非動(dòng)物源蛋白胨對(duì)獸疫鏈球菌產(chǎn)透明質(zhì)酸影響的研究

1、 非動(dòng)物源蛋白胨對(duì)獸疫鏈球菌產(chǎn)透明質(zhì)酸影響的研究 2.安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443003摘要：本研究對(duì)比了幾種不同的非動(dòng)物源蛋白胨和動(dòng)物源蛋白胨對(duì)獸疫鏈球菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的影響。采用3l六聯(lián)發(fā)酵罐培養(yǎng)，對(duì)4種非動(dòng)物源蛋白胨及2種動(dòng)物源蛋白胨進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，非動(dòng)物源蛋白胨fp501能很好的對(duì)生產(chǎn)用的牛骨胨進(jìn)行替換，發(fā)酵18h，透明質(zhì)酸產(chǎn)率能達(dá)到9.55g/l，優(yōu)于現(xiàn)在生產(chǎn)用的骨胨。abstract：this research focused on the effects of different non-animal peptones and animal-source pept

2、ones on the production of hyaluronic acid by streptococcus zooepidemicus. four kinds of non-animal peptone and two kinds of animal peptone were compared by cultured in 3l six-way fermentation tanks. the results show that non-animal peptone fp501 can replace the production of bovine bone peptone very

3、 well. the yield of hyaluronic acid can reach to 9.55g/l after 18 hours of fermentation, which is better than the current production of animal source peptone.關(guān)鍵詞：獸疫鏈球菌；透明質(zhì)酸；非動(dòng)物源蛋白胨；酵母蛋白胨透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,ha)是由n-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸組成的一種高分子多糖，其具有高度的粘彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性。ha的分子量決定了其在不同的應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮效力，如低分子量ha(mr110

4、6da)被證明在促血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、保護(hù)骨關(guān)節(jié)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景1-3，而高分子量ha(mr1106da)由于其優(yōu)異的保濕粘彈性及潤滑作用，在醫(yī)藥器械及高端化妝品的應(yīng)用越來越廣泛4-7。獸疫鏈球菌被廣泛用于工業(yè)上透明質(zhì)酸的生產(chǎn)，由于獸疫鏈球菌是一種對(duì)營養(yǎng)要求苛刻微生物，培養(yǎng)基中往往會(huì)使用動(dòng)物來源的有機(jī)氮源，如胰蛋白胨、牛骨胨、腦心浸出物等8，這給透明質(zhì)酸的市場應(yīng)用帶來一定的限制。隨著市場對(duì)食品、醫(yī)藥、保健品產(chǎn)品的安全性和可追溯性要求越來越嚴(yán)，替代動(dòng)物來源的有機(jī)氮源將成為一種趨勢。本文主要研究了透明質(zhì)酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，4種非動(dòng)物源蛋白胨（酵母蛋白胨fp103，小麥蛋白胨fp450，大豆

5、蛋白胨fp420，非動(dòng)物源混合蛋白胨fp501）對(duì)動(dòng)物源蛋白胨的替換，這為透明質(zhì)酸無動(dòng)物源培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了借鑒和指導(dǎo)意義。蛋白胨，是高蛋白原料經(jīng)過水解生產(chǎn)而成的，富含多肽、氨基酸、礦物質(zhì)離子等營養(yǎng)，主要用作微生物發(fā)酵的氮源。根據(jù)蛋白質(zhì)的來源不同，蛋白胨分為動(dòng)物源、植物源和酵母源，目前透明質(zhì)酸工業(yè)生產(chǎn)主要使用牛骨蛋白胨。1. 材料與方法1. 菌種：獸疫鏈球菌2. 培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：葡萄糖 5g/l，酵母浸粉fm408 5g/l，胰酪蛋白胨fp318 15g/l，k2hpo4 2g/l，mgso47h2o 1g/l，ph 7.0發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 70g/l，酵母浸粉fm408 6g/l，蛋白

