人胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展

1、-作者xxxx-日期xxxx人胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展【精品文檔】人胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展周進(jìn) 學(xué)號10170807【摘要】干細(xì)胞( Stem Cell)是一類具有分化潛能和自我復(fù)制的早期未分化細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞( Embryonic stem cells, ES細(xì)胞)是一種早期胚胎內(nèi)細(xì)胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell, PGC）經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)，分離和克隆得到的具有發(fā)育全能性的高度未分化細(xì)胞。人類胚胎干細(xì)胞系的建立是人類發(fā)育生物學(xué)研究的重大突破,揭示了人體發(fā)生發(fā)展奧秘的進(jìn)程,可能為現(xiàn)代臨床醫(yī)療模式帶來革命性的變化?，F(xiàn)對人類胚胎干細(xì)

2、胞的來源,建系、生物學(xué)特性、應(yīng)用前景及所涉及的倫理學(xué)問題作一綜述。【關(guān)鍵詞】胚胎干細(xì)胞；克??；倫理學(xué),醫(yī)學(xué);綜述1、胚胎干細(xì)胞的概念胚胎干細(xì)胞是從哺乳動物早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或桑椹胚分離出來的、能在體外長期培養(yǎng)的、高度未分化的全能細(xì)胞系,可在適合的條件下分化為胎兒或成體的各種類型的組織細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞屬全能干細(xì)胞。ESCs 這一名詞因其來源于胚胎而得名, 但從研究角度來說, 其概念一直沒有一個特殊的標(biāo)準(zhǔn), 2001 年美國國立衛(wèi)生院根據(jù)Austin Smith 對小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 對其概念提出了一系列標(biāo)準(zhǔn)1: 、來源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或囊胚上胚層; 、能夠

3、無限地進(jìn)行對稱分裂并保持未分化狀態(tài)( 長期自我更新) ; 、顯示并維持正常、完整( 二倍體) 和穩(wěn)定的染色體核型; 、全能的ESCs 能夠分化成三個胚層( 內(nèi)胚層、中胚層、外胚層) 來源的所有細(xì)胞類型;、在發(fā)育過程中能整合到所有胚胎組織中( 體外經(jīng)長期培養(yǎng)的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合體動物后, 仍能產(chǎn)生所有組織) ; 、具有能克隆形成胚胎細(xì)胞系的能力, 并能產(chǎn)生卵子或精子細(xì)胞; 、基因克隆, 即一個單一的ESCs 能產(chǎn)生一群具有相同遺傳特性的細(xì)胞( 克隆) , 這些細(xì)胞有著與親代細(xì)胞相同的特征; 、表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct- 4, 后者繼而激活或抑制大量的靶基因, 以使ESCs 維持未分

4、化狀態(tài); 、可被誘導(dǎo)而繼續(xù)增殖或進(jìn)入分化狀態(tài); 、缺乏細(xì)胞周期中的G1 期的限制點。ESCs 大部分時間都處于細(xì)胞周期的S 期, 在此期進(jìn)行DNA 合成。與已分化的體細(xì)胞不同, ESCs 不需任 何外界刺激來啟動DNA 的復(fù)制。其中、不適用于人的EGCs, 和不適用于人的ESCs, 所有的標(biāo)準(zhǔn)都適用于小鼠的ESCs。2、 胚胎干細(xì)胞的獲取途徑及其“多能性目前胚胎干細(xì)胞的獲取途徑主要有2個:一是從自然胚胎中獲取,可在胚胎發(fā)育的不同階段獲得;二是通過細(xì)胞克隆得到的胚胎中獲取,也可在胚胎的不同發(fā)育階段獲得。隨著克隆技術(shù)的發(fā)展,后者顯得更為容易。胚胎干細(xì)胞的多能性表現(xiàn)在它具有多種分化發(fā)育的潛能。其多能

5、性學(xué)術(shù)上用兩個詞來加以區(qū)分:全能(totipotent),即指受精卵及囊胚細(xì)胞所具有的能力,除具有分化為機(jī)體所有細(xì)胞類型的潛能外,還有形成完整生物體的潛能;多能(pluripotent),即指從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或原始生殖細(xì)胞(又稱胚胎生殖系干細(xì)胞)衍生而來的細(xì)胞或細(xì)胞株所具有的能力，能形成包括生殖系在內(nèi)的所有組織類型,但形成一個完整的生物體的可能性很小。3、 胚胎干細(xì)胞研究的主要物種類型3. 1人類 目前全世界已取得了60 余種不同基因的胚胎干細(xì)胞系,主要分布在美國、澳大利亞、新加坡、印度及以色列等地。由于助孕技術(shù)中的超促排卵及體外受精2胚胎移植(試管嬰兒) 技術(shù)的不斷成熟和在世界各地的迅速

