豬乙型腦炎及其防制

1、2021/3/261 豬乙型腦炎及其防制研究進展 v乙型腦炎及其危害 v乙型腦炎病毒的病原學特性 v乙型腦炎的流行病學特性 v乙型腦炎的防制 v乙型腦炎疫苗研制進展 v乙型腦炎診斷方法研究進展 v乙型腦炎病毒分子生物學研究進展 v展 望 I v乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE),簡稱乙 腦,是一種由蚊蟲傳播引起的人與動物共患的急 性病毒性傳染病。 1871年,日本。 v夏秋季節(jié)流行,曾稱為“夏季腦炎”。 冬季曾發(fā)生過的昏睡腦炎(嗜眠性腦炎),日本學 者(1928年)。 冬季 甲型腦炎, 夏秋 乙型腦炎。 I 乙腦對人類危害巨大,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS) 最常見的

2、蟲媒病之一,是包括印度次大陸在內(nèi)的整 個亞洲引起人類死亡和殘疾的一個主要原因 。 I 時時 間間 國國 別別 病病 例例 病死率病死率 1924年 日本 6000 60% 1958年 越南 6897 1965年 日本 3000-5000 1999年 馬來西亞 I 我國是乙腦發(fā)病人數(shù)最多的國家，占世界總發(fā) 病數(shù)的80%以上。 乙腦暴發(fā)流行的部分大事記乙腦暴發(fā)流行的部分大事記 v該病主要危害兒童,特別是學齡兒童,在新加坡曾有12 歲兒童感染率高達70%的報道。 40-45歲的成人也易 感。懷孕婦女感染后導致流產(chǎn)。 v全球每年感染乙腦人數(shù)超過1千萬,大多數(shù)呈隱性感染 (亞臨床感染),其發(fā)病率一般為1

3、:25-1:1000,平均為 1:200。 v 病死率高,平均為20%,國外有的地方高達50%-60%,全 球每年病死人數(shù)超過1萬人。 v后遺癥嚴重,約57%-68%的治愈者患有不同程度的神 經(jīng)學后遺癥。 I v 多種動物如豬、馬、牛、山羊、綿羊、猴和家 禽很易感染乙腦,其它如兔、大鼠、鴿、犬、鴨、 野禽和爬行類也易感,小鼠和某些蜥蜴能被實驗 感染。其臨床癥狀隨患病動物的種類不同而異, 牛、羊、家禽多為隱性感染,馬可發(fā)生嚴重的腦 炎。 I v豬主要表現(xiàn)為:潛伏期3d-4d,仔豬腦炎,高熱稽留,精 神沉郁,步行踉蹌,最后身軀麻痹而死;育肥豬持續(xù)高 熱;妊娠母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn),產(chǎn)出大小不等的死胎、

4、 畸形胎、木乃伊胎及弱仔;公豬單側(cè)或兩側(cè)性睪丸腫 大,局部發(fā)熱,有痛感,數(shù)天后,睪丸腫脹消退,逐漸萎 縮變硬。 v此病引起的主要經(jīng)濟損失是懷孕母豬發(fā)生繁殖障礙, 對作為畜牧業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)增產(chǎn)造成巨大 的危害。 I v乙腦病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的分離和 鑒定最早報道于1935年（日本）。 v黃病毒科(Flaviviridae)。 v 3個血清型:JaGAr, Nakayama和Mie(intermediate type), 它們具有不同的生物學特性,包括生長特性和毒力。 vJEV毒粒呈球形,20面體對稱,有囊膜,毒粒直徑為45 - 50n