6、胨19.5g/l，k2hpo4 2g/l，mgso47h2o 1g/l，味精 4.5g/l，ph 7.03. 實(shí)驗(yàn)方法菌種在斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，接種到液體搖瓶培養(yǎng)中，500ml搖瓶裝液量200ml，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，37培養(yǎng)24h備用。5種蛋白胨的應(yīng)用對(duì)比測試，使用3l發(fā)酵罐。發(fā)酵罐裝液量1.8l，初始攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵10h后，每隔1h提高轉(zhuǎn)速50rpm至發(fā)酵結(jié)束。初始通氣量為0.5l/min，發(fā)酵10h后調(diào)整通氣量為1l/min，發(fā)酵14h后提高通氣量為1.5l/min。整個(gè)發(fā)酵過程，通過流加naoh維持ph為7.0。4. 檢測方法1. 葡萄糖、乳酸檢測方法：取發(fā)酵液稀釋2

7、0倍，5000rpm離心5min，取上清液，使用深圳西爾曼m900生物傳感器檢測葡萄糖和乳酸含量。2. od值檢測方法：取發(fā)酵液稀釋至合適倍數(shù)，用紫外-可見光分光光度計(jì)在600nm處進(jìn)行檢測。3. 透明質(zhì)酸檢測方法：采用bitter-muir氏法9。表1 6種蛋白胨的蛋白來源和參數(shù)對(duì)比蛋白胨名稱蛋白來源氨基氮(%)總氮(%)氨基氮/總氮酵母蛋白胨fp103酵母4.013.50.296大豆蛋白胨fp420大豆2.413.00.185小麥蛋白胨fp450小麥1.913.20.176混合蛋白胨fp501酵母、大豆、小麥2.913.30.218牛骨胨fp326新鮮牛骨2.615.10.172生產(chǎn)用骨胨

8、牛骨、未知3.515.20.230生產(chǎn)用骨胨，由透明質(zhì)酸生產(chǎn)廠家惠贈(zèng)；酵母蛋白胨fp103、牛骨蛋白胨fp326均由安琪酵母股份有限公司提供；大豆蛋白胨fp420、小麥蛋白胨fp450、混合蛋白胨fp501均由實(shí)驗(yàn)室制備。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(a) (b)(c) (d)(e) (f)圖1 透明質(zhì)酸發(fā)酵參數(shù)趨勢圖a. 生產(chǎn)用骨胨，(b) 牛骨胨fp326，(c) 酵母蛋白胨fp103，(d) 大豆蛋白胨fp420，(e) 小麥蛋白胨fp450，(f) 混合蛋白胨fp501由圖(a)和圖(b)可知，不同廠家、不同工藝的牛骨胨，對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響巨大。使用工業(yè)生產(chǎn)用牛骨胨，3h-6h為對(duì)數(shù)生長期，6

9、h-14h生物量仍保持持續(xù)的提升，終od值達(dá)到10.6；牛骨胨fp326的遲滯期較長，6h之后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，12h進(jìn)入穩(wěn)定期，od僅到9.0。表明生產(chǎn)用牛骨胨培養(yǎng)獸疫鏈球菌可促使其快速生長，且使菌體細(xì)胞活性保持更長的時(shí)間。同時(shí)，(a)組中葡萄糖在對(duì)數(shù)期迅速被消耗，轉(zhuǎn)變?yōu)榫w的積累，6h后乳酸合成達(dá)到20g/l后便不再大量合成；而使用純牛骨胨fp326，葡萄糖消耗速率慢，在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)乳酸不斷積累，18h乳酸含量超過30g/l。更為重要的是，使用生產(chǎn)用骨胨培養(yǎng)，透明質(zhì)酸在14h開始迅速合成，18h達(dá)到9.43g/l，而使用牛骨胨fp326組透明質(zhì)酸產(chǎn)率僅4.6g/l。圖(c)、(d)、(e

