CD19-CAR-T細胞制備工藝

1、-作者xxxx-日期xxxxCD19-CAR-T細胞制備工藝【精品文檔】CD19-CAR-T細胞制備工藝規(guī)程1 目的：制備符合規(guī)定、合格的CD19-CAR-T細胞2 范圍：3 職責：3.1 技術人：負責按本工藝規(guī)程進行細胞制備3.2 實驗室主管：負責本工藝規(guī)程的執(zhí)行。3.3 質量部：負責細胞制備全過程的監(jiān)督和管理。4 內容：4.1 產品名稱、劑型、規(guī)格：l 產品名稱： CD19-CAR-Tl 產品劑型： l 規(guī)格：100mLl 性狀： 液體l 存儲條件及效期： l 內包裝： 4.2 產品的質量標準：詳見XXX細胞質量標準4.3 儀器、設備一覽表：序號儀器設備性能要求序號儀器設備性能要求1潔凈工

2、作臺/生物安全柜A級8條碼打印機2二氧化碳培養(yǎng)箱9醫(yī)用40C冰箱3普通離心機10超低溫冰箱4掌上離心機11熱合機5倒置顯微鏡12水浴鍋6可調式移液器（移液槍）13細胞計數儀7電動輔助移液器144.4 試劑一覽表：序號試劑名稱規(guī)格1細胞培養(yǎng)基1L/瓶2細胞因子A1ug/uL3細胞因子B106 IU/mL4淋巴細胞分離液500mL/瓶6轉染增效劑8ug/mL7生理鹽水500mL/瓶8CD19-CAR-T慢病毒上清10mL/支4.5 耗材一覽表：序號耗材規(guī)格1細胞培養(yǎng)板24孔板6孔板2細胞培養(yǎng)瓶T25T75T1753培養(yǎng)袋2L/個4離心管15mL50mL250mL5移液管5mL10mL25mL6細胞

3、濾網100目/個7輸液袋100mL8巴氏吸管3mL/5mL9EP管4.6 試劑的配制：4.6.1 培養(yǎng)基：將1支106 IU的細胞因子B溶于1L培養(yǎng)基，配成完全培養(yǎng)基1。取40mL完全培養(yǎng)基1，加入2uL細胞因子A，配成完全培養(yǎng)基2。4.7 細胞制備工序要求：工序操作間潔凈級別設備名稱潔凈級別細胞制備制備室C級潔凈工作臺/生物安全柜A級細胞培養(yǎng)培養(yǎng)室C級CO2培養(yǎng)箱C級細胞收集制備室C級潔凈工作臺/生物安全柜A級4.8 細胞制備流程圖4.9 細胞制備：4.9.1 第0天：第0天外周血交接1、 技術員檢查： 存放血液的容器是否完好并密封； 標識是否清晰完整并正確； 血液是否結塊，是否有溶血； 血

4、液量是否與標識一致。2、 檢查確認合格后，填寫標本采集交接記錄，雙人簽名確認。3、 接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制備區(qū)。制備前準備1、 淋巴細胞分離液和培養(yǎng)基恢復至室溫。2、 準備好若干50mL離心管和24孔培養(yǎng)板。單個核細胞的分離提取1. 取出500uL全血置于一干凈的1.5mL EP管中，用于血液三分類和流式檢測。2. 將外周血用生理鹽水按1:1體積比稀釋。3. 加入15mL淋巴細胞分離液至50mL離心管管底，用25mL移液管將35mL血細胞小心緩慢鋪在淋巴細胞分離液上（電動移液器吹液速度為零）。4. 1800rpm,20 min 常溫離心，離心機升6降3。5. 小心移去生

5、理鹽水層，吸取白膜層至50mL離心管，補加生理鹽水至離心管滿體積,500g，5min 常溫離心。6. 倒去上清，加入生理鹽水,重懸細胞，常溫離心。洗2-3遍。7. 用完全培養(yǎng)基2重懸細胞，計數。T細胞重懸和誘導活化1、 按3106個細胞/mL/well鋪在24孔板上。2、 將24孔置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37，5%二氧化碳）培養(yǎng)。清場1、 將被血液污染的耗材棄置在生物安全垃圾袋中。2、 完全培養(yǎng)基1和2配制完后4度保存。注意事項1、4.9.2 第1天（細胞培養(yǎng)24小時）：第1天帶CD19-CAR慢病毒上清轉染T細胞1、將24孔板的細胞收集，用生理鹽水洗滌兩次，500g,5min常溫離心。2、用帶

6、CD19-CAR慢病毒上清重懸細胞，計數，并用病毒上清稀釋至終濃度3106個細胞/mL，加入總體積千分之一體積的轉染增效劑。3、1000g，離心，2h。 4、在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時后每個24孔板的孔補加500uL完全培養(yǎng)基1。注意事項1、4.9.3 第3天（轉瓶、補液）第3天轉瓶、補液1、將24孔板的細胞轉入T75的細胞培養(yǎng)瓶，并補充等倍體積的完全培養(yǎng)基1進T75的細胞培養(yǎng)瓶。注意事項1、4.9.4 第5天（轉袋、補液）：第5天CD19-CAR-T細胞轉袋補液1、 補充完全培養(yǎng)基1至400mL后，轉入2L的培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項1、 轉袋后間隔1天攤開手掌輕壓一下培養(yǎng)袋，以推散細胞聚集。注意事項操作完，及時清場，并做好相關記錄以及細胞制備檔案填寫。清場1、4.9.5 第10天（收獲細胞）第10天收獲細胞1、將2L培養(yǎng)袋的細胞培養(yǎng)液分裝至225mL的離心管中，500g,5min。2、將細胞用生理鹽水洗兩次，并用100mL生理鹽水重懸。3、將細胞懸液過細胞濾網后，進袋，密封。注意事項1、細胞進袋前注意收集上清液留作質檢用。2、留取少量細胞用作表