重金屬毒作用發(fā)展方向

1、重金屬毒作用發(fā)展方向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是在細胞中由膜圍成的亞細胞器，是一個連續(xù)的膜囊和膜管 網(wǎng)。真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對大約 1/3 的新合成蛋白質(zhì)實行修飾、折疊和 寡聚化，從而使之形成準確的構(gòu)象，參與脂質(zhì)代謝和類固醇激素的合 成以及鈣的儲存，因而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的改變必將影響細胞功能，但細胞 機體也擁有一條適合性通路即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmicreticulumstress , ERS來應對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂 1。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能夠由多種干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的病理生理改變以及其他環(huán)境因素 變化引起，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白或多余蛋白過多、 脂類或糖脂代謝失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的氧化還原以及鈣離子等離子條件的 改變，而

2、各種化學污染物也已成為重要的誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的外界環(huán)境 因素。在自然界，金屬與兩性金屬的比重大約占80%。其中，一些金屬（如砷、汞、鉛、砣）只要在體內(nèi)蓄積就會產(chǎn)生潛在的毒性；另一些 金屬通過與氧、硫化物或氯化物形成化合物而具有毒性2。當前，金屬污染嚴重是我國面臨的主要環(huán)境問題。另外，在日常生活和職業(yè)活動 中，人們也不可避免地接觸一定量的金屬，但因為金屬引起的毒性機 制尚不十分清楚，當前尚缺乏有效的防治方法。因而探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 與金屬毒性的關系有助于探討金屬毒性機制，促動金屬毒理學的發(fā)展。 本研究將以幾種常見的金屬（如鉛、鎘、汞及甲基汞、鋁、鐵、錳、 鉻、鎳、鈾）作一綜述，為揭示常見金屬神經(jīng)毒性下

3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā) 生特點和開發(fā)相對應的化學保護劑提供參考資料。1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其相關的細胞應答信號通路ERS是指細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)或蛋白質(zhì)加工運輸障礙，引起生理功 能紊亂所致的一種亞細胞器應激反應過程。ERS可引起三種細胞應激效應：未折疊蛋白反應（UPR，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過激活這三條通路產(chǎn)生下游的五類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激效應：（ 1） 誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78及94（GRP78及 GRP94等分子伴侶蛋 白的表達，促動錯疊與未折疊蛋白恢復正常構(gòu)象、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì) Ca2評衡；（2）抑制蛋白質(zhì)翻譯，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生蛋白加工的負擔；(3)激活NF-k B的效應，可能促動

4、抗炎反應；(4)影響脂類代謝， 進而可能影響生物膜合成；( 5)持續(xù)過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)既含有促動凋亡的因子如半胱氨酸蛋白水解酶 -12 (Caspase- 12)、生長停滯和DNA損傷誘導基因-153(CHOP/GADD153等，也含 有抑制因子如Bax蛋白抑制劑-1(Baxinhibitorl)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)等。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過強時， 促凋亡機制占主導，能夠獨立地誘導細胞凋亡，其中， Caspase-12 是 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致凋亡的特異性標志 3, 4。在三種ERS反應中，UPF最為 常見，研究也最為深入。UPRS過激活其下游三條

5、信號通路來應對相對 應的應激(圖1)。UPR勺三條信號通路分別由三種類型的 ER駐留蛋 白起始：1型ER跨膜蛋白激酶(IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER 激酶(PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)。IRE1信號通路：當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 發(fā)生時，IRE1蛋白與GRP7盼離，IRE1激酶結(jié)構(gòu)域的反式自磷酸化活 化自身的內(nèi)切核酸酶活力，然后內(nèi)切核酸酶精確切割其唯一底物 酵母中人工染色體(mRNAHAC或多細胞動物中x-box連接蛋白 1(XBP1);剪接后，有活性的部分轉(zhuǎn)位入胞核，協(xié)助伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄。 通過這個通路不但編碼ER蛋白，折疊和修飾相關的酶，促動磷脂的合 成，還包括編碼與膜泡運輸相關的

6、蛋白，從而有利于非折疊蛋白的準 確折疊。PERK言號通路：PERK GRP7分離后，PERK激酶磷酸化真核 轉(zhuǎn)錄起始因子-2的a -亞基(elF2 a )，從而阻斷蛋白合成，降低了去 往ER的蛋白量，最終減輕了 ER實行蛋白加工的負擔。磷酸化的 eIF2 能夠優(yōu)先起始特定 mRNA勺翻譯(如ATF4mRNA。而這種mRNAS因上的特殊結(jié)構(gòu)起著重要的協(xié)調(diào)作用。ATF6信號通路:ATF6與GRP7盼離后，ATF6包被在膜泡中從ER轉(zhuǎn)移到高爾基體中， 并在高爾基體內(nèi)先后被S1P和S2P蛋白酶水解，釋放胞質(zhì)脫氧核糖核 酸結(jié)合區(qū)即ATF6f,然后ATF6f轉(zhuǎn)位入核，激活基因表達。ATF6引起 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

