植物組織培養(yǎng)報告_1

1、植物組織培養(yǎng)報告實驗報告大蒜莖尖的組織培養(yǎng)謝婷婷江宋青萬嫣文呂凌宇一、實驗目的掌握植物組織培養(yǎng)的相關理論知識及操作方法；通過自行設計并完成實驗，提高動手能力和思維能力；利用植物細胞的全能性，使大蒜莖尖經過脫分化作用形成愈傷組織，再分化為有結構的組織和器官，最終增殖培育出大量品質優(yōu)良的大蒜試管苗。二、實驗原理植物組織培養(yǎng)是利用植物細胞的全能性原理。植物組織培養(yǎng)是在無菌環(huán)境下，將離體的植物器官、組織以至單個細胞，在人工配置的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整植株的過程。植物的組織在培養(yǎng)條件下，原來已經分化停止生長的細胞，又能重新分裂，形成沒有組織結構的細胞團，即愈傷組織。這一過程

2、稱為“脫分化”。已經脫分化的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過程稱“再分化”。三、實驗材料、試劑和器材1 供試材料以購于府前菜場的大蒜為實驗材料，實驗在麗水學院生態(tài)學院組培實驗室進行。2 儀器與設備超凈工作臺、培養(yǎng)事、電子天平、燒杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液管。3 試劑70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、瓊脂條、6-ba（1.5 mg/l；2.0 mg/l）、2,4-d（2.0 mg/l）、naa（1.0 mg/l；）、iba（2.0 mg/l）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的鐵鹽、100倍的有機物。四、實驗步驟1.培養(yǎng)基

3、的配制及滅菌誘導培養(yǎng)基：ms+6-ba 2.0 mg/l+2,4-d 2.0 mg/l出芽培養(yǎng)基：ms+6-ba 1.5 mg/l+naa 1.0 mg/l 生根培養(yǎng)基：ms+iba 2.0 mg/l （1）將ms母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的鐵鹽、100倍的有機物）按順序排列、檢查是否失效。（2）在裝有3/4蒸餾水的容器中加入0.7%瓊脂和3%蔗糖，加熱溶化。（3）依次吸取適量各種母液移到容器中。（4）用蒸餾水定容到相應體積。（5）調節(jié)ph值(用0.1m的naoh或hcl調節(jié))至5.8-6.0。（6）向培養(yǎng)基中加入適量激素。（7）將配制好的培養(yǎng)基進行分裝（20-30m

4、l/瓶）。（8）用兩層稱量紙包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高壓滅菌鍋中121 下滅菌20 min 。取出三角燒瓶放在臺子上，冷卻后備用。接種操作所需的一切用具（燒杯、培養(yǎng)皿、滅菌水等），需同時滅菌。（9）將滅菌后的培養(yǎng)基于常溫下放置一星期，觀察有無污染。2 外植體的選取和消毒將大蒜剝去膜質外皮，選取完好的蒜瓣，放入加有洗潔精的自來水中浸泡30min，再用自來水沖凈。期間，用水和肥皂清洗雙手，穿上鞋套進入無菌操作室，打開超凈工作臺的紫外燈，進行消毒滅菌20min，然后關閉紫外燈。將洗凈后的蒜瓣放入無菌的空培養(yǎng)瓶中，帶入無菌超作室。用70%的酒精擦拭雙手及超凈工作臺，點燃酒精燈。把剪刀、鑷子等放

5、入95%的酒精中，在火焰上滅菌。將裝有洗凈后的大蒜的培養(yǎng)瓶放到臺面上進行消毒。由于大蒜蒜瓣較多，為使消毒徹底，將蒜瓣分成兩批分裝到兩個已滅菌的燒杯中。先用70%酒精消毒30s，倒掉酒精，再用0.1%的升汞消毒10min，用無菌水沖洗5次。將大蒜消毒滅菌后，取出放到裝有濾紙的培養(yǎng)皿上。將接種器材從90%的酒精中取出，放到酒精燈外焰上至上而下灼燒，放在培養(yǎng)皿上冷卻。之后，用無菌器械把蒜瓣縱著切開，小心地用解剖刀和鑷子切去蒜瓣肉質鱗片及稍大的葉片，取出蒜瓣內的莖，切取2-3mm的莖尖作為外植體。3 愈傷組織的誘導打開培養(yǎng)基，用火焰灼燒一下培養(yǎng)基的瓶口和瓶蓋，用鑷子夾住外植體，插入培養(yǎng)基中，每瓶接種5

