xué)的辨別方法，單染色，芽孢染色，革蘭氏染色，淀粉水解實驗，溫度實驗，糖類發(fā)酵試驗（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），vp試驗，mr試驗，吲哚試驗，檸檬酸鹽利用實驗，耐鹽性試驗，硝酸鹽還原實驗，明膠液化試驗，運動性穿刺試驗，酪素水解試驗，卵黃實驗等方法檢驗，查閱伯杰氏手冊后，鑒別其為蜂房芽孢桿菌。二，材料

2、與方法1 材料1.1 試劑碘原液：碘1lg，碘化鉀22g，加水定容至50oml；單染色：草酸銨結(jié)晶紫或石炭酸復(fù)紅；革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液，盧戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黃染色液。芽孢染色：5%孔雀綠染色液，0.5%沙黃染色液。v.p試驗：40%naoh 溶液，-奈酚。吲哚試驗：乙醚，吲哚試劑。硝酸鹽試驗：甲液（對氨基苯磺酸0.8g+5mol/l醋酸100ml；乙液（-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100ml）；酪素水解：牛奶；酪氨酸水解：l-酪氨酸；淀粉酶活力測定：1% 3,5-二硝基水楊酸試劑。1.2儀器：無菌培養(yǎng)皿，接種環(huán)，土樣，三角瓶，燒杯，試管，酒精燈，無菌吸管，載玻片，

3、吸水紙等。恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌箱，超凈工作臺，水浴箱，磁力攪拌器，涂布器，顯微鏡，移液管，移液槍。1.3 培養(yǎng)基篩選及活化培養(yǎng)基淀粉20 g，蛋白胨10 g，nacl 2.5 g，瓊脂10 g，自來水1000 ml, ph 自然。斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，nacl 5 g，瓊脂1520 g，自來水1000 ml，ph 7.27.4；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基稱取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏03 g，氯化鈉05 g溶于100 ml蒸餾水中。ph自然；蛋白胨液體培養(yǎng)基（作吲哚實驗用）蛋白胨10 g，nacl 5 g，自來水1000 ml，ph 7.27.4，121 滅

4、菌20 min；葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（vp和mr試驗用）蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，nacl 5 g，自來水1000 ml，ph 7.27.4，121 滅菌20 min；糖發(fā)酵培養(yǎng)基（作細菌糖發(fā)酵試驗用）蛋白胨2 g，nacl 5 g，k2hpo4 0.2 g，1%溴麝香草酚藍水溶液3 ml，待試糖10 g(一般糖或醇按1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入)，自來水1000 ml，ph 7.27.4；酪氨酸平板（作酪氨酸水解試驗用）l酪氨酸0.5g懸浮于10ml蒸餾水中，20分鐘滅菌，然后于100ml無菌的營養(yǎng)瓊脂混合，即成酪氨酸水解平板；酪素平板（作酪素水解試驗用）取5g脫脂奶

5、粉加入50ml蒸餾水中（或用50ml脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50ml蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至4550時，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板；西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)液（作檸檬酸鹽利用試驗用）檸檬酸鈉2 g，nacl 5 g，mgso47h20 0.2 g, k2hpo43h20 1 g,(nh4)2hpo4 1 g, 1%溴麝香草酚藍水溶液10 ml，瓊脂1520 g，自來水1000 ml，ph 7.0 , 121 滅菌20 min；淀粉牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基可溶性淀粉2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，nacl 5 g，瓊脂1520 g，蒸餾水1000 ml，ph 7.27.4；（

6、2%、5%、7%）高鹽培養(yǎng)基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，nacl（ 2g、5g、7g），瓊脂1520 g，蒸餾水1000 ml，ph 7.27.4；明膠培養(yǎng)基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明膠12g，蒸餾水1000 ml ，ph 7.0；半固體培養(yǎng)基（作運動性實驗用）瓊脂含量0.5%，其他組分比例按牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制；2 方法2.1 土樣的采集選取廣大梅苑公寓樓下花園、廣大生化樓前小河附近兩處的土壤，五點法采集，邊長15cm。鏟去表層土，取10cm深土壤，每一個土樣約25g 左右（每個點5g）。將土樣放入無菌的紙袋中,并記錄采集的時間、地點、植被類型,4 保存?zhèn)溆谩?.2 土壤樣品懸液制