10、)、(f)顯示的是不同的非動(dòng)物源蛋白胨培養(yǎng)獸疫鏈球菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵過程圖，由圖可知，酵母蛋白胨fp103對(duì)于菌體的生長有極明顯的促進(jìn)作用，14h的od值達(dá)到12，高于其他組，透明質(zhì)酸產(chǎn)率5.2g/l。大豆蛋白胨fp420培養(yǎng)組遲滯期較長，9h對(duì)葡萄糖基本不消耗，在生長后期菌體有衰亡，最終菌體量、透明質(zhì)酸產(chǎn)率均較低。小麥蛋白胨fp450培養(yǎng)組od不到10，乳酸和透明質(zhì)酸產(chǎn)量均高于大豆蛋白胨和酵母蛋白胨，表明菌體活力高，最終葡萄糖消耗完全，大量轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，但代謝途徑更趨向產(chǎn)生乳酸。采用酵母、大豆和小麥源的混合非動(dòng)物源蛋白胨fp501培養(yǎng)，透明質(zhì)酸產(chǎn)率、發(fā)酵液od、葡萄糖消耗情況均和生產(chǎn)用骨胨接近

11、，透明質(zhì)酸產(chǎn)率超過生產(chǎn)用骨胨，達(dá)到9.55g/l。推測可能是不同來源的蛋白胨分別在促進(jìn)菌體量增長和產(chǎn)物積累上形成了優(yōu)勢互補(bǔ)。表2 不同蛋白胨對(duì)透明質(zhì)酸合成的參數(shù)對(duì)比蛋白胨名稱氨基氮/總氮od值乳酸(g/l)ha(g/l)酵母蛋白胨fp1030.29612.0628.85.23大豆蛋白胨fp4200.1859.8927.64.78小麥蛋白胨fp4500.1769.7950.55.96混合蛋白胨fp5010.21810.7722.19.55牛骨胨fp3260.1728.5732.04.77生產(chǎn)用骨胨0.23010.2723.19.43非動(dòng)物源混合蛋白胨fp501最終的od值保持在11左右，主要副產(chǎn)

12、物乳酸也被很好的控制，最終濃度為22.1g/l。發(fā)酵18h，透明質(zhì)酸的產(chǎn)率達(dá)到9.55g/l，與生產(chǎn)用牛骨胨相比，提高1.27%。三、討論透明質(zhì)酸的主要生產(chǎn)菌種獸疫鏈球菌，是一種對(duì)營養(yǎng)要求苛刻的乳酸鏈球菌，其為某些氨基酸的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，包括賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸等，另外對(duì)于自身代謝的一些基本營養(yǎng)物質(zhì)，也不能充足供給10-11。因而透明質(zhì)酸發(fā)酵第一個(gè)需要解決的問題是，發(fā)酵前期提供足夠豐富的營養(yǎng)，特別是獸疫鏈球菌不能自己合成的，生產(chǎn)上具體表現(xiàn)是遲滯期相對(duì)短，生物量上升緩慢。保持發(fā)酵后期細(xì)胞的代謝活力，抑制透明質(zhì)酸合成的競爭代謝流是保證透明質(zhì)酸高效合成的另一個(gè)難點(diǎn)。而由于透明質(zhì)酸的直接前

13、體udp-n-?；被咸烟鞘羌?xì)胞壁的重要成分，菌體量和單位細(xì)胞透明質(zhì)酸合成之間需要有一個(gè)平衡點(diǎn)，特別是發(fā)酵后期。通過篩選不同來源的蛋白胨進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，我們可以看到，不同的蛋白來源，不同工藝，對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的生物量、糖耗速率、乳酸含量和透明質(zhì)酸產(chǎn)率的影響是各不相同的。非動(dòng)物源蛋白胨fp501在3l發(fā)酵體系中可以達(dá)到生產(chǎn)用骨胨的同等水平，具備較強(qiáng)的替代可行性，這對(duì)未來透明質(zhì)酸的安全生產(chǎn)、產(chǎn)品認(rèn)證和質(zhì)量追溯上具有非常大的利好。但氮源調(diào)整后，對(duì)后續(xù)透明質(zhì)酸的提取、分子量大小的影響等，需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)1 albreeht c, schlegel w, eekl p, jagersb

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