口蹄疫病毒快速檢測方法的建立

1、Asia1 Asia1 型口蹄疫病毒膠體金免疫 層析檢測方法的建立 導(dǎo)師： 姓名： 學(xué)號： 電話： 摘要 本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒, 標(biāo)記純化的抗 Asia1 型口蹄疫病毒的單克隆抗體, 將該標(biāo)記物與羊抗豚鼠 IgG 分別包被在 硝酸纖維素膜(Nitrocellulose membrane)上, 作為檢測帶和質(zhì)控帶。 經(jīng)條件優(yōu)化, 組裝成檢測 Asia1 型口蹄疫的診斷試紙條。 用該試紙條分別對 A、O 和 Asia1 型口蹄疫病毒抗原以及豬水泡病病 毒抗原等96份樣品進(jìn)行了檢測, 發(fā)現(xiàn)該試紙條不與口蹄疫病毒 A、O 型以及豬水泡病病毒抗原發(fā)生反應(yīng), 特異性良好。 用該試紙條對

2、口蹄疫細(xì)胞毒(TCID50為 6.25)的 10 倍系列稀釋液進(jìn)行 了檢測, 最低可以檢測到大約 10-5。該試紙條與其他傳統(tǒng)診斷方法的 符合率為 98.8%。 初步實驗確定該試紙條在 4下可保存 3 個月、37 和室溫下大概可 保存 1 周左右。 該試紙條是一種快速、靈敏、特異的 FMD抗原檢測方法, 對現(xiàn)場檢測 具有一定實用價值。 材料和方法 結(jié) 果 討 論 結(jié) 論 材料和方法 材料 Asia1 型 FMDV 及其他型 FMDV、豬水泡病病毒 (SVDV)乳鼠抗原、 健康乳鼠組織樣品 四氯金酸(HAuCl4)和聚乙二醇(PEG20000)、檸檬酸三鈉、碳酸鉀 酪蛋白、 牛血清白蛋白、聚乙二

3、醇 (PEG-1500)及 BSA NC膜、濾器和濾膜 玻璃纖維膜、無紡布、吸水墊、不干膠以及 PVC 墊板 材料和方法 單克隆抗體的純化及效價測定 體內(nèi)誘生腹水法：68周齡健康 Balb/c 小鼠, 按 0.5 mL/只腹腔注射經(jīng) 高壓滅 菌 的 液 體 石 蠟 , 710 d 后 每 只 小 鼠 腹 腔 接 種 11065106 個雜交瘤細(xì)胞, 經(jīng) 710 d 后可見小鼠腹部明顯膨大, 無 菌操作采集腹水。 腹水收集：腹水經(jīng) 1000 r/min離心 10 min, 棄去上層脂肪層, 收集中層 腹水, 70凍存?zhèn)溆谩?傳代：下層細(xì)胞仍可按前述方法繼續(xù)傳代誘生腹水, 以進(jìn)一步獲得大 量的單克

4、隆抗體。 材料和方法 膠體金的制備 檸檬酸三鈉還原法: 稱取 HAuCl4 用三蒸水配制成終濃度為0.01%的溶 液。取 100 mL 0.01% HAuCl4 溶液加熱至沸騰 , 迅 速 加入 新 配 制 的 1% 的 檸 檬酸 三 鈉溶 液2 mL, 繼續(xù)煮沸 , 直至溶液變成酒紅色, 冷卻后加入三蒸水恢復(fù)至原體積。 膠體金的鑒定方法：通過肉眼觀察和電鏡觀察 評價標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)量好的膠體金顏色呈酒紅色, 透明度好, 無混濁現(xiàn)象。 材料和方法 金標(biāo)記抗體的制備 離心法: 1) 取一定量的金溶液, 加入單克隆抗體后 , 攪拌 20 min,置于 4 30 min。 2) 按照金溶液體積的 0.04%

5、加入PEG20000 穩(wěn)定劑。 3) 攪拌 20 min, 置于 4, 2 h 以上。 4) 2000 r/min 離心 10 min, 棄沉淀。 5) 8000 r/min離心 30 min, 保留沉淀。 6) 將沉淀用金稀釋液懸浮,最終體積為原始體積的 8%。 保存?zhèn)溆茫河脽o紡紗浸濕, 于 37烤箱中 , 干燥平整成金標(biāo)記抗體反 應(yīng)膜備用。 材料和方法 測試條的組裝和切割 測試條的主要構(gòu)成： PVC 塑料板是反應(yīng)體的支撐物; 在塑料底板上分別將玻 璃纖維素膜、干燥金標(biāo)記單抗玻璃纖維素膜、已固定有配對單抗和羊抗豚鼠 IgG 的 NC 膜及吸水濾紙 試紙裁剪:裝配好的紙板按縱向剪切, 裁成寬度

6、為 4 mm 的條狀, 即為檢測試紙 條 NC 為反應(yīng)膜, 顯示整體系統(tǒng)的反應(yīng)結(jié)果 T 線、C 線兩點依次為檢測線、 對照線 手柄吸水墊為粗纖維吸水紙 PVC 與樣品吸收墊之間 , 以及 NC 膜之間都需要用膠固定 , 上層再粘貼一層 纖維布 , 可加速吸水。 材料和方法 測試條的初步試驗 分別用生理鹽水、 PBS(0.01 mol/L)和 Asia1 型FMDV(1:1000 稀釋)標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞毒 3 種液體進(jìn)行測試。 圖圖 1 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)免疫層析試紙條結(jié)構(gòu) 材料和方法 金標(biāo)試紙條的特異性試驗 用金標(biāo)試紙條分別對 Asia1 型、 A 型及 O 型FMDV 細(xì) 胞 毒 , C 型 表

7、達(dá) 抗 原 和 豬 水 泡 病 病 毒(SVDV)進(jìn)行測試。同時出現(xiàn)檢測線和質(zhì) 控線的判為陽性, 只有質(zhì)控線而無檢測線的為陰性, 若質(zhì)控線不出現(xiàn)為 無效需重新進(jìn)行測試。 金標(biāo)試紙條的敏感性試驗 將 Asia1 型 FMDV 細(xì)胞毒(毒價 TCID50 為 6.25)做 10 倍梯度稀釋 , 然 后用試紙條對不同濃度的Asia1 型 FMDV 進(jìn)行檢測。 金標(biāo)試紙條的穩(wěn)定性試驗 制備好的試紙條分別放在室溫、 4 冰箱、 37干燥恒溫箱 , 每間隔 一定時間后取出部分進(jìn)行檢測。觀察檢測線和質(zhì)控線有無、反應(yīng)線的 清晰度以及結(jié)合墊釋放金標(biāo)抗體的程度等。 材料和方法 金標(biāo)試紙條的符合率實驗 將國家口蹄疫

8、參考實驗室已定型確認(rèn)的田間樣品分別運用反向間接血 凝, 定型 RT-PCR 及所建立的膠體金試紙條進(jìn)行檢測。統(tǒng)計檢測結(jié)果 , 并 計 算 本 實 驗 所 建 立 的 方 法 與 其 他 方 法 的 符合率。 結(jié)果 單克隆抗體純化結(jