第三章食品微生物檢驗(yàn)的試劑及配制

1、2021/8/2 - page 1 h:marcoindustryFood media 2021/8/2 - page 2 h:marcoindustryFood media l了解染色的基本原理。了解染色的基本原理。 l掌握常用染料的性質(zhì)及其染色的配制技術(shù)。掌握常用染料的性質(zhì)及其染色的配制技術(shù)。 l熟悉常用試劑、緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度的配熟悉常用試劑、緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度的配 制技術(shù)。制技術(shù)。 l了解培養(yǎng)基的種類及一些常見培養(yǎng)基的用途，了解培養(yǎng)基的種類及一些常見培養(yǎng)基的用途， 掌握一般培養(yǎng)基的配制技術(shù)。掌握一般培養(yǎng)基的配制技術(shù)。 2021/8/2 - page 3 h:marcoindus

2、tryFood media 一、染色原理一、染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué) 因素的作用而進(jìn)行的。 物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn) 象、滲透、吸附作用等。 化學(xué)因素：正負(fù)離子之間的相互吸引等。 2021/8/2 - page 4 h:marcoindustryFood media 染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑、苦 味酸等。 2. 堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié) 晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中性（復(fù)合）染料：如伊紅美蘭等，瑞脫氏（Wright）染 料和基姆薩

3、氏（Gimsa）染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物 ，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudanb)的染料 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 染料染料 細(xì)菌染色用的染料細(xì)菌染色用的染料 酸性染料酸性染料（陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與 帶陽電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。降低菌液的pH而使細(xì) 菌帶陽電時，就可用酸性染料染色。（伊紅、剛果紅） 堿性染料堿性染料（陽離子染料）：與帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合，細(xì)細(xì) 菌一般帶負(fù)電，菌一般帶負(fù)電，所以細(xì)菌染色所用的染料，常用堿性 染料（堿性復(fù)紅、美藍(lán)）。 復(fù)合染料復(fù)合染料：堿性染料與酸性染料的結(jié)合物（伊紅

4、美藍(lán)、 伊紅天青）。 單純?nèi)玖希簡渭內(nèi)玖希翰荒芘c被染物生成鹽類 堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的 物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋電質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長 于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷， 所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù) 紅或孔雀綠等)使其著色。 酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的 物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH值下 降時，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸 性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。 中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染 料如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。 2021/8/2 - page 7 h:marcoindustryFood media 2021/8/2 -

5、page 8 h:marcoindustryFood media l1. 1. 常用染料的溶解度常用染料的溶解度 表表3-13-1 l2. 2. 常用染料的配制常用染料的配制 2021/8/2 - page 9 h:marcoindustryFood media 一、緩沖液的配制技術(shù)一、緩沖液的配制技術(shù) 2021/8/2 - page 10 h:marcoindustryFood media l1.溶液濃度表示法溶液濃度表示法 l 2.物質(zhì)的量濃度溶液的配制方法物質(zhì)的量濃度溶液的配制方法 l 3.溶液溶液 濃度的調(diào)整濃度的調(diào)整 l4.常用酸堿的物質(zhì)的量濃度計(jì)算常用酸堿的物質(zhì)的量濃度計(jì)算 202

6、1/8/2 - page 11 h:marcoindustryFood media 2021/8/2 - page 12 h:marcoindustryFood media l血清學(xué)實(shí)驗(yàn)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)在第五章講解在第五章講解 2021/8/2 - page 13 h:marcoindustryFood media l 什么是微生物生化試驗(yàn)? l 指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝 產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細(xì)菌的類別、屬種的 試驗(yàn)。 l l 由于細(xì)菌各自酶系統(tǒng)不同，新陳代謝的產(chǎn)物也有所不同， 而這些產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性。為此，可利用生物 化學(xué)的方法來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易

7、區(qū)別的細(xì)菌。 細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法 1. 1. 在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培 養(yǎng)基的養(yǎng)基的pH值變化。值變化。 2. 2. 在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色 反應(yīng)。反應(yīng)。 3. 3. 根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。 4. 4. 根據(jù)細(xì)菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長情況。根據(jù)細(xì)菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長情況。 2021/8/2 - page 15 h:m