5、m(核心30nm),沉降系數(shù)200S,其分子量約為3000KD, 是黃病毒科66個成員中最小的病毒之一。 vJEV在環(huán)境中不穩(wěn)定,易被滅活。 I vJEV囊膜外表有穗狀突起,提純的穗狀突起具有血凝活 性,其成分為糖蛋白。其血凝素有輕重兩種,血凝性與 毒力相關(guān),血凝性是JEV強毒株的共性,減毒毒株的血 凝性相當?shù)?甚至完全喪失。 vJEV的血凝譜比較廣,在一定條件下能凝集鵝、鴿、雛 雞、綿羊等動物的紅細胞,但其血凝素易于破壞而且 血凝反應(yīng)要求比較嚴格的pH域。不同毒株血凝反應(yīng)的 最適pH不完全相同。 I JEV的抗原性較強,自然或人工感染的動物 一般都能產(chǎn)生較高效價的中和抗體、血凝 抑制抗體和補

6、體結(jié)合抗體。 I vJEV可在多種原代和傳代細胞上增殖。雞胚成纖維細胞、 鼠胚肌和腎細胞、牛胚腎細胞、人胚肺和腎細胞、人 羊膜細胞、豬腎原代細胞、狗腎原代細胞(PDK)、白紋 伊蚊細胞(C6/36)、金黃地鼠腎原代細胞(Primary Hamster Kidney, PHK)、BHK-21、PK-15、Hela、Vero 等。 vJEV在PHK、豬腎原代細胞、BHK-21和Vero上可增殖到 較高的滴度,而且有明顯的細胞病變(CPE),其特點主要 是圓縮和脫落 。 v目前國內(nèi)外用于增殖JEV的細胞主要有PHK,BHK-21和鼠 腦。 I I 肝、脾、肌肉 神經(jīng)元 血循 蚊蟲叮咬 叮咬部位繁殖

7、初期病毒血癥 病毒血癥 CNS和腦皮質(zhì)的深層 炎癥炎癥 Reported JE cases by countries and regions where viral transmission is proven or suspected I 乙腦的流行在熱帶地區(qū)無明顯的季節(jié)性,而在溫 帶和亞熱帶地區(qū)則有嚴格的季節(jié)性。據(jù)我國多 年統(tǒng)計資料,約有90%的病例發(fā)生在7、8、9三 個月內(nèi),流行高峰華中地區(qū)多在7-8月,華南和華 北地區(qū)由于氣候特點,流行較華中提早或推遲1 個月。云南省的流行高峰也較華中推遲1個月。 I I 傳播循環(huán)傳播循環(huán) 乙型腦炎的防制乙型腦炎的防制 v滅蚊是控制乙腦流行的一項重要措

8、施 藥物滅蚊法、生物學和生態(tài)學滅蚊法 v免疫接種是一種最有效的預防措施 豬是JEV的擴增動物,預防豬感染本病是防 止人患乙腦的重要措施,在蚊蟲活動季節(jié)開 始前1個月或配種前1個月注射疫苗。 I 乙腦的治療沒有特殊的方法,主要是對癥治療。其 主導性防制措施防蚊滅蚊與免疫接種。 Japanese encephalitis vaccines for human Vaccine Description Substrate Strain(s) Manufacturer(s) inactivated mouse brain Nakayama, India(1) , Japan(7) , Korea(1),

9、 P1 Taiwan(1), Thailand(1), Vietnam(1) inactivated PHK P3 China: Beijng,Shanghai,Changchun live,attenuated PHK SA14-14-2 China: Chengdu and Wuhan I 疫疫 苗苗 基基 質(zhì)質(zhì) 效效 力力 副副 作作 用用 價價 格格 滅活 鼠 腦 2-3 , 95% 強烈:觸痛 紅腫 20% 高 輕度全身癥狀10-30% (頭痛 肌痛 發(fā)熱 胃腸道） 全身性蕁麻疹 面部血管性 水腫 呼吸窘迫 0.6% 滅活 PHK 2-3 , 90% 輕微:腫脹4% 頭痛1% 高 發(fā)

10、熱6% 疹 減毒、活 PHK 1 , 80-100% 少見:頭痛0.03% 發(fā)熱0.46% 低 惡心0.03% 疹0.08% I Virulent parent virus SA14 Isolated from mosquitoes in China 11 passages in newborn mice 100 passages in PHK cell culture 3 plaque purifications Irradiation by u.v. and plaque purification in PHK cells Clone12-1-7 First attenuated vari