6、開展,人胚胎干細(xì)胞的來源顯得比其他物種更為容易和豐富,同時因為研究的直接性而為廣大學(xué)者所重視。但由于法律和倫理的原因,胚胎干細(xì)胞的研究將受到諸多的限制。 3. 2 靈長類 靈長類動物與人的關(guān)系密切且沒有太多法律與倫理上的限制,所以靈長類胚胎干細(xì)胞是目前研究最多的胚胎干細(xì)胞種類,以恒河猴與絹猴為代表2 。 恒河猴與人類的關(guān)系最為密切,在生殖與生長發(fā)育過程中與人有許多相似之處,因此是胚胎學(xué)研究的最佳模型,恒河猴胚胎干細(xì)胞也就成了了解各種人體組織分化的很好的體外模型,但其生殖特性(性成熟晚、妊娠期長、單胎孕育等) 限制了其應(yīng)用;絹猴為西半球靈長類動物,與人類的關(guān)系不如恒河猴近,但因其生殖特性在實驗中

7、獲得了廣泛的應(yīng)用。絹猴一般是多胎孕育,性成熟期只有18 個月,妊娠期較短,更重要的是絹猴的卵巢周期可以在前列腺素的調(diào)節(jié)下同步化,這就可能收集到大量生長發(fā)育一致的胚胎。目前,絹猴胚胎干細(xì)胞為我們提供了一個了解靈長類胚胎移植和妊娠母系識別的非常重要的模型。 從恒河猴與絹猴胚胎中分離出的胚胎干細(xì)胞均具有其特有的一套特異性標(biāo)志物,它們包括階段特異性胚胎抗原3和4 (SSEA-3 和SSEA-4) 、高分子糖蛋白TRA-1-60 和TRA-1-81、堿性磷酸酶等。這些標(biāo)志物與標(biāo)志人胚胎性癌細(xì)胞(embryonal carcinoma cells , EC 細(xì)胞) 的表面抗原相同。這表明靈長類與人類在胚胎

8、學(xué)上有高度的相似性,而鼠胚胎干細(xì)胞僅表達(dá)SSEA-1 與堿性磷酸酶活性,說明胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物具有物種差異。 3. 3 小鼠(mouse) 由于歷史上的廣泛應(yīng)用及已明了的遺傳學(xué)機(jī)制和多產(chǎn)特性,使小鼠成為哺乳動物胚胎學(xué)的主要研究對象。世界上最早的胚胎干細(xì)胞株就是首先從小鼠胚胎中分離出來的。胚胎干細(xì)胞分離及培養(yǎng)的方法學(xué)也是由此建立并發(fā)展起來的。對小鼠胚胎干細(xì)胞做進(jìn)一步研究有助于靈長類及人類胚胎干細(xì)胞研究的發(fā)展。 3. 4 其他 如魚、鳥、兔、豬等脊椎動物中亦能分離出多能胚胎干細(xì)胞株。 胚胎干細(xì)胞研究物種的多樣化對于研究生物體的早期發(fā)生過程是十分必要和重要的,如細(xì)胞的譜系定型和重組基因印跡等,對基

9、因修飾及核移植技術(shù)的研究和發(fā)展也有重要的作用。4、 胚胎干細(xì)胞的分離與增殖技術(shù) 以從靈長類胚胎ICM中分離靈長類胚胎干細(xì)胞為例3簡述如下。 4. 1 分離ICM前的準(zhǔn)備 準(zhǔn)備小鼠原始成纖維細(xì)胞層。將小鼠原始成纖維細(xì)胞用30Gy 的-射線處理,使它終止有絲分裂活動,以5 104 個/ cm2 的密度置于用0. 1 %動物膠處理后的組織皿中,加入培養(yǎng)液(80 % DMEM、20 %胎牛血清、0.1mmol/ L 22巰基乙醇和1 %非必需氨基酸溶液) ,置5 % CO2溫箱中孵育過夜。 4. 2 分離ICM 將排卵后6d 的恒河猴囊胚(或排卵后8d 的絹猴囊胚) 放入0. 5 % DMEM中孵育,