8、arcoindustryFood media l 1.待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。 l 2.待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。 l 3.遵守觀察反應(yīng)的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或 48小時。 l 4.應(yīng)做必要的對照試驗(yàn)。 l 5.提高陽性檢出率，至少挑取2-3個待檢的疑似菌落 分別進(jìn)行試驗(yàn)。 2021/8/2 - page 16 h:marcoindustryFood media l生化試驗(yàn)分類 l（一）糖（醇）類代謝試驗(yàn) l（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) l（三）有機(jī)酸鹽和銨鹽代謝試驗(yàn) l（四）酶類試驗(yàn) （一）（一）糖（醇）類代謝試驗(yàn)糖（醇）類代謝試驗(yàn) 1.糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)糖醇類發(fā)酵試驗(yàn) 2

9、.V-P試驗(yàn)試驗(yàn) 3.甲基紅（甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)）試驗(yàn) MR 1. 糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)糖醇類發(fā)酵試驗(yàn) 原理：原理：不同的細(xì)菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的不同的細(xì)菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的 代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解 12種糖醇種糖醇 ，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇 只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌。只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌。 糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)原理原理 不同微生物發(fā)酵糖的能力各異，產(chǎn)生的分解產(chǎn)物也不同，可以不同微生物發(fā)酵糖的能力各異，產(chǎn)生

10、的分解產(chǎn)物也不同，可以 作為細(xì)菌分類鑒定的手段。作為細(xì)菌分類鑒定的手段。 大腸埃希菌大腸埃希菌/產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌 葡萄糖葡萄糖CH3COCOOHHCOOH 甲酸解氫酶甲酸解氫酶 H2+ CO2 傷寒沙門菌傷寒沙門菌 葡萄糖葡萄糖CH3COCOOHHCOOH 指示劑：溴麝香草酚藍(lán)指示劑：溴麝香草酚藍(lán)pH6.3(黃黃)；6.3 pH7.2(藍(lán)藍(lán)) pH6.3pH7.2 舉例舉例 常用的糖醇常用的糖醇 單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖 三糖：棉子糖三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉多糖：菊糖、

11、肝糖、淀粉 醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇 2021/8/2 - page 21 h:marcoindustryFood media 2） l (1)試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有 l 酚紅、溴麝香草酚藍(lán)酚紅、溴麝香草酚藍(lán) 顏色反應(yīng)較敏感，但穩(wěn)定性較差顏色反應(yīng)較敏感，但穩(wěn)定性較差。 l 溴甲酚紫和酸性復(fù)紅溴甲酚紫和酸性復(fù)紅 比較穩(wěn)定比較穩(wěn)定，特別是對發(fā)酵遲緩的細(xì)菌特別是對發(fā)酵遲緩的細(xì)菌 ，培養(yǎng)時間較長培養(yǎng)時間較長，宜選，宜選則二者則二者。 l(2)培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管，半固體糖發(fā)酵管，固培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管

12、，半固體糖發(fā)酵管，固 體糖發(fā)酵管，雙糖體糖發(fā)酵管，雙糖(或三糖或三糖)高層斜面發(fā)酵管。高層斜面發(fā)酵管。 l 2）試驗(yàn)操作方法）試驗(yàn)操作方法 以無菌操作的方法將經(jīng)以無菌操作的方法將經(jīng) 分離培養(yǎng)的純種細(xì)菌分離培養(yǎng)的純種細(xì)菌用接用接 種針或環(huán)移取，接種于糖種針或環(huán)移取，接種于糖 發(fā)酵管中，若為半固體培發(fā)酵管中，若為半固體培 養(yǎng)基，則用接種針作穿刺養(yǎng)基，則用接種針作穿刺 接種。置接種。置361.0 置溫箱置溫箱 內(nèi)內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)經(jīng)一定時間經(jīng)一定時間(數(shù)小時數(shù)小時 至二周至二周)培養(yǎng)，然后培養(yǎng)，然后每天觀每天觀 察結(jié)果。察結(jié)果。 1 1. .糖發(fā)酵試驗(yàn)要注意杜氏小管的置入方法；糖發(fā)酵試驗(yàn)要注意杜氏小管的置入

13、方法； 2.2.在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防 止倒置的小管進(jìn)入氣泡。止倒置的小管進(jìn)入氣泡。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 杜氏小管灌裝 灌裝不好會使杜氏小管中有氣泡，影響觀察結(jié)果 。 首先將試管中裝滿培養(yǎng)液，然后用醫(yī)用注射器吸 取一定量培養(yǎng)液，排空其中空氣，將針頭伸到杜 氏小管底部(防止氣泡產(chǎn)生)，緩緩將培養(yǎng)液推入 杜氏小管直到凸起(表面張力作用)，再至過量以 至培養(yǎng)液潤濕杜氏小管外表，因培養(yǎng)液具有一定 粘滯力，它可使?jié)駶櫟亩攀闲」苜N著試管放入時 慢慢滑到試管底部，而不撞破試管底部。 氣 泡 導(dǎo) 管 氣 泡 陽性陽性陽性陽性 陰性陰性 培養(yǎng)基變?yōu)辄S色 培養(yǎng)基未變