11、ant 6 animal passages 6 plaque purifications SA14-2-8 SA14-5-3 5 passages in suckling mice 2 plaque purifications in PHK SA14-14-2/PHK 9 passages and plague purificationsin PDK cell culture SA14-14-2/PDK I 疫苗毒株的傳代減毒過程疫苗毒株的傳代減毒過程 The derivation of live attenuated vaccine clones of JEV by passage of t

12、he wild-type strain SA14 in cell culture v日本有2種活疫苗供獸用。一為M株,經(jīng)胎鼠皮膚培養(yǎng)傳代 致弱,供豬用,亞洲其它國家有的也用此苗;一為ML-17 株,JaOH0566株經(jīng)3733302725減毒 而獲得。 v我國目前豬用乙腦疫苗主要是鼠腦滅活疫苗,該苗具有注射 劑量大、需多次注射、效果不穩(wěn)定及免疫力不持久等不足 之處。 I v亞單位疫苗 v重組活疫苗 v核酸疫苗 I v森田公一等(日本,1991)用JEV E基因C-末端1/3 長度cDNA片段的原核表達產(chǎn)物免疫小鼠,發(fā)現(xiàn) 該融合蛋白能誘導小鼠產(chǎn)生抗JEV抗體,且對 100PFU JEV攻擊的保護

13、率為100%(8/8)。 v劉金華等(1998)用昆蟲細胞(sf9) 表達的prM-E 蛋白免疫2頭豬,每頭2mL,2周后加注1mL。第2 次免疫1周后,HI抗體為2,2周為8,3周達到16。 I I 時間時間 1990 1991 1991 1991 1992 1992 1995 1997 1997 1998 1999 1999 作者作者 Atsushi Konishi Konishi Mason Konishi Konishi 婁元梅 劉啟富 Konishi Konishi Guirakhoo Monath 載體載體 Vaccinia Vaccinia Avipox Vaccinia NYV

14、AC Vaccinia Vaccinia Vaccinia NYVAC ALVAC NYVAC ALVAC YFV YFV 基因片段基因片段 prM prM-E NS1 prM , E , NS1 prM-E-NS1-NS2a-NS2b prM-E-NS1-NS2a E-NS1-NS2a-NS2b E-NS1-NS2a prM , E , NS1 prM-E E-NS1-NS2a prM-E-NS1-NS2a prM-E-NS1-NS2a prM-E-NS1 prM-E-NS1 prM-E-NS1 prM-E-NS1 prM-E prM-E 宿主宿主 rabbi t , mice mice m

15、ice mice swine mice mice rabbit mice human mice monkey 免疫應(yīng)答及保護力免疫應(yīng)答及保護力 均有特異性抗體反應(yīng),抗致死性攻擊 有抗體反應(yīng),保護力高 有抗體反應(yīng),保護力低 抗致死性攻擊 均有特異性抗體反應(yīng),抗致死性攻擊 均有特異性抗體反應(yīng) 特異性抗體反應(yīng),抗致死性攻擊 有抗體反應(yīng),無保護力 有抗體反應(yīng),有保護力 特異性抗體反應(yīng)，抗致死性攻擊 均產(chǎn)生特異性抗體和CTL 均引起體液免疫和細胞免疫應(yīng)答 抗致死性攻擊 特異性體液免疫應(yīng)答,抗致死性攻擊 I v 病毒分離鑒定 反向被動血凝試驗(RPHA) 免疫細胞化學法 熒光抗體染色法 RT-PCR 乙型