10、至透明帶破裂時立即將囊胚移入含兔抗恒河猴脾細(xì)胞(或兔抗絹猴脾細(xì)胞) 抗體的DMEM中,孵育30min ,經(jīng)DMEM沖洗后再移入1 :10 的幾內(nèi)亞豬補體中30min ,再經(jīng)DMEM 沖洗后,用吸管吸除ICM中的滋養(yǎng)層細(xì)胞,最后將ICM種植在飼養(yǎng)層上。4. 3 胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖 種植710d 后,將ICM來源的細(xì)胞團(tuán)移入含0. 05 %胰蛋白酶的EDTA 中35min ,用吸管輕輕吹打使它散開,將細(xì)胞種植到新培養(yǎng)基上。細(xì)胞集落形成后,再將單個細(xì)胞分離出來種植到新培養(yǎng)基上,如此反復(fù),710d 進(jìn)行1 次。 4. 4 胚胎干細(xì)胞的冷凍保存 如需要將胚胎干細(xì)胞冷凍,最好在培養(yǎng)早期進(jìn)行,選擇細(xì)胞形

11、態(tài)及核型均正常的細(xì)胞冷凍,并在液氮中長期保存。 4. 5 操作注意事項 (1) 定期將未分化的細(xì)胞集落從已分化的細(xì)胞中分離出來并種植到新的培養(yǎng)基上; (2) 轉(zhuǎn)移細(xì)胞時盡量快,以免細(xì)胞發(fā)生解離和死亡; (3) 分離細(xì)胞集落時使每個部分含510 個細(xì)胞,否則細(xì)胞過多將導(dǎo)致分化,細(xì)胞過少則克隆的效率低; (4) 由于胚胎干細(xì)胞是對各種內(nèi)毒素最為敏感的細(xì)胞,故要重視培養(yǎng)液和血清的質(zhì)量; (5) 重視原始成纖維細(xì)胞的質(zhì)量,沒有原始成纖維細(xì)胞所有的胚胎干細(xì)胞將在710d 內(nèi)分化或死亡,若原始成纖維細(xì)胞質(zhì)量差,則不能有效地抑制胚胎干細(xì)胞的分化而導(dǎo)致培養(yǎng)增殖失敗。 總之,胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)是極其復(fù)雜的實

12、驗室技術(shù),目前的培養(yǎng)條件尚不能避免胚胎干細(xì)胞的分化,而且隨著培養(yǎng)周期次數(shù)的增多,胚胎干細(xì)胞的穩(wěn)定性也會下降。因此,如何改進(jìn)培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)是胚胎干細(xì)胞研究中最重要的問題。5、 人類胚胎干細(xì)胞的來源主要有:(1)從人類胚胎的囊胚期內(nèi)細(xì)胞群中直接分離多能干細(xì)胞4;(2)從終止妊娠的胎兒組織中分離出多能干細(xì)胞5;(3)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(somaticcellnucleartransplantation,SCNT)。6、 人胚胎干細(xì)胞系的建立1989年P(guān)rea嘗試從人畸胎瘤分離ES細(xì)胞,初步證明了人ES細(xì)胞系建立的可能性。1998年Thomson領(lǐng)導(dǎo)的小組將合法獲得的體外受精的人早期胚胎在體外培養(yǎng)至囊胚

13、期,利用免疫外科手術(shù)去除透明帶,以抗BeWO細(xì)胞的單抗作免疫標(biāo)記,剔除外層細(xì)胞,以35Gy射線照射小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層,以DMEM+胎牛血清+谷氨酰胺+巰基乙醇+非必需氨基酸作為培養(yǎng)液,體外培養(yǎng)人囊胚內(nèi)細(xì)胞群,915d后將長出的細(xì)胞團(tuán)吹散或者用胰酶或EDTA消化,然后繼續(xù)在小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞上生長,挑選具有均一的未分化形態(tài)的單克隆細(xì)胞團(tuán),吹散成50100個細(xì)胞的小團(tuán)后再行培養(yǎng),如此重復(fù)直至成系。在此期間每一步都需觀察細(xì)胞染色體核型,以確定它未癌變。此后細(xì)胞系經(jīng)吹打或膠原酶IV處理長期傳代。他們從14個囊胚中,最終建立起5個人類ES細(xì)胞系:H1、H13、H14、H7和H19。這些細(xì)胞系繼續(xù)培養(yǎng)