7、備2.2.1 土壤懸液制備各稱取5 g 土壤樣品于裝有45ml 無菌水的100ml錐形瓶中，加入玻璃珠與土壤懸液一起振蕩, 制成土壤懸液。置100沸水浴10 min，以殺死非芽孢桿菌。靜置5min。2.2.2 土壤懸液稀釋吸取上清液0. 5 ml 加到含有49. 5 ml 無菌水的三角瓶中,配成10 - 3 g/ ml 的土壤懸液,并進一步稀釋至10 - 4g/ ml 和10 - 5g/ ml。2.3 分離純化2.3.1 芽孢桿菌屬的純培養(yǎng)分別吸取不同稀釋度的土壤懸液0. 2 ml 于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，用無菌玻璃涂棒涂布均勻。每個稀釋度3 個重復(fù),37 倒置培養(yǎng)24h。每個土樣隨機挑取2

8、0 個形態(tài)特征不同的單菌落,在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上劃線純化。菌落的形狀、顏色、質(zhì)地、透明度一致,菌體形態(tài)為直桿狀,長度均一、寬度一致,并能產(chǎn)生芽孢時,確認為芽孢桿菌屬的純培養(yǎng)物。單染色鏡檢步驟：涂片、干燥及固定；染色：在涂有菌種的載玻片上滴加適量的草酸銨結(jié)晶紫染色液或石炭酸復(fù)紅液，染1 min，傾去染液，用水沖洗至無染色液顏色為止。鏡檢：用油鏡觀察染色結(jié)果；芽孢染色鏡檢步驟：取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人35滴5%孔雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約4-5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染

9、料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min，水洗。制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。觀察芽孢的形狀和位置.將篩選出的菌株接種于肉湯瓊脂斜面，37培養(yǎng)18-20h。2.3.2 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選淀粉水解實驗對通過單染色和芽孢染色的鏡檢得到的純培養(yǎng)的芽孢桿菌進行淀粉水解實驗，并從中篩選出水解圈較大的6株菌作為目的菌，進行后續(xù)實驗。具體步驟如下：挑取菌種，采用點解法接種于可溶性淀粉培養(yǎng)基中，每兩種菌做一個平板，并做一次平行實驗和空白對照組。將接種完成的平板置于37恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h。2.3.3 菌株保藏 將篩選出的菌株接種于肉湯瓊脂斜面，4下保

10、存待用。2.4初步鑒定2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定將所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài) 、高度 、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進行一系列的鏡檢革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合芽孢桿菌的指標(biāo)。革蘭氏染色經(jīng)查閱伯杰氏手冊，芽孢桿菌屬基本為革蘭氏陽性菌。由此，運用革蘭氏染色技術(shù)，將不被脫色而保留初染劑的顏色（紫色）者篩選出來，初步縮小需要檢驗范圍。主要步驟：先用結(jié)晶進行出染，再加媒染劑碘液，以增加染料與細胞的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細胞膜上形成相對分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，然后用脫色劑乙醇進行脫色，最后用沙黃液復(fù)染，最后鏡

11、檢。2.42生理生化鑒定溫度對微生物生長的影響 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5 到2倍）。使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于平板劃線接種，分別在5，15，25，35，45，60，65條件下培養(yǎng)24h，觀察細菌是否生長。 糖類發(fā)酵試驗（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）取斜面培養(yǎng)菌種接種于37溫箱中培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基是否由紫變黃，杜氏小管中是否有氣泡，以證實菌株是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。imvic試驗（1）乙酰甲基甲醇試驗(vp試驗)取葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種37培養(yǎng)兩天， 取出以上試管，每管分別加入40naoh溶液10-20滴，并加等量-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37

12、恒溫箱中保溫15-30min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記為陽性（+）反應(yīng)，若不呈紅色，記為陰性（-）。（2）甲基紅試驗（mr試驗）取葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種37培養(yǎng)兩天，取出以上試管，每管分別加入甲基紅2滴，震蕩，若培養(yǎng)液呈紅色，記為陽性（+）反應(yīng)，若不呈紅色，記為陰性（-）。（3）吲哚試驗取蛋白胨水培養(yǎng)基,接種，37度培養(yǎng)2天，在培養(yǎng)基中加入乙醚12ml,經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為吲哚試驗陽性（+），否則為陰性（-）。（4）檸檬酸鹽利用實驗取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面的試管，分別將少量

