細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法課件

1、實驗注意事項及影響試驗結(jié)果的 因素分析 一、實驗注意事項 二、影響試驗結(jié)果的因素分析 三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢 一、試驗操作注意事項 2005年版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程P297細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 實驗前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球 消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時，應(yīng)注意不 要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣 體中的內(nèi)毒素進入供試液。 復(fù)溶0.5ml鱟試劑時，在旋渦混合器上點 擊1-3秒，促進鱟試劑的溶解。 由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng) 過程中及觀察結(jié)果時應(yīng)注意不要使試管 受到振動，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性 結(jié)果。 進行干擾實驗時，標(biāo)準(zhǔn)對照系列和含內(nèi) 毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時進行，并

2、使用同一支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。 在進行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實驗和 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中 要求的對照應(yīng)同時進行，并在實驗有效 的情況才能進行計算和判斷。 在進行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實驗和 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中 要求的對照應(yīng)同時進行，并在實驗有效 的情況才能進行計算和判斷。 二、試驗誤差分析及改進措施 l鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 l細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價及使用的影響 l實驗器皿的的影響 l樣品成份及理化性質(zhì)的影響 l實驗員的影響 l環(huán)境的影響 1 1、鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響、鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 鱟試劑的質(zhì)量：抗干擾能力，穩(wěn)定性； 鱟試

3、劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。 1）、鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定？ 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確？ 不同廠家的鱟試劑雖然標(biāo)示值（）相同，但 仍然存在較大的誤差。比如，標(biāo)示值為0.5EU/ml 的鱟試劑，有的真實靈敏度可能是0.65EU/ml； 而另一個廠家的鱟試劑可能是0.30EU/ml時，按 0.5-2誤差標(biāo)準(zhǔn)都是合格產(chǎn)品，但對同一檢品 在相同的稀釋倍數(shù)下，這兩個廠家的鱟試劑產(chǎn)品 對內(nèi)毒素的檢出水平卻不同。 我本公司對鱟試劑質(zhì)量得控制： 原料；工藝用水；生產(chǎn)環(huán)節(jié)；靈敏度標(biāo)定。 標(biāo)示靈敏度國家標(biāo)準(zhǔn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 0.50EU/ml0.26EU/ml0.50EU/ml0.42EU/ml0.50E

4、U/ml 0.25EU/ml0.126EU/ml0.25EU/ml0.21EU/ml0.25EU/ml 鱟試劑的活性只能控制在某一個范圍內(nèi)，不 可能控制在一個點，我們要求允許波動的范圍盡 可能的小減少批間誤差。 2、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差 l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差 l細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯誤使用 1）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成， 用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素 工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。 細(xì)菌內(nèi)

5、毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為 基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾 試驗及各種陽性對照。 2005年版中國藥典 2）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作 標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈敏度時可 能存在一定的誤差。中國藥典要求“當(dāng)c在 0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏 度?！痹囼灲Y(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑 標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。 3）、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支， 輕彈瓶

6、壁，使粉末落入瓶底， 再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕， 用75%酒精棉球擦拭后啟開， 防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。 正確正確 （易折點）錯誤（易折點）錯誤 注意：只能在安瓿的易折點上部開啟內(nèi)毒素， 不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在 封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，可 按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后 分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次 性使用。 4）、錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來復(fù)核 鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚 者使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來交叉復(fù)核鱟試 劑的靈敏度，這是一種

7、嚴(yán)重錯誤行為。 3、實驗器皿的影響 l器皿的計量管理（校正） l器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) l器皿的正確處理 1）、器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 鱟試驗對器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi) 表面光滑；易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實 驗不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的 刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確， 內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意 注射器針頭引入的鐵離子對試驗結(jié)果的干 擾，故不宜選用注射器。 如果用量不大，使用頻率不高，建議大 家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗 材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和 -葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括, 無熱原 試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給 您的工作帶來很大方便,另外，當(dāng)實驗出