14、色、培養(yǎng)基未變色、 無氣泡產(chǎn)生無氣泡產(chǎn)生 結(jié)果結(jié)果記錄：記錄： 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示表示 產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“ ”表示表示 不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示表示 2.V-P試驗(yàn)試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇（乙酰甲基甲醇 試驗(yàn)）試驗(yàn)） 1 1）原理：原理：某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙 酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的 氧氧化為二乙酰，在氧氧化為二乙酰，在-萘酚和肌酸的催化

15、作用下，二乙酰與蛋白胨中的胍萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中的胍 基生成紅色化合物，稱基生成紅色化合物，稱V VP P（+ +）反應(yīng)。反應(yīng)。 V.P. 試驗(yàn)(伏普試驗(yàn)) n 用來測定某用來測定某 些細(xì)菌利用葡萄些細(xì)菌利用葡萄 糖產(chǎn)生糖產(chǎn)生非酸性非酸性或或 中性末端產(chǎn)物中性末端產(chǎn)物的的 能力。能力。 某些細(xì)菌在糖代謝過程中，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸。某些細(xì)菌在糖代謝過程中，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸。 因不同細(xì)菌所含酶不同，進(jìn)一步對丙酮酸的代謝也不同。因不同細(xì)菌所含酶不同，進(jìn)一步對丙酮酸的代謝也不同。 大腸埃希菌大腸埃希菌 產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌 2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3+

16、2CO2 O2 + KOH CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3 CH3COCOCH3+胍基胍基 紅色化合物紅色化合物+ H2O VP試驗(yàn)陰性。試驗(yàn)陰性。 VP試驗(yàn)（試驗(yàn)（V）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理原理 舉例舉例 n應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。 本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用，一般情況下，前者 為陽性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸 桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律。 2）V.P.試驗(yàn) n 取取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1號接種大腸號接種大腸 桿菌，桿菌，2號接產(chǎn)氣桿菌，第號接產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌。支接未知菌。 n 37培養(yǎng)培養(yǎng) 48h后，加入后，加入40%

17、KOH 510滴，滴， 然后再加入等量的然后再加入等量的5%-萘酚溶液，萘酚溶液，用力振蕩用力振蕩，再，再 放入放入37溫箱中保溫溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度。，以加快反應(yīng)速度。 n觀察培養(yǎng)基的顏色變化。觀察培養(yǎng)基的顏色變化。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 （1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性， 記記V-P+ （2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記 V-P- 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) VPVP實(shí)驗(yàn)一定要注意開蓋振蕩！且反應(yīng)時間較長。實(shí)驗(yàn)一定要注意開蓋振蕩！且反應(yīng)時間較長。 中文名稱： 大腸埃希菌 菌株保藏編號： CVCC 303

18、8 特征特性： 非抗酸性 化能異養(yǎng) 最適溫度 37.pH7.27.4 不利用檸檬酸鹽不利用檸檬酸鹽 可發(fā)酵多種碳水可發(fā)酵多種碳水 化合物如：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇化合物如：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇 接接 觸酶陽性、氧化酶陰性、脲酶陰性觸酶陽性、氧化酶陰性、脲酶陰性.MR試驗(yàn)陽試驗(yàn)陽 性、性、VP試驗(yàn)陰性試驗(yàn)陰性 屬名： Escherichia 種名加詞： coli 3.甲基紅（甲基紅（MR）試驗(yàn)）試驗(yàn) 1 1）原理：腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中）原理：腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中 產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳產(chǎn)生丙酮

19、酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳 酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH H值下降值下降 至至pH4.5pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。以下，使甲基紅指示劑變紅。為甲基紅試驗(yàn)陽性為甲基紅試驗(yàn)陽性 ；有的細(xì)菌；有的細(xì)菌 使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pHpH5.45.4，甲基紅指示劑呈，甲基紅指示劑呈 桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。 檢測不同細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。檢測不同細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。 大腸埃希菌大腸埃希菌 葡萄糖葡萄糖 產(chǎn)