13、菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性（+），若培養(yǎng)基無變色，則為陰性（-）。耐鹽性試驗將分離獲得的細菌分別接種在nacl濃度為2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置37下培養(yǎng),觀察生長情況 ，并做記錄。硝酸鹽還原實驗被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35培養(yǎng)l4d.將甲、乙液等量混合后（約0.1 ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。明膠液化試驗穿刺接種，深度至明膠層2/3處，于37溫箱培養(yǎng)24h.。取出靜置冰箱中待其凝固后，再觀察其是否被細菌液化，如被液化,則為陽性,能產(chǎn)生蛋白酶。運動性

14、試驗使用半固體營養(yǎng)瓊脂試管，將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自上而下直刺到離管底11.5cm處,沿原穿刺線拔出接種針。于37溫箱培養(yǎng)24h，觀察是否產(chǎn)生樹根狀生長，若有，則菌株有鞭毛，若直立生長，則菌株無鞭毛。酪素水解試驗（酪蛋白水解）牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50ml蒸餾水中（或用50ml脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50ml蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至4550時，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點接在平板上，每皿可點接35株菌。37培養(yǎng)，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。酪氨酸水解實驗 將營養(yǎng)瓊脂融化，冷卻至溫?zé)?，與l-酪氨酸混勻

15、，分別將菌種點接在平板上，37培養(yǎng)24h。記錄菌落周圍是否有透明圈，若有，則菌株能夠水解酪氨酸。2.4.3菌種鑒定根據(jù)從伯杰式細菌學(xué)手冊芽孢桿菌屬中檢索到的芽孢桿菌的生理生化特點，選取能從土壤中分離到的芽孢桿菌種為標(biāo)準(zhǔn)菌種，其生理生化特征如下表：通過對目的菌種進行多項生理生化實驗，對比伯杰式手冊的實驗結(jié)果，從而鑒定出目的菌的種別；2.5酶活測定2.5.1 菌株活化將分離純化的菌種接種在營養(yǎng)牛肉湯培養(yǎng)基的試管中，37培養(yǎng)12h，中間搖震35次。2.5.2 初檢將上述培養(yǎng)好的液體管菌種用滴種法接種于淀粉酶試驗培養(yǎng)基中，每個菌種接兩個板，爭取平板上一定要出現(xiàn)5個以上的單個菌落，以易于觀察測量和計算透

16、明圈。將接好的上述平板置于恒溫箱中37培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的平板取出，分別滴加現(xiàn)配制的魯格爾氏碘溶液，直至全部彌漫平板。稍停片刻，觀察其菌落形成的透明圈。2.5.3 復(fù)選 采用3,5-二硝基水楊酸顯色法進行測定。2.5.3.1 粗酶液的制備將活化的芽孢桿菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)12h，然后以5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，160rpmmin，37，48h。發(fā)酵24h后補加碳酸鈣使整個發(fā)酵過程中碳酸鈣的含量大約保持在0.02。離心(4000rpmmin，20min)、收集上清液即為待測粗酶液。2.5.3.2 淀粉酶活力的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取7 支20 ml 預(yù)先潔凈滅菌干燥的

17、有刻度試管，編號，加入試劑見表1。每個濃度做3 個平行樣本。搖勻，至沸水浴中煮沸5 min。取出后冷卻，加蒸餾水定容至20 ml，以1 號管作為空白調(diào)零點，在520 nm 的波長下比色測定吸光度值，并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 表1 淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管號1234567標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液/ml00.20.61.01.41.82.0蒸餾水/ml2.01.81.41.00.60.20麥芽糖含量/ml00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水楊酸/ml2.02.02.02.02.02.02.0粗酶液淀粉酶活力測定按以下順序操作：取20ml具塞刻度試管，預(yù)先潔凈

18、滅菌干燥、編號。取粗酶液100ml，2的可溶性淀粉l ml，蒸餾 3ml，于60水浴中預(yù)熱5min。加01 moll檸檬酸緩沖液(ph6.0) l ml，于60水浴中保溫30min。加入1.5ml 3，5-二硝基水楊酸，沸水中5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml?？瞻讓φ占影l(fā)酵液后加ph36以下的酸鈍化淀粉酶，使酶失活，其余步驟同上。定容后，搖勻，用分光光度計測定od520的值。在上述條件下以單位體積樣品在30min釋放l毫克麥芽糖所需的酶量為一個麥芽糖單位(mmu)表示酶活性。三， 結(jié)果與分析1， 形態(tài)學(xué)肉眼觀察為白色，花狀，半透明，邊緣光滑，能被接種環(huán)挑起。2， 革蘭氏染色經(jīng)過革蘭氏