8、現(xiàn) 誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分 析判斷出誤差原因。 2）、器皿的正確處理 2005年版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278 頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“實驗準(zhǔn)備”規(guī)定： “將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗 凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出 將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈， 再用蒸 餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中， 迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在 的外源性內(nèi)毒素?！?應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻 璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖 洗?！庇械目蛻羰褂梅礉B透制備的純化水沖 洗試驗用玻璃器皿，結(jié)果試驗中所有的陽性 對 照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時試驗結(jié)果

9、 誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的 質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽 離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞，這時 不同的離子就產(chǎn)生對鱟試劑酶反應(yīng)抑制或增 強的反應(yīng)，為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢 驗報告的權(quán)威性，我們應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī) 程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。 移液管浸泡洗液時，應(yīng)如何放置？移液管浸泡洗液時，應(yīng)如何放置？ A、正 B、反 反放（尖端向上）的優(yōu)點？反放（尖端向上）的優(yōu)點？ 1、保護移液管刻度的準(zhǔn)確性； 2、防止標(biāo)本缸底部結(jié)晶體堵塞移 液管。 4 4、樣品成份及理化性質(zhì)的影響、樣品成份及理化性質(zhì)的影響 l-葡聚糖樣物質(zhì)的影響 lPH值的影響 l金屬離子和弱酸陰

10、離子的影響 l藥物濃度的影響 1 1）、）、 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 常見現(xiàn)象：假陽性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血 液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素 的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也 不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。 目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生 反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖，而內(nèi) 毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反 應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。鱟試劑的特異性差 的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如-葡聚糖） 判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格， 造成制藥廠直接經(jīng)濟損失。 鱟試劑反應(yīng)機理圖 判斷假陽性的方法： 1、特異性鱟試劑法； 2、定量反應(yīng)曲線分析法； 3、

11、家兔模擬試驗法。 假陽性事件： 1、2003年山東省青州某制藥廠，5%葡萄糖注射 液（規(guī)格：100ml 產(chǎn)品批號：0307040101）； 2、2004年廣東省湛江某制藥公司，Vc注射液 （產(chǎn)品批號：）； 3、2006年上海市某制藥公司，塑瓶裝5%葡萄糖 注射液（產(chǎn)品批號：0501142）； 2 2）、）、PHPH值對反應(yīng)速度的影響值對反應(yīng)速度的影響 常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。 鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜 pH在6.5-8.0；pH 3 或10 時，酶活性受到抑制。 相 對 活 力 PH 7.0 PH對反應(yīng)速度的影響: u影響酶原的激活； u影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變 酶的活性中心

12、的構(gòu)象，或甚至改變整個酶分 子的機構(gòu)使其變性失活。 故鱟試驗時，供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和 6.5-8.0 為好，必要時可用無內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國、日本藥局 方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié) PH值6.0-8.0。 成功案例： 1、頭孢吡肟 2、鹽酸土霉素、土霉素 3、喹諾酮類輸液 4、血液保存液、紅細(xì)胞保存液 3 3）、金屬離子和弱酸陰離子）、金屬離子和弱酸陰離子 離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一 方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內(nèi)毒 素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還 必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟 試劑酶反應(yīng)

13、具有強抑制作用；重金屬離子如 Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活； 另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+ 的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。 許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會 吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子，使實驗 呈假陰性。 成功案例： 1、碳酸氫鈉注射液 2、乙肝疫苗 3、注射用果糖二磷酸鈉 4 4）、藥物濃度）、藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉 4、中藥類注射液 5、實驗員的影響 操作時嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，安瓿開啟前 應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折 斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的 溶解、樣品的