20、氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌 指示劑：指示劑： 甲酸甲酸 乙酸乙酸 乳酸乳酸 琥珀酸等琥珀酸等 分解分解 甲酸、乙醇和乙酰甲基甲酸、乙醇和乙酰甲基甲甲醇醇 pH5.4 葡萄糖葡萄糖 分解分解 甲基紅甲基紅pH5.4(橘黃色橘黃色)。 甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理原理 pH4.5pH5.4 舉例舉例 2）試驗(yàn)方法：）試驗(yàn)方法： 挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄 糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361 或或30 （以（以30 較好）較好） 培養(yǎng)培養(yǎng)35天，從第天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液起，每日取培養(yǎng)液1ml，加入甲，加入甲 基紅指示劑基紅指

21、示劑12滴，立即觀察結(jié)果。滴，立即觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 （1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈 淡紅色為弱陽性，記淡紅色為弱陽性，記MR+； （2）呈橘黃色或黃色為陰性，記）呈橘黃色或黃色為陰性，記 MR-，從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第，從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5 天仍為陰性，即可判定結(jié)果。天仍為陰性，即可判定結(jié)果。 MR-VP試驗(yàn)原理及照片 V-P 1.靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn) 2.H2S試驗(yàn)試驗(yàn) 3.尿素酶試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn) （二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) 1.吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) （靛基質(zhì)試驗(yàn)）（靛基質(zhì)試驗(yàn)） 1 1）原理

22、：某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲）原理：某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲 哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨 基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物?；郊兹┙Y(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 史上最快最全的網(wǎng)絡(luò)文檔批量下載、上傳、 處理，盡在： http:/ 吲哚試驗(yàn) n色氨酸分解反應(yīng)： n吲哚反應(yīng)： 不同微生物所含酶系統(tǒng)不同，某些細(xì)菌含有不同微生物所含酶系統(tǒng)不同，某些細(xì)菌含有色氨酸酶色氨酸酶，能夠分解，能夠分解 培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的色氨酸。培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的色氨酸。 大腸埃希菌大腸埃希菌 色氨酸色氨酸 產(chǎn)氣

23、腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌 色氨酸酶色氨酸酶 +H2O CH3COCOOH 吲哚吲哚 + 檢測：檢測： 吲哚吲哚 + 對二甲基對二甲基 氨基苯甲醛氨基苯甲醛 玫瑰吲哚玫瑰吲哚 +H2O玫瑰紅色玫瑰紅色 吲哚試驗(yàn)陽性吲哚試驗(yàn)陽性+ 吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理原理 吲哚陰性吲哚陰性 - 舉例舉例 2）試驗(yàn)方法：）試驗(yàn)方法： 取取3 3支胰蛋白水培養(yǎng)基培養(yǎng)基，支胰蛋白水培養(yǎng)基培養(yǎng)基，1 1號接種大腸桿菌，號接種大腸桿菌，2 2號號 接種產(chǎn)氣桿菌，接種產(chǎn)氣桿菌，第第3 3支接未知菌。支接未知菌。 37 37培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h48h48h。 沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚

24、試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 呈現(xiàn)玫瑰紅色呈現(xiàn)玫瑰紅色,為陽性反應(yīng)為陽性反應(yīng),記記+ 無紅色者無紅色者,為陰性反應(yīng)為陰性反應(yīng),記記- 靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片 靛基質(zhì)+ 2.硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn) 1 1）原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)）原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng) 基中的含硫氨基酸生成基中的含硫氨基酸生成H H2 2S S， H H2 2S S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或可與加入培養(yǎng)基中的鉛或 鐵離子生成黑色鐵離子生成黑色沉淀物PbS或 FeS，以此鑒別細(xì)菌。 l )FeS(SOHFeSO4SH SHNHCOCOOHCHOHCOOHSHCHNHCH

25、422 233222 黑色 2）方法與結(jié)果 (1)瓊脂穿刺法： 培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體 培養(yǎng)基。 操作：將試驗(yàn)細(xì)菌以接種針沿管壁穿刺接種到含醋酸 鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37 24-48h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時， 為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時，一定要沿培養(yǎng)基 管壁進(jìn)行。 (2)醋酸鉛試紙法： 培養(yǎng)基：含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基、浸有醋酸鉛的濾紙條。 操作：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，37培 養(yǎng)24-48h。 結(jié)果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 培養(yǎng)基底部呈黑色，培養(yǎng)基底部呈

26、黑色， 為陽性，記為陽性，記+ 培養(yǎng)基底部無黑色，培養(yǎng)基底部無黑色， 為陰性，記為陰性，記- 3. 尿素分解試驗(yàn)?zāi)蛩胤纸庠囼?yàn) 尿素酶（尿素酶（Urease）試驗(yàn)）試驗(yàn) 1 1）原理：有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生）原理：有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2 2個分子個分子 的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色 。培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒。培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細(xì)菌別細(xì)菌。 1 1）未接種）未接種 2 2）尿素酶陽性）尿素酶陽性 3 3）尿素酶陰性）尿素酶陰性 2）試驗(yàn)方法：）試驗(yàn)方法