16、腦炎的診斷乙型腦炎的診斷 I 補體結(jié)合試驗(CT) 血凝抑制試驗(HI) 中和試驗(NT) 乳膠凝集試驗(LAT) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 乙型腦炎的診斷乙型腦炎的診斷 Structural m7GpppAmp AG ORF(10.3kb)UAG CU-OH 3/ NCR5/ NCRNonstructural C prM E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5 125 165 500 350 227 130 620 290 115 905 pr M 75 950.6kb I AUG (11kb) 乙型腦炎病毒的分子生物學乙型腦炎病毒的分子生物學 蛋白分類蛋白

17、分類 蛋白名稱蛋白名稱 MW(KD)糖基化糖基化(位點位點)結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能 結(jié)構(gòu)蛋白 C 13.9 否 C端疏水，衣殼蛋白 prM 18.5 是(15) N端疏水，M的前體 M 8.3 否 完全疏水，毒粒包膜蛋白 E 53 是(154)C端疏水，毒粒囊膜蛋白 非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1 35 是(130, 207)早期復制、組裝、釋放 NS2a 17 否 疏水，膜功能？ NS2b13 否 疏水，膜功能？ NS3 64 否 protease/helicase? NS4a 28 否 疏水，功能待定 NS4b14 否 疏水，功能待定 NS5 105 否 polymerase? I 乙腦病毒的蛋白及其功能乙

18、腦病毒的蛋白及其功能 vNS4、NS5 N末端和C末端 AA序列, 功能 v新型疫苗 基因疫苗 重組活疫苗 v感染性全長cDNA克隆 黃慶生等(2000) JEV SA14 致病機理、減毒機制、基因組功能 I 豬乙型腦炎減毒活疫苗研究豬乙型腦炎減毒活疫苗研究 以原代地鼠腎(PHK)細胞為培養(yǎng)基質(zhì)研制出了 豬用乙腦凍干減毒活疫苗,解決了我國目前還沒有國 家正式 批準的豬用乙型腦炎弱毒疫苗,滿足生產(chǎn)急 需。 該疫苗對小白鼠和妊娠母豬的安全性良好。 該苗能在小鼠和仔豬體內(nèi)引起特異性免疫應(yīng)答。疫 苗在-20的保存期至少為2年,在4-8可保存1年 半。 II 小鼠腦 內(nèi)致病 力測定 懷孕母 豬安全 試驗

19、 PHK細胞制備及培養(yǎng) 接毒與收獲 效價測定 無菌檢驗疫苗凍干 安全性測定 小鼠免疫 原性測定 仔豬免疫 原性測定 免疫原性測定 LAT脾細胞增 殖試驗 保存期測定 試驗 毒性 II 滴度滴度（TCID50/1.0mL） 凍干前凍干前 凍干后凍干后 1 10-7.6 10-6.9 2 10-7.8 10-7.1 3 10-7.2 10-6.8 4 10-7.5 10-6.9 批批 次次 未出現(xiàn)不良反應(yīng)，無 流產(chǎn)，死胎等異常情 況，均正常分娩，胎 兒發(fā)育正常。 小鼠腦內(nèi) 致病力試驗 毒性試驗 懷孕母豬 安全試驗 動物數(shù)動物數(shù) 接種途徑接種途徑 劑量劑量(mL)結(jié)果結(jié)果 10只 4只 3頭 腦內(nèi)

20、腹腔 耳靜脈 0.03 0.5 3 14d無死亡 30min內(nèi)無異常 反應(yīng)，3d內(nèi)健存 II 采采 血血 時時 間（周）間（周） 0 1 2 4 6 8 I 1:2(1)1:8(2) 1:8(3) 1:8(3) 1:1(3)1:4(1) 1:4(1) 1:4(1) 1:2(1) II 1:4(1)1:8(2) 1:8(2) 1:8(2) 1:2(1)1:2(2) 1:2(2) 1:4(1) 1:1(1) 1:2(1) III 1:1(4)1:4(1) 1:4(3) 1:4(4) 1:2(2) 1:2(1) 1:1(1) 批批 次次 II 0 0 0.50.5 1 1 1.51.5 2 2 2.