7、元件基因啟動子區(qū)域激活，轉(zhuǎn)錄出的蛋白包括伴侶蛋白 GRP78和 GRP94 蛋白二硫異構(gòu)酶(proteindisulphideisomerase,PDI)、轉(zhuǎn)錄因子 CHO和 Xbox-bindingprotein1(XBP1，從而有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非折疊蛋白恢復準確構(gòu)象。2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與幾種常見人體非必需金屬毒性的關系2.1 鉛2.1.1 神經(jīng)細胞在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（ C6 細胞）中，鉛暴露可上調(diào)GRP78勺mRNA口蛋白水平的表達，這可能和 GRP78W鉛可緊密結(jié)合， 將鉛隔離于非毒性位點相關；這也可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對鉛毒性的保護 機制6, 7。有研究發(fā)現(xiàn)，當以0.1和1卩mol/L的鉛處理C

8、6細胞7d后, 其GRP78mRNA平上調(diào)到對照組的2.53倍；而當以10卩mol/L的鉛 處理C6細胞7d后，Grp78mRN水平下調(diào)，與對照組相比減少 40%這 可能與高濃度鉛抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關；同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鉛處理的 GRP78 蛋白水平具有劑量和時間效應 7。張瑩等 8的研究結(jié)果顯示，鉛能夠使 C6細胞的Grp78蛋白表達增加；在0.2卩mol/L鉛染毒組中，染毒7和 30d的GRP7蛋白表達顯著增高，其余各個時間點均無顯著性變化；但 在1.0卩mol/L鉛染毒組中，染毒1d后GRP781白表達量開始顯著增 高，鉛染毒30d時已達到鉛染毒前的6.3倍；在2.0卩mol/L鉛染毒組 中，0

9、.5h開始GRP781白表達量即顯著增高，鉛染毒 7d時達到高峰， 是鉛染毒前的4.3倍，到30d時表達量又下降為鉛染毒前的2.6倍。 這可能是因為高表達的GRP781白能與鉛結(jié)合，將鉛大量蓄積于神經(jīng) 膠質(zhì)細胞中，從而可能對更為敏感的神經(jīng)元和其他細胞提供保護；但 在2.0卩mol/L鉛染毒30d時，GRP781白表達量下降，說明在鉛達到 一定濃度且在膠質(zhì)細胞中蓄積到一定量后，細胞的整體功能受損，蛋 白質(zhì)表達下降8。Qian等9采用Northern印跡方法分析1卩mol/L鉛 處理原代培養(yǎng)兩周的大鼠星形膠質(zhì)細胞 1周后的GRP7基因表達，發(fā) 現(xiàn)處理組的GRP78基因表達與對照組相比明顯上調(diào)。2.

10、1.2 血管內(nèi)皮細胞鉛（225卩mol/L ）處理血管內(nèi)皮細胞24h后， 發(fā)現(xiàn)GRP78W GRP94&基因和蛋白水平上的表達上調(diào)，并具有劑量 -效 應關系；同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10卩mol/L鉛處理后，GRP7和 GRP941白的表 達上調(diào)，并具有時間 -效應關系；同時，該研究進一步發(fā)現(xiàn)，鉛可通過 c-Jun氨基端激酶-活化蛋白-1 （JNK-AP-1）通路引起血管內(nèi)皮細胞中GRP7僑口 GRP9餐白的上調(diào)，這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異蛋白表達的上調(diào)提示 了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生 10。2.1.3NRK-52E細胞Stacchiotti 等11以腎小管細胞株 NRK-52E為模 型研究了鉛誘導的腎中毒，發(fā)現(xiàn) 60和

11、300卩mol/L的氯化鉛不能上調(diào) Hsp72蛋白的表達，但能誘導 GRP7蛋白的表達上調(diào)，從而提示鉛可選 擇性誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。在重組體肝癌細胞HepG2中，鉛暴露也可誘導GRP78和GADD15基因啟動子的上調(diào)，且具有劑量效應；在硝 酸鉛濃度為100卩mol/L時，GRP78基因啟動子上調(diào)到空白對照組的 3 倍 12。2.1.4 體內(nèi)研究除了以細胞為研究對象外，也有研究通過建立低水平 鉛暴露模型分析宮內(nèi)和哺乳期低水平鉛暴露對子代大鼠白細胞 GRP78 蛋白表達量的影響，探討鉛對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母鼠從 交配前 30d 起每天被灌胃 1ml(10mg/ml) 乙酸鉛溶液后，哺乳