27、： 挑取大量培養(yǎng)挑取大量培養(yǎng)1824h的待試菌，濃密涂布接種于尿素的待試菌，濃密涂布接種于尿素 瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、 4和和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性， 顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判天，作最終判 定。定。 尿素酶試驗(yàn)圖尿素酶試驗(yàn)圖 陽 性 3）結(jié)果觀察與記錄結(jié)果觀察與記錄 培養(yǎng)基呈粉紅色，為陽性，記培養(yǎng)基呈粉紅色，為陽性，記 + 培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記 - （三）（三

28、） 呼吸酶類試驗(yàn)呼吸酶類試驗(yàn) F氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) F過氧化氫酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn) F硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn) F氰化鉀試驗(yàn)氰化鉀試驗(yàn) 1. 氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) 1）原理）原理: 氧化酶使細(xì)胞色素氧化酶使細(xì)胞色素C氧化后，氧化型細(xì)胞色素氧化后，氧化型細(xì)胞色素C 再使再使鹽酸二甲基對苯二胺鹽酸二甲基對苯二胺氧化，使生成氧化，使生成玫瑰紅色到暗玫瑰紅色到暗 紫色紫色的醌類化合物的醌類化合物,再和再和-萘酚萘酚結(jié)合結(jié)合,生成生成吲哚酚藍(lán)吲哚酚藍(lán),呈呈 藍(lán)色反應(yīng)，為陽性藍(lán)色反應(yīng)，為陽性。 氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系 統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時，此酶首先使細(xì) 胞色素C氧化，

29、然后氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺 氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)c桿菌科陰性，弧菌科，非發(fā)酵菌陽性（個 別除外），奈瑟菌屬均陽性。 試驗(yàn)方法 取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二 甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐 漸加深； 再加-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi) 呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。 用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外， 也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，前者陽 性，而后者陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽 性。 異常結(jié)果： 奈瑟菌屬有腦膜炎奈瑟菌、淋病奈 瑟菌等9種致病菌，引起流行性腦脊髓膜炎 上呼吸道癥狀：鼻咽炎等全身感染癥狀：高熱、 出血點(diǎn)或瘀血點(diǎn)，腦膜炎

30、癥狀：頭痛、嘔吐、頸項(xiàng) 強(qiáng)直;引起淋病，引起新生兒淋病性眼結(jié)膜炎。 氧化酶試驗(yàn)注意事項(xiàng)： 試驗(yàn)時應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。 10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對 苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失 效，故應(yīng)經(jīng)常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試 劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。 試劑 1%鹽酸二甲基對苯二胺鹽酸二甲基對苯二胺 1% -萘酚萘酚-乙醇液乙醇液 藍(lán)色為+ 不變色或?yàn)榉奂t色為不變色或?yàn)榉奂t色為- 2. 過氧化氫酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn) 1）原理：）原理： 某些細(xì)菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫某些細(xì)菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫 后，可將過氧化氫分解生成水

31、和氧氣，產(chǎn)生氣泡，后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡， 即為陽性反應(yīng)。即為陽性反應(yīng)。 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 用滴管直接滴加用滴管直接滴加1%1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑鹽酸二甲基對苯二胺試劑1-21-2滴滴 在培養(yǎng)物上在培養(yǎng)物上, ,再加入再加入1% -1% -萘酚萘酚- -乙醇液乙醇液1-21-2滴滴, , 在在3030秒秒 內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。 3 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 在在3030秒內(nèi)呈藍(lán)色反應(yīng)秒內(nèi)呈藍(lán)色反應(yīng), ,為陽性為陽性, ,記記 + + 不變色或?yàn)榉奂t色者不變色或?yàn)榉奂t色者, ,為陰性為陰性, ,記記 - - 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 取固體培養(yǎng)基

32、上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻 片上（或試管），滴加片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊 脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+ 不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記- 3.硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn) 1）原理：某些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸）原理：某些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸 鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下

33、，亞硝酸鹽可生成 亞硝酸，亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺作用，生成重氮苯磺 酸，酸，重氮苯磺酸再與重氮苯磺酸再與-萘胺萘胺作用，生成作用，生成紅色紅色的化合物，的化合物， 呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。 試劑 A、對氨基苯磺酸試劑、對氨基苯磺酸試劑 B、-萘胺試劑萘胺試劑 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基 上接種，在上接種，在361 培養(yǎng)培養(yǎng)14天，每天取天，每天取2mL培培 養(yǎng)液養(yǎng)液,加入加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，試劑的等量混合物各二滴混勻， 立即觀察結(jié)果。立即觀