6、個莖尖。再灼燒一下瓶口和瓶蓋，擰好蓋子。觀察愈傷組織的誘導情況。4 繼代培養(yǎng)待產生的愈傷組織長到直徑23cm時，將其從培養(yǎng)瓶中取出，將其切成適當大小。打開培養(yǎng)基，用火焰灼燒一下培養(yǎng)基的瓶口和瓶蓋，將切好的愈傷組織接入誘導培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每瓶接種3塊。再灼燒一下瓶口和瓶蓋，擰好蓋子。觀察增殖情況。 5不定芽的誘導 將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，切成1 cm1 cm的小塊，打開培養(yǎng)基，用火焰灼燒一下培養(yǎng)基的瓶口和瓶蓋，將切好的愈傷組織接入出芽培養(yǎng)基中，每瓶接種3塊。再灼燒一下瓶口和瓶蓋，擰好蓋子。觀察出芽情況。6根的誘導打開培養(yǎng)基，用火焰灼燒一下培養(yǎng)基的瓶口和瓶蓋，選取生長旺盛的再生芽，

7、從其基部與愈傷組織切離，接種于生根培養(yǎng)基中生根，每瓶接種1個芽，再灼燒一下瓶口和瓶蓋，擰好蓋子。觀察生根情況。7 觀察培養(yǎng)物的生長狀況每隔兩天觀察一次，檢查其生長狀況和被污染情況。及時照片記錄其生長情況（將培養(yǎng)瓶放在固定的位置，用相同的焦距拍下）。污染狀況根據培養(yǎng)基的狀況和外植體的表現(xiàn)來決定。五、實驗結果各階段培養(yǎng)物的污染率與成活率時間培養(yǎng)階段污染率成活率11.18-11.22 初代培養(yǎng)47% 53%11.23-12.19 繼代培養(yǎng)31% 69%12.20- 出芽培養(yǎng)/ /生根培養(yǎng)/ / 11月11日配置了誘導培養(yǎng)基并進行滅菌，一個星期后（11月18日）未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基有污染，因此開始進行實驗材料

8、的處理，取大蒜蒜瓣內的莖尖將其接到誘導培養(yǎng)基中，共接種了15瓶培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室內培養(yǎng)。四五天后，我們觀察到部分培養(yǎng)基中接進去2-3mm的莖尖外植體開始膨大，已長出愈傷組織，如圖1所示。同時，由于莖尖最尖端的細胞快速的分裂生長，部分外植體長成類似芽狀，有2-3cm高，如圖2。經分析，該外植體正好是莖尖最頂端部分，其細胞生長伸長較快，再加之培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，以至該外植體細胞能快速的分裂生長。然而，此部分僅是細胞的生長伸長，還未誘導出結構松散的呈細胞團狀的愈傷組織。期間，由于部分培養(yǎng)瓶已污染，留有的愈傷組織不多。為增殖出更多的愈傷組織，我們挑選出長勢較好的愈傷組織，在無菌室中取出培養(yǎng)瓶中的愈傷組織，

9、將其切割、離體后接種至新的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。圖1 圖2 十天后，大部分培養(yǎng)瓶莖尖基部切口邊處都已誘導出愈傷組織，如圖3、圖4所示。其表現(xiàn)為綠色、卵圓形、表面光滑的突起，突起大小不一，或密集或零散的分布于外植體切口的附近。而部分綠色的愈傷組織周圍還長有白色的組織，這是接種切取大蒜蒜瓣內的莖時部分莖段外緊貼著的幾層白色的細胞而長出的。 圖3 圖4一個月左右后，初代培養(yǎng)中的外植體大部分已誘導出愈傷組織，少部分可能由于外植體的自身因素的影響，誘導出的愈傷組織很小，或誘導出的不是愈傷組織（如圖1中的芽狀結構依舊保持該狀態(tài)）。而經繼代培養(yǎng)的愈傷組織不斷膨大，最終形成了直徑1cm，長2-3cm左右的愈傷

10、組織，如圖5-8。此時我們將愈傷組織轉移至出芽培養(yǎng)基，以誘導其產生叢生芽。圖5 圖6圖7 圖8至12月26日，此次設計性實驗結束。由于時間的限制我們小組的實驗僅做到這一步，即愈傷組織未再分化出芽。經統(tǒng)計后，經繼代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)的愈傷組織接到出芽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)瓶一共有9瓶，每瓶培養(yǎng)基中接有3塊愈傷組織。而未轉接到出芽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)瓶（即依舊進行初代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶）有7瓶，每瓶中大概接有3-5個外植體，其誘導的愈傷組織很小或者幾乎沒有。通過查閱參考文獻等資料，我們發(fā)現(xiàn)采用大蒜莖尖進行快繁培養(yǎng)，其愈傷組織的形成也大概要30天，而愈傷組織則需繼續(xù)培養(yǎng)50-60天，才能長出披針形的葉片，還待繼續(xù)培養(yǎng)才能發(fā)育成芽簇。因此，實驗中接入出芽培養(yǎng)基中的