21、52.5 JEVJEVConAConA ControlControl TestTest S I II 劑量劑量 豬號豬號 免前免前 免免 后后(周周 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 1mL 27 - - 1:1 1:4 1:1 1:16 1:8 1:4 1:4 37 - - 1:1 1:4 1:4 1:4 1:4 1:1 1:2 2mL 17 - - - 1:4 1:8 1:8 1:32 1:4 1:4 47 - 1:1 1:1 1:8 1:8 1:16 XX X 3mL 57 - 1:1 1:1 1:8 1:8 1:8 1:8 1:2 1:1 67 - - 1:1 1:8 1:4 1:1

22、6 1:64 1:16 1:32 對照 77 - - - - - - - - - 87 - - - - - - - - - 97 - - - - - - - - - - II 保存條件保存條件 不同保存時間（月）不同保存時間（月）TCID50/1.0mL （） 1261218 -20 10-6.8 10-6.9 10-6.810-6.510-6.4 4-8 10-6.8 10-6.7 10-6.710-6.410-5.6 2021/3/2638 乙型腦炎及病原學特征乙型腦炎及病原學特征 乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE),又稱日本 乙型腦炎(簡稱乙腦),是一種嚴重威脅

23、人畜健康 的急性病毒性蚊媒傳染病。此病主要在夏秋流 行,屬于自然疫源性疾病,病毒通常在蚊豬 易感動物間循環(huán)。該病是我國及亞州地區(qū)的一 種嚴重傳染病,我國除少數(shù)省,自治區(qū)外,大部分 地區(qū)都有JE流行。在我國三帶喙庫蚊是JE的主 要傳播媒介,豬是主要中間宿主和擴散宿主。 2021/3/2639 乙腦對人類的危害 :死亡、殘疾 患者癥狀:高熱、狂暴或沉郁等神經(jīng)癥狀為主 要特征 其臨床表現(xiàn) :潛伏期5d-15d,病程可分為3個階 段:初期、急性腦炎期、恢復期 。 2021/3/2640 乙腦對豬的危害:引起妊娠母豬流產(chǎn),產(chǎn)死胎、 木乃伊胎、畸形胎及弱仔;使公豬單側(cè)或兩側(cè) 性睪丸腫大,發(fā)熱繼而萎縮變硬。

24、 牛、羊及家禽多為隱性感染,馬可發(fā)生嚴重的 腦炎 2021/3/2641 JE的病原為乙腦病毒(Japanese encephalitis Virus,JEV) JEV原屬于報膜病毒科(Tongaviridae)乙組蟲媒 病毒的黃病毒屬(Flavivrius) 1984年另立為黃病毒科(Flaviridae) JEV分三個清型:JaGAr,Nakayama和 Mie(intremediate type) JEV粒子呈球形,呈20而體對稱,有囊膜,毒粒直 徑為45nm-50nm(核心30nm),是黃病毒科最小 的病毒之一 2021/3/2642 JEV在環(huán)境中不穩(wěn)定 10%滅活兔血清和0.5%乳

25、白蛋白水解物等對 病毒有較好的保護作用 JEV大多數(shù)毒株能凝集鵝、鴿及初生雛雞的 紅細胞,pH以6.5-6.8最適宜 乙腦病毒可在7-9日齡的雞胚和多種組織培養(yǎng) 細胞內(nèi)增殖 通常只在倉鼠腎細胞、豬腎和羊胎腎細胞上 恒定地引起細胞病變(CPE) 2021/3/2643 乙腦病毒的分子生物學研究進展乙腦病毒的分子生物學研究進展 JEV為單股正鏈RNA病毒,基因組長11Kb,沉 降系數(shù)為42S,具有感染性 整個基因組由5端非編碼區(qū)(5-noncoding region,5NCR),一個幾乎跨越整個基因組的單 一開放閱讀框(ORF)和3端非偏碼區(qū)(3-NCR) 構(gòu)成,無亞基因組結(jié)構(gòu) ORF大小為10.