34、察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 呈現(xiàn)紅色，為陽性，記呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+ 若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記- 4. 氰化鉀試驗(yàn)氰化鉀試驗(yàn) 1）原理：）原理： 氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸可與呼吸 酶作用使酶失去活性酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長抑制細(xì)菌的生長,但有的細(xì)菌但有的細(xì)菌 在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細(xì)菌以此鑒別細(xì)菌. 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 取培養(yǎng)取培養(yǎng)2024h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，環(huán)， 接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡接

35、種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡 膠塞塞緊，膠塞塞緊，361 培養(yǎng)培養(yǎng)24 48h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 對照管有菌生長，試驗(yàn)管有菌生長為陽對照管有菌生長，試驗(yàn)管有菌生長為陽 性，記性，記+。 對照管有菌生長，試驗(yàn)管無菌生長為陰對照管有菌生長，試驗(yàn)管無菌生長為陰 性。記性。記-。 （四）毒性酶類試驗(yàn)（四）毒性酶類試驗(yàn) F溶血試驗(yàn)溶血試驗(yàn) F血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 1. 溶血試驗(yàn)溶血試驗(yàn) 1）原理：）原理： 某些細(xì)菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人某些細(xì)菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人 或動物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶或動物的紅細(xì)

36、胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶 血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 平板法平板法 試管法試管法 平板法平板法 將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，361 培養(yǎng)培養(yǎng)24 48h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。 溶血試驗(yàn)的溶血類型及現(xiàn)象溶血試驗(yàn)的溶血類型及現(xiàn)象 （1） （甲型）溶血（甲型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的 草綠色溶血環(huán)。草綠色溶血環(huán)。 （2） （乙型）溶血（乙型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血 環(huán)。環(huán)。 （3）（丙型）溶血（丙型）溶血: 菌落周圍無溶血環(huán)。菌落周圍無溶血

37、環(huán)。 甲型（甲型（-）溶血）溶血 乙型（乙型（-）溶血）溶血 丙型（丙型（-）溶血）溶血 （乙型）溶血（乙型）溶血 試管法 將待檢菌培養(yǎng)液與等量的將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在羊血球混合，在 361 培養(yǎng)培養(yǎng)16 18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng) 液可出現(xiàn)透明狀。液可出現(xiàn)透明狀。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 有溶血現(xiàn)象，為陽性，記有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+； 無溶血現(xiàn)象，為陰性，記無溶血現(xiàn)象，為陰性，記 - 2. 血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 1）原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿）原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿 中的纖維蛋白原

38、轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面， 形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝 固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。為陽性。 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 （1）玻片法：）玻片法： 取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一 滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5 min 內(nèi)內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，如血漿內(nèi)

39、出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁， 則為陽性則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。 有凝塊 均勻混濁 血漿 生理鹽水 血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) （2）試管法）試管法 取滅菌小試管取滅菌小試管3支，各加入血漿無菌水支，各加入血漿無菌水(1:1) 0.5ml，1支支 加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（或濃菌懸液）加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（或濃菌懸液）0.5ml；其余；其余2 支作對照管，支作對照管，1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌 懸液懸液0.5ml作陽性對照作陽性對照;另另1支加入營養(yǎng)肉湯或支

40、加入營養(yǎng)肉湯或0.9氯化鈉溶氯化鈉溶 0.5ml作空白對照。將作空白對照。將3管同時放管同時放37溫箱或水浴中培養(yǎng)，每溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5 h觀察一次，觀察一次， 4 h 內(nèi)無凝固現(xiàn)象者，觀察直至內(nèi)無凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時。小時。 陽性反應(yīng) 陰性反應(yīng) 不凝 固 少量、 零散凝 固 明顯的 塊狀凝 固 巨大 塊凝 固 完全凝固， 倒置不流動 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn) 3）試管法的結(jié)果觀察與記錄）試管法的結(jié)果觀察與記錄 空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固?？瞻讓φ展艿难獫{流動自如，陽性對照管血漿凝固。 試驗(yàn)管血漿凝固者為陽性；試驗(yàn)管血漿凝固者為

