雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列的原理與方法

1、 雙雙脫氧末端終止脫氧末端終止法法 測(cè)序測(cè)序的原理的原理 主講主講：氧氣：氧氣yunyun FrederickSanger 雙脫氧末端終止法雙脫氧末端終止法 l DNA聚合酶不能從聚合酶不能從 頭合成子鏈頭合成子鏈 l 如果如果dNTP的的3碳上碳上 沒有羥基沒有羥基 l ddNTP雙脫氧雙脫氧 核苷酸核苷酸 基本原理：基本原理： l DNA復(fù)制 l ddNTP的結(jié)構(gòu) l 聚丙烯酰胺凝膠 電泳 DNA復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制的特點(diǎn) 酶：DNA聚合酶 模板：?jiǎn)捂淒NA 底物：dNTP 引物：需要 引物的作用：提供3羥基 末端 ddNTP的特點(diǎn)的特點(diǎn) l DNA聚合酶不聚合酶不 能夠區(qū)分能夠區(qū)分dNTP 和

2、和ddNTP。 l ddNTP 3位不是位不是- OH，但，但5磷酸基磷酸基 團(tuán)正常。團(tuán)正常。 l ddNTP參入到寡參入到寡 核苷酸鏈的核苷酸鏈的3末端末端 后，后，DNA鏈鏈的延的延 長(zhǎng)會(huì)長(zhǎng)會(huì)被迫停止被迫停止。 聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn) 精度相當(dāng)高！精度相當(dāng)高！ 能分離長(zhǎng)度達(dá)能分離長(zhǎng)度達(dá) 300-500個(gè)堿基，個(gè)堿基， 而差別僅一個(gè)而差別僅一個(gè) 堿基的同系單堿基的同系單 鏈核苷酸序列。鏈核苷酸序列。 操作步驟操作步驟 1制備制備單單鏈模板與引物退火鏈模板與引物退火 2鏈鏈延伸延伸-終止終止反應(yīng)反應(yīng) 3. 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 4. 放射自顯影放射自顯影

3、5. 閱讀閱讀測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果 制備制備單鏈模板與引物退火單鏈模板與引物退火 雙鏈雙鏈DNA單鏈單鏈DNA 單鏈單鏈DNA 加入加入引物，引物， 加熱，退火加熱，退火 帶引物的模板單鏈帶引物的模板單鏈DNA 鏈延伸鏈延伸-終止反應(yīng)終止反應(yīng) 帶引物的模板單鏈帶引物的模板單鏈DNA 核素標(biāo)記核素標(biāo)記的的dNTP 分成四管分成四管 雙脫氧鳥苷雙脫氧鳥苷 雙脫氧腺苷雙脫氧腺苷 雙脫氧胸苷雙脫氧胸苷 雙脫氧胞苷雙脫氧胞苷 37下反應(yīng)下反應(yīng)5min后加入后加入 EDTA使使DNA聚合酶失活聚合酶失活 含有各種長(zhǎng)度含有各種長(zhǎng)度DNA分子的溶液分子的溶液 EDTA 乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸， 一種二價(jià)金屬一

4、種二價(jià)金屬 離子螯合劑，離子螯合劑， DNA聚合酶對(duì)聚合酶對(duì) Mg2+濃度十分濃度十分 敏感。敏感。 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 含有各種長(zhǎng)度含有各種長(zhǎng)度DNA分子的溶液分子的溶液 95加熱加熱 變性變性 冰上冰上冷卻冷卻 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 開始電泳開始電泳 電泳完成，得到凝膠電泳完成，得到凝膠 放射自顯影放射自顯影 電泳完成，得到凝膠電泳完成，得到凝膠 固定凝膠固定凝膠 真空抽干真空抽干 放入放入 X射線片夾射線片夾 得到得到X射線片射線片 與照相與照相機(jī)機(jī) 原理原理相似相似， 利用射線利用射線 使膠片使膠片感感 光，然后光，然后 通過顯影通過顯影 過程把過程把 “像像”顯示顯示 出來出來。 閱讀測(cè)序結(jié)果閱讀測(cè)序結(jié)果 一般是從下往