14、56個月傳32代仍可繼續(xù)生長6。Gearhart領(lǐng)導(dǎo)的小組采用了與Thomson小組不同的方法,從59周齡流產(chǎn)胎兒的性腺嵴(gonadalridges)及腸系膜中分離原始的干細(xì)胞(primordialgermcells,PGCs),命名為EG細(xì)胞。以期避免因直接利用胚胎所造成的倫理學(xué)上的麻煩。將EG細(xì)胞體外培養(yǎng)于小鼠成纖維細(xì)胞層上,培養(yǎng)體系中加入重組人LIF,重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子及Foskolin,721d后形成較大的多細(xì)胞集落,其形態(tài)與小鼠EG或ES細(xì)胞集落相似。經(jīng)過一系列與Thomson實驗室相似的免疫組化及功能實驗,證明獲得了可成系的人胚胎干細(xì)胞集落7。迄今為止,除Thomson

15、、Gearhart和Shamblott等的報道外,人ES細(xì)胞分離尚無成功報道,主要原因是人ES細(xì)胞建株的條件尚不成熟,而對人ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的研究至今尚無報道。7、 胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用前景及主要問題 由于胚胎干細(xì)胞的高度復(fù)制能力及多向性分化的潛能,已展示出很好的研究、應(yīng)用前景。如將特殊改變的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至ES細(xì)胞中,體外選擇后將ES細(xì)胞導(dǎo)入機(jī)體,使ES中的遺傳信息傳達(dá)給子代,可能有助于克服出生缺陷,糾正某些遺傳性疾病8 ;將經(jīng)過基因修飾過的ES或EG細(xì)胞與正常細(xì)胞放在一起形成嵌合體,研究發(fā)育進(jìn)程中細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用對細(xì)胞突變的影響9;將ES或EG細(xì)胞中某個基因敲除或?qū)⑼鈦淼哪硞€基因?qū)?研究

16、特定基因?qū)ε咛グl(fā)育、藥物代謝和腫瘤形成的影響等1012 。最近有人用RNAi的方法使hES細(xì)胞中某個基因表達(dá)下降,獲得較穩(wěn)定的結(jié)果13。科學(xué)家們認(rèn)為有希望通過該方法創(chuàng)建免疫無反應(yīng)的hES細(xì)胞系,從而控制hES細(xì)胞移植后的排斥反應(yīng),使hES細(xì)胞移植易于成功。人胚胎干細(xì)胞研究有望為目前臨床某些難治性疾病提供治療的新方法甚至治愈的可能性。如可將hES體外誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞導(dǎo)入心室壁,替代己梗死的心肌功能14;應(yīng)用體外分化的胰島細(xì)胞治療1型糖尿病;應(yīng)用誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞前體細(xì)胞治療帕金森病。有人預(yù)言,將來可應(yīng)用胚胎干細(xì)胞在體外形成的器官取代功能衰竭的體內(nèi)器官,為器官移植提供重要的來源保障。當(dāng)然要實現(xiàn)胚

17、胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,還要做很多工作: 需要研究闡明胚胎干細(xì)胞基因組印跡狀態(tài)(genomicim printing)。基因組印跡是某些等位基因的表遺傳修飾,與胎兒發(fā)育異常及腫瘤生長有關(guān)。在個體發(fā)育不同時期,基因組印跡狀態(tài)不同。己有研究表明,鼠胚胎干細(xì)胞基因組印跡異常或不穩(wěn)定;但另一組研究者則發(fā)現(xiàn)人和小鼠EG細(xì)胞的基因組印跡基本正常,這可能為胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用排除了一大障礙。但對hES細(xì)胞的研究尚未見報道。 需要解決免疫排斥問題。研究表明,與其他同種異體的組織器官移植相比,雖然hES、hEG細(xì)胞移植的排斥反應(yīng)較輕,但它仍不可避免地會發(fā)生。供者與受者ABO血型抗原、HLA組織相容性抗原、微組織相容性

18、復(fù)合物抗原(minor histocompatility complex antigens MHC)的不同而誘發(fā)排斥反應(yīng)。參 考 文 獻(xiàn)1 Ruth Kirschstein, Lana R. Skirboll Scientific Progress and Future Research DirectionsJ. StemCells.2001.2Thomson JA ,Marshall VS. Primate embryonic stem cells J .Current copics in Developmental Biology ,38 :13321.3 Thomson JA , Its

19、kovitzEldor J ,Shapiro SS ,et al. Embryonicstem cell lines derived from human blastocysts J . Science ,1998 ,282 :114521147.6ThomsonJA,Itskovitz/EldorJ,ShapiroSS,etal.EmbryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocytsJ.Science,1998,282:1147SolterD,GearhartJ.Putting stem cells to workJ.Science,1999,283:1468214747 8Brian E , Edward BE ,John D , et al. The human pluripotent stem cell : impact on medicine and society J . Fertil Steril ,2000 ,7