19、染色后，在顯微鏡上觀察，發(fā)現(xiàn)該菌顏色為紫色，呈桿狀，且附近有透明顆粒，這些透明顆粒應(yīng)為脫落的芽孢。3， 芽孢染色在顯微鏡上觀察，小部分的菌呈紫色，大多數(shù)的菌兩邊為紫色，中間為綠色。分析：小部分的菌未成熟，沒有長出芽孢或芽孢脫落;大多數(shù)的菌長出芽孢，中間綠色的為芽孢。芽孢染色需要注意初染時玻片不要離火源太近，我在染色時就弄碎了玻片。且復(fù)染要注意時間，不然芽孢不能被染綠。4，溫度對微生物生長的影響 平板劃線接種，分別在不同時間條件下培養(yǎng)24h。發(fā)現(xiàn)5，10，15，50，55，60沒有細菌長出。45的菌生長茂盛，長出8個菌落，乳白色，花狀。40長出4個菌落，體型較大，為乳白色。30長出4個菌落，中間

20、透明，邊緣白色。25長出4個菌落，體型較小，乳白色，呈云狀。20的菌只有一小點，乳白色。分析：根據(jù)生長情況，該菌的生長適宜溫度為20-45左右。5，糖類發(fā)酵試驗葡萄糖發(fā)酵實驗中，空白試管溶液為紫色，小試管沒有氣泡，1，2號管溶液變?yōu)槌赛S色，小試管沒有氣泡。阿拉伯糖發(fā)酵實驗中，空白試管溶液為紫色，小試管沒有氣泡，1，2號對照試管溶液為紫色，小試管沒有氣泡。木糖發(fā)酵實驗中，空白試管，1，2號試管溶液為紅色，小試管沒有氣泡。甘露醇發(fā)酵實驗中，空白試管溶液為紫色，小試管沒有氣泡，1，2號對照試管溶液為紫色，小試管沒有氣泡。分析：該菌菌能利用葡萄糖進行發(fā)酵產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣。而對于阿拉伯糖，木糖，甘露醇，它

21、不能利用。桿菌對不同糖的利用情況可以判斷其為哪種菌，是一項重要的生化試驗。6 ，vp試驗空白試管的上，下層溶液均為黃色，而1,2號試管溶液分層明顯，上層溶液為玫瑰紅色，下層溶液為黃色。分析：該菌vp試驗上層溶液為玫瑰紅色，呈陽性。7，mr試驗mr試驗中，空白試管溶液為黃色，1,2號試管的溶液顏色為黃色。分析：該菌mr試驗呈陰性。但三支試管的顏色深淺有所不同，可能是菌利用了一些葡萄糖的緣故吧。還是別的原因？8，吲哚試驗經(jīng)吲哚試驗后，空白試管上，下層溶液無色透明；1,2號試管溶液分層明顯，上層乙醚層交薄，下層溶液交深，上層溶液呈玫瑰紅色。分析：該菌吲哚試驗結(jié)果為陽性，說明該菌能產(chǎn)生吲哚。9，運動性

22、試驗使用半固體營養(yǎng)瓊脂試管，將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自上而下直刺到離管底11.5cm處,沿原穿刺線拔出接種針。于37溫箱培養(yǎng)24h，觀察到?jīng)]有直立根生長。分析：該菌株沒有鞭毛。10，耐鹽性試驗將分離獲得的細菌分別接種在nacl濃度為2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置37下培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)4個濃度都長有菌落，長菌程度分別為+，+，+，+分析：該菌耐鹽性不強，只能在2%，5%時長出菌落，而在10%nacl時，所長菌落數(shù)極小。11，酪素水解試驗（酪蛋白水解）發(fā)現(xiàn)菌落下的酪素已被分解而呈透明。長出4個菌落，其直徑分別為2.5,2.6,1.7,1.9分析：說明該菌能產(chǎn)生分解酪素的酶。12，酪氨酸水解實驗培養(yǎng)皿被污染，無法觀察結(jié)果。13，卵黃實驗24小時培養(yǎng)后，沒有發(fā)現(xiàn)有菌落生長。14，淀粉實驗48小時培養(yǎng)后，2個培養(yǎng)皿上的菌落生長旺盛，并且出現(xiàn)很大的透明圈。分析：該菌在淀粉實驗中能產(chǎn)生透明圈，說