12、期低水平 鉛暴露致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白 GRP781白表達增加；提示母鼠 體內(nèi)的鉛能夠通過妊娠和哺乳輸送到仔鼠的不同器官，從而改變白細 胞GRP781白的表達；推測母源性血鉛濃度的升高可改變幼鼠白細胞 中GRP781白的水平，這可能是鉛影響免疫功能的機制之一13。2.2 鎘2.2.1腎細胞Liu等14以LLC-PK1腎臟上皮細胞為研究對象評價了鎘 對GRP78蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)在用 10卩mol/L氯化鎘處理的細胞中, GRP7蛋白水平在6h開始升高，并持續(xù)升高到24h;當用1 20卩mol/L的氯化鎘處理細胞6h, GRP78蛋白的表達呈劑量依賴性增加； 同時，氯化鎘處理引起 URP下

13、游激活蛋白ATF4和磷酸化elF2的增加 另外也有研究顯示，在腎小球細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白 GADD15的表達在鎘暴露后4h開始上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關的凋亡基因 Caspase-12 及下游的 Caspase-3 在鎘暴露后 16h 被激活 15。2.2.2 肝細胞以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應性堿性磷酸酶 (ERstress-responsealkalinephosphatase , ES-TRAP為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生的靈敏生物標志物， Hiramatsu 等 16 分別從體內(nèi)、體外兩個方面探討了重金屬 （鎘、鈷、鎳等）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關系：在體外試驗中，以能夠穩(wěn)定 表達ES-TRAP勺大鼠腎臟NRK52E田

14、胞和小鼠肝Hepa-1c1c7細胞為模 型，給予氯化鎘處理 6h 后，發(fā)現(xiàn)鎘能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生，并且 表明ES-TRAP乍為重金屬誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生的標志物比其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 分子伴侶標志物敏感；在體內(nèi)試驗中，以ES-TRAP轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,發(fā)現(xiàn)急性暴露氯化鎘6h以后，肝臟和腎臟GRP78蛋白的表達顯著增加, 并在24h恢復到正常水平，同時，急性鎘暴露可導致血清ES-TRAP活力快速下降，與肝臟和腎臟中內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的表達趨勢相 反。2.2.3 其他研究有研究發(fā)現(xiàn)，15或30卩mol/L鎘處理NIHSwiss小鼠 胚細胞（NIH3T3細胞）3、6、9、12h后，能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生

15、不 同水準地改變，使 Caspase-12 被激活，且呈劑量 - 反應關系；并可抑 制細胞基質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣-ATP酶活力，誘導細胞凋亡，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒 體共同參與鎘誘導的細胞凋亡 17。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺細胞給予鎘一次性處理后，再連續(xù)實行鎘 處理則可增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白 GRP9啲誘導表達，且明顯高于一次性 預處理和空白對照，這可能與鎘預處理改變了細胞的敏感性，后續(xù)鎘 的連續(xù)處理激活了細胞應激蛋白表達的鎘特異性通路相關18。另外，Schroder等19以寄居蟹皮海綿為研究對象實行 0.01、0.1、1mg/L氯 化鎘分別處理0.5、1、3、6d,發(fā)現(xiàn)寄居蟹皮海綿能夠蓄積大量的鎘， 導致DNA

16、單鏈斷裂以及上調(diào)GRP78蛋白的表達，并且都具有時間-和劑 量-效應關系。2.3 汞和甲基汞在體外的研究中，Qian等7用氯化汞（Hg）處理C6細胞7d，發(fā)現(xiàn) 1卩mol/L的Hg就可引起GRP78mRNA平顯著性升高，達到對照組的 2.5倍，但當處理濃度達10卩mol/L時，GRP78mRNA平顯示了下降趨 勢；就GRP78蛋白水平來說，1卩mol/L的Hg就可顯著增加GRP781白 含量，染毒濃度為10卩mol/L的Hg則可使GRP781白含量達到對照組的2倍；為進一步探討無機汞誘導 GRP78表達的機制，該研究采用凝 膠遷移實驗（EMSA評價蛋白-DNA交互作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Hg處理細胞的抗氧