41、陽性； 均無凝固則為陰性。均無凝固則為陰性。 其他其他 檸檬酸鹽利用試驗(yàn) 1.有機(jī)酸鹽的利用試驗(yàn)有機(jī)酸鹽的利用試驗(yàn) 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 1）原理：）原理： 某些細(xì)菌能利用檸檬酸某些細(xì)菌能利用檸檬酸 鹽作為唯一碳源，分解枸鹽作為唯一碳源，分解枸 櫞櫞(檸檬檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；酸鹽生成碳酸鹽； 同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生 成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性， 使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由 淡綠轉(zhuǎn)為淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)色深藍(lán)色，為，為陽性陽性。 腸桿菌科各種細(xì)菌利用檸檬酸鹽的能力不同，有的菌可利用檸檬酸鈉作腸桿菌科各種細(xì)菌利用檸檬酸鹽的能力不同，

42、有的菌可利用檸檬酸鈉作 為碳源，有的則不能。為碳源，有的則不能。 大腸埃希菌大腸埃希菌 產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌 大腸埃希菌不能利用檸檬酸鹽，故不能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)大腸埃希菌不能利用檸檬酸鹽，故不能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng) 基上生長。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性?；仙L。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性。 產(chǎn)氣腸桿菌能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸產(chǎn)氣腸桿菌能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸 鹽產(chǎn)生鹽產(chǎn)生CO2，再生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑，再生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑 BTB由綠色變?yōu)樗{(lán)色。由綠色變?yōu)樗{(lán)色。

43、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 舉例舉例 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 挑取待檢菌，在西挑取待檢菌，在西 蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面 上密集劃線接種，在上密集劃線接種，在 361 培養(yǎng)培養(yǎng)14天，天， 每天觀察結(jié)果。每天觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄）結(jié)果觀察與記錄 斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基 斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色，斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色， 為陽性，記為陽性，記+； 無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面 仍為綠色者，為陰性，記仍為綠色者，為陰性，記- 檸檬酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片 陽性+ 2.三糖鐵（三糖鐵（TSI）試驗(yàn)）試驗(yàn) 1）三糖三

44、糖鐵鐵試驗(yàn)的原理試驗(yàn)的原理 如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基 全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜 面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加 之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后 為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃 色。色。 如果細(xì)菌又能分解含硫

45、化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部如果細(xì)菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部 變黑。變黑。 制好的培養(yǎng)制好的培養(yǎng) 基基 對照管對照管 斜面紅色，底斜面紅色，底 面黃色面黃色 培養(yǎng)基全培養(yǎng)基全 黃色黃色 斜面、底部黃斜面、底部黃 色，并產(chǎn)生色，并產(chǎn)生 H2S 斜面紅色，底部黃色，斜面紅色，底部黃色， 產(chǎn)生產(chǎn)生H2S 底面黃色，并產(chǎn)生底面黃色，并產(chǎn)生 CO2 2）試驗(yàn)方法）試驗(yàn)方法 以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿 刺接種并涂布于斜面，置刺接種并涂布于斜面，置361培養(yǎng)培養(yǎng)1824h， 觀察結(jié)果。觀察結(jié)果。 已知大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌原 理

46、？ 2志賀氏菌志賀氏菌3沙門氏菌沙門氏菌4大腸桿菌大腸桿菌 下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？ 2志賀氏菌志賀氏菌3沙門氏菌沙門氏菌4大腸桿菌大腸桿菌 思考題 提問：提問： 1.志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖， 不產(chǎn)生不產(chǎn)生H2S。在培養(yǎng)基上應(yīng)該產(chǎn)生什么現(xiàn)象？。在培養(yǎng)基上應(yīng)該產(chǎn)生什么現(xiàn)象？ 2.大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不 產(chǎn)生產(chǎn)生H2S。在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？。在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？ 3.沙門氏菌，能分解葡萄糖

47、，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S， 多數(shù)產(chǎn)氣，在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？多數(shù)產(chǎn)氣，在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？ 2021/8/2 - page 97 h:marcoindustryFood media 培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生 代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。 要求：應(yīng)具備要求：應(yīng)具備6大營養(yǎng)要素；物質(zhì)比例合適；必大營養(yǎng)要素；物質(zhì)比例合適；必 須滅菌。須滅菌。 l 營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無 機(jī)鹽和水機(jī)鹽和水 微生物的六大營養(yǎng)素微生