14、稀釋及加樣時，取樣均應(yīng)準(zhǔn) 確。如果一人獨立完成試驗，可先稀釋配 制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，然后開 啟復(fù)溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟 試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制 在15分鐘內(nèi)）。 6、環(huán)境的影響 l保溫時間 l保溫溫度 1）、保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，然后分 別放置于25、28、31、34、37、41、43、 46、49水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形 成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達 49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。 從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈 敏度影響很大，保溫溫度在2541之 間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高， 4

15、1尚未達到反應(yīng)速度峰值，25 時反 應(yīng)速度已相當(dāng)快；在4146之間，溫 度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達到 49或更高溫度時，隨溫度升高而使酶 蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng) 速度反而降低。 2）、保溫時間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒 素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗， 37保溫，分別在10、20、30、40、50、 70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著 時間的延長而堅固。 因此夏天室溫較高，如果試驗操作時 間太長，細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不 等進入反應(yīng)儀器反應(yīng)已開始，實際反應(yīng) 時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏 季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很 大。即使在25準(zhǔn)室溫下操作，操作

16、時 間拖得過長，細(xì)菌內(nèi)毒素含量較高時， 測定誤差也不會小。 三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢 1、能準(zhǔn)確判斷假陽性 用本企業(yè)研制生產(chǎn)的定量鱟試劑第一家準(zhǔn) 確無誤地檢測出了內(nèi)毒素與葡聚糖二者之間的 區(qū)別，并公布了內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素反應(yīng)曲線。 截止目前，還沒有第二個品牌的鱟試劑將假陽 性區(qū)別出來，其他國內(nèi)外研究機構(gòu)也未公布同 類型曲線。 對于假陽性的鑒別已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)走在了世界同 行業(yè)的前面。 2、對外交流歷史悠久，全面掌握中美兩國鱟 試劑的區(qū)別 1）對外交流我公司歷史最悠久、交流技術(shù)最 全面； 2）我公司掌握了中國和美國鱟試劑的全面區(qū) 別； 3）用美國和中國的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，我公司鱟 試劑標(biāo)示靈敏度都相當(dāng)準(zhǔn)確。 4）通過

17、十多年的技術(shù)交流結(jié)果顯示，本公司 的鱟試劑與美國同類產(chǎn)品質(zhì)量相比沒有任何 差別，而且個別項目要優(yōu)于美國產(chǎn)品。 三、售后技術(shù)服務(wù)專業(yè)，技術(shù)優(yōu)勢明顯 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在我國已開展了十多年， 經(jīng)過許許多多專家學(xué)者的努力，目前該行業(yè) 已經(jīng)取得了非常重要的成果，但是該領(lǐng)域仍 然有許多我們無法解決問題的存在，它并不 想我們想象的那么簡單，這些問題的存在嚴(yán) 重阻礙了該行業(yè)的進一步發(fā)展，我們將與客 戶的交流以及客戶咨詢的相關(guān)問題，進行一 次歸納總結(jié)。通過工作中出現(xiàn)的問題有必要 對以下情況進行交流，以加強對細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查法的正確理解，同時糾正一些錯誤的觀 念。 如何全面理解細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中污染物 對試驗結(jié)果的影響？ 如何正確認(rèn)識器皿洗滌的重要性？ 如何正確理解鱟試劑的抗干擾能力和鱟試 劑的特異性？ 許多客戶對污染的認(rèn)識是不全面或錯誤的， 他們認(rèn)為在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過程中，器皿被 污染的結(jié)果必然導(dǎo)致陽性結(jié)果的出現(xiàn)，但試 驗結(jié)果正好與他們的認(rèn)識有時正好相反，可 能陽性對照全為陰性，對此亦有百思不得其 解。要正確理解這個問題，首先要正確理解 鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機理，鱟試劑與內(nèi)毒 素的反應(yīng)為一系列酶反應(yīng)，生物酶反應(yīng)受許 多因素的干擾。在日常工作中，我們要特別 注意一些因素對試驗結(jié)果的影響，如PH值、 器皿的潔凈度以及環(huán)境因素等。 解