26、3Kb,共編碼約3430個氨基酸 基 ORF編碼1個多聚蛋白前體 2021/3/2644 C蛋白起調(diào)節(jié)蛋白和保護基因組免受核酸酶破 壞的作用,與病毒的復制和生物合成密切相關(guān) M蛋白參與病毒的感染過程,它能誘生具有輕度 中和作用的抗體 E蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白,該蛋白在大多數(shù)黃病毒 中是保守的,它是毒粒表面的重要成份,由它形 成的表面抗原決定簇具有血凝活性和中活作用, 能刺激機體產(chǎn)生血凝抑制抗體和中和抗體,可保 護機體免受病毒的攻擊,與病毒的吸附,侵入,致 病和誘導縮主的免疫應(yīng)答等作用密切相關(guān) 2021/3/2645 NS1為分泌型糖蛋白,其具體功能不清,但認為 其參與病毒復制的早期階段,NS1還可

27、能參與病 毒的組裝和釋放,是主要的抗原成份之一。NS1 蛋白不組成毒粒,所以沒有中和活性和血凝抑制 活性,但它具有可溶性補體結(jié)合活性,可在不出 現(xiàn)中和抗體的情況下誘生保護力,即不產(chǎn)生抗體 依賴性增強作用,NS1的基因和表型具有高度同 源性 NS2蛋白可能與膜功能相關(guān) NS3蛋白在病毒感染細胞中對病毒RNA的復制 具有十分重要的功能 NS5可能參與病毒RNA聚合酶的組成 2021/3/2646 乙腦的防制及乙腦疫苗的研究進展乙腦的防制及乙腦疫苗的研究進展 乙腦的治療沒有特效方法,除采取一般措施外, 主要是對癥治療。 本病主導性防制措施是滅蚊和免疫接種 人用乙腦疫苗:鼠腦滅活疫苗,原代地鼠腎滅活

28、疫苗和原代地鼠腎減毒活疫苗 獸用疫苗主要有減毒活疫苗和鼠腦滅活疫苗 新一代的乙腦疫苗:亞單位疫苗,重組活疫苗和 核酸疫苗 2021/3/2647 2.2 乙腦酶聯(lián)免疫吸附試驗乙腦酶聯(lián)免疫吸附試驗 2021/3/2648 乙腦ELISA抗原的制備 將病毒分別接種于9日齡雞胚的尿囊腔中,37 進行培養(yǎng)48小時后收集尿囊液。 離心棄沉淀。 上清用冷丙酮沉淀,離心后沉淀冷凍抽干,加入 生理鹽水溶解,上清作為病毒抗原。對照抗原用 同樣方法獲得。 2021/3/2649 ELISA最佳反應(yīng)條件的確定 病毒抗原及對照抗原分別橫行稀釋包被奇數(shù)列和偶數(shù)列包被過夜。 將血清縱列稀釋,37 反應(yīng)1h 加入1:800

29、0兔抗豬酶標抗體,37反應(yīng)1h 加入OPD底物反應(yīng)15分鐘 加入 2M H2SO4終止反應(yīng)。 在490nm波長下測定OD值。以陽性血清OD差值大幅度減少時的 抗原稀釋度為最佳包被濃度,以陽性血清OD差值大幅度減少及陰 性血清OD差值很低的血清稀釋倍數(shù)為血清最佳稀釋倍數(shù)。 2021/3/2650 ELISA陽性界限的確定 檢測92份HI檢測為陰性的血清,陰陽性臨界值以2.1S/P求 得。 S=(病毒抗原包被孔測得血清OD值-對照抗原包被孔 測得血清OD值)的平均值,P=病毒抗原包被孔測得陽性血 清OD值-對照抗原包被孔測得陽性血清OD值。 定性:S/P陽性界限判為陽性 定量:S/P陽性界限的血清最高稀釋倍數(shù)作為效價。 2021/3/2651 ELISA方法的檢驗 特異性試