48、物的六大營養(yǎng)素 2021/8/2 - page 99 h:marcoindustryFood media l l l 營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì) 水水 碳源碳源 兼能源兼能源 氮源氮源 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 生長生長 因子因子 細(xì)胞的組成成分細(xì)胞的組成成分 提供細(xì)胞代謝的介質(zhì)提供細(xì)胞代謝的介質(zhì) 直接參與代謝過程直接參與代謝過程 降低細(xì)胞內(nèi)溫度降低細(xì)胞內(nèi)溫度 維持生物大分子的維持生物大分子的 天然構(gòu)象天然構(gòu)象 合成含氮物質(zhì) 提供能量 構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì) 提供能量提供能量 構(gòu)成細(xì)胞的組成成分；構(gòu)成細(xì)胞的組成成分； 作為酶的組成成分；作為酶的組成成分； 維持酶的活性；維持酶的活性； 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓；調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透

49、壓； 作為某些自養(yǎng)菌的能源作為某些自養(yǎng)菌的能源。 1.培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 維持細(xì)菌的代謝、維持細(xì)菌的代謝、 繁殖繁殖 2.培養(yǎng)基的分類 按成分的不同分 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基用途 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基pH的測定與調(diào)整 測定測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH 的標(biāo)準(zhǔn)溫度為的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士士2。調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH可用無菌的可用無菌的1mol/l氫氧化氫氧化 鈉溶液或鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶

50、液。鹽酸溶液。 一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終會比最終pH調(diào)高調(diào)高0.2左右，左右， 滅菌后基本合適。滅菌后基本合適。 二、培養(yǎng)基pH的測定與調(diào)整 測定測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫的標(biāo)準(zhǔn)溫 度為度為25士士2。調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH可用無菌的可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或氫氧化鈉溶液或10%碳酸碳酸 鈉溶液、鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。鹽酸溶液。 當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用時，宜用6mol/l磷酸或磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。氫氧化鉀溶液。 一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的一般高壓滅菌前培養(yǎng)

51、基的pH會比最終會比最終pH調(diào)高調(diào)高0.2左右，滅菌后左右，滅菌后 基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測均進(jìn)行測 定，并記下每次定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、 緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。的調(diào)節(jié)。 測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用酸度測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用酸度 計(jì)校正，如與所需計(jì)校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正

52、。調(diào)整不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH 后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。 三、常用培養(yǎng)基的制備技術(shù) 1.玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用 前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。 （1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121高壓蒸汽滅高壓蒸汽滅 菌菌3min后烘干，備用。后烘干，備用。 （2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙）試管管口用棉花塞

53、或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙 包扎好，包扎好，121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。后烘干，備用。 （3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端 ，然后用紙包后或裝，然后用紙包后或裝 入金屬吸管筒內(nèi)，于入金屬吸管筒內(nèi)，于121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。后烘干，備用。 還可以還可以160干熱滅菌干熱滅菌2h后，備用。后，備用。 2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) （1）培養(yǎng)基配方的選定 （2）培養(yǎng)基的制備記錄 （3）培養(yǎng)基成分的稱取 （4）培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 （5）培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 （

54、6）培養(yǎng)基的過濾澄清 （7）培養(yǎng)基的分裝 （8）培養(yǎng)基的滅菌 （9）培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 （10）培養(yǎng)基的保存 培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝 2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) （1）培養(yǎng)基配方的選定 同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因 此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外， 一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己 的使用目的，加以選用，記錄其來源。 （2）培養(yǎng)基的制備記錄 每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及 其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時 間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存 備查，

55、復(fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。 （3）培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最 好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種 成分即在配方做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊， 置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完 畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。 4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量 銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或 大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水 加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有

56、焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。 待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶 化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā) 而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。 5、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH 的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此， 對這個步驟，操作者應(yīng)隨時注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基 的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。 6、培養(yǎng)基的過濾澄清 液體培養(yǎng)

57、基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或 其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或 漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。 瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布 過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。 如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至5560C的培養(yǎng)基放入 大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入12個雞蛋的 蛋白，強(qiáng)力振搖35分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121C加熱20分鐘、取出趁熱以絨 布過濾即

58、可。 7、培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不 得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎 （現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝 瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先 清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng) 基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。 8、培養(yǎng)基的滅菌 一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如 無特殊

59、規(guī)定，即可用此法滅菌。 某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒， 以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體 液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。 瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55-60時，擺置成適當(dāng)斜面，待其自 然凝固。 9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞 被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。 將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。 用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24

60、48小時，如無菌生長或生長不好。 應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。 10、培養(yǎng)基的保存 培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平 板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽 （4）培養(yǎng)基各成分的混合和熔化 溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸 餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌， 防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。 在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入 容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中， 靜置1015min，攪拌，振蕩，或延長時間以促 進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時加熱，