17、 化反應元件、激活因子和核因子 KappaB（NF-K B）與相對應蛋白的結(jié)合 水平增強，而且因為這些因子與抗氧化相關，因而提示氧化應激參與 了 Hg誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。有研究發(fā)現(xiàn)，在甲基汞暴露1416h的凋亡細胞中檢測到Caspase-12被激活，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在甲基汞暴 露9h后發(fā)生，而在甲基汞暴露早期（23h）細胞內(nèi)的活性氧增加， 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是發(fā)生在甲基汞細胞毒性的晚期事件，并且氧化應激 可能是誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的原因之一 20。2.4 鋁Ghribi 等 21 研究發(fā)現(xiàn)，在兔腹腔注射含鋁 25mmol/L 的 AlCl3 溶液 15d后，海馬GADD15和轉(zhuǎn)錄因子NF-K的核轉(zhuǎn)位增

18、多；同時，在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)和細胞核中，伴隨著這兩種蛋白的核轉(zhuǎn)位， Bcl-2 的表達水平降低； 該研究還發(fā)現(xiàn)，鋁暴露可激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異凋亡蛋白 Caspase-12 的活力。 張勤麗等 22研究發(fā)現(xiàn)，以 0.5、 1.0、 2.0mmol/L 氯化鋁能誘導神經(jīng)元 凋亡，并能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變形腫脹及脫顆?，F(xiàn)象，提示鋁對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可 產(chǎn)生應激效應。另外，在去除培養(yǎng)液中的鈣離子和使用鈣通道抑制劑 的情況下， Snyder 等 23 對麥芽酚鋁的肝細胞毒性實行了研究，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，利用毒胡蘿卜內(nèi)酯促動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子外流會降低麥芽酚鋁對 肝細胞的損傷，從而提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了鋁的細胞毒性。3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與常見人體必需

19、金屬的關系3.1 鐵在生物體內(nèi)，鐵是機體必需的微量元素，但鐵過量會引起組織損傷。Lou等24以大鼠為模型，每天腹腔注射葡聚糖鐵30mg/kg，持續(xù)9周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，心臟和肝臟中GRP78S白表達量和Caspase-12活力上調(diào)；同時，一次性腹腔注射 300mg/kg葡聚糖鐵，發(fā) 現(xiàn)在心臟和肝臟中GRP78S白的表達也顯著上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在 鐵引起的組織損傷中具有重要的作用。最近一項研究是以HepG2細胞 株為模型，利用氧化型二硫蘇糖醇(DTT)和高半胱氨酸誘導其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應 激來揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對鐵穩(wěn)態(tài)相關基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)伴隨著非折 疊蛋白反應，由肝臟分泌的調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的肝臟抗菌多

20、肽水平表現(xiàn)為二 相性：在非折疊蛋白反應早期，肝臟抗菌多肽水平降低；在應激反應 的持續(xù)階段，肝臟抗菌多肽水平提升；這證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對于細胞 內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的意義 25。3.2 錳Chun等26以500卩mol/LMnCI2處理多巴胺能細胞株 24h，結(jié)果發(fā)現(xiàn), 其誘導的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元 SN4741細胞的神經(jīng)毒性由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反 應介導，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶 GRP78蛋白水平升高，同時，激活內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)的特異凋亡蛋白 Caspase-12。Oubrahim等27發(fā)現(xiàn)，0.5和 1.0mmol/L錳(II)作用24h可引起NIH3T3細胞凋亡的過程中，有 Caspase-12的參與；同時發(fā)現(xiàn)，在 Cas

21、pase-12基因敲除后，在 NIH3T3細胞中不發(fā)生凋亡，表明 Caspase-12在錳(I)引起的NIH3T3 細胞凋亡中起關鍵作用。3.3 鉻當前，對鉻與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關系的研究主要集中于對糖尿病的研究。一 些研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了鉻提升機體糖耐量和減輕胰島素抵抗 的機制。Sreejayan等28對肥胖小鼠實行D-型苯基丙氨酸鉻Cr(D- phe)3 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組肥胖小鼠相比，處理組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應激的下游蛋白(p-PERK p-IRE和p-eIF2 a )的表達量減少，提示內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)應激參與了鉻對胰島素抵抗的緩解作用；同時，該小組還研究了 在毒胡蘿卜素誘導肌管產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況下 Cr(D-phe)3 處理的影 響，發(fā)現(xiàn)在 Cr(D-phe)3 處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標記物 p-eIF2a 的表 達受到抑制，進一步提示調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應可能是鉻的保護作用機 制。4 其他金屬對于鈾和鎳等其他金屬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關系也有一些研究，但主要是 描述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，未能實行深入的機制研究。貧鈾在軍事上的使 用使得關于貧鈾毒性的研究越來越多，其中，Miller等29發(fā)現(xiàn)，550卩g/ml貧鈾處理HepG2細胞48h，能夠上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋 白GRP78勺啟動子并具有劑量依賴性。鎳一般都是以鎳合金的形式被 應用。有研究發(fā)現(xiàn)，鎳合金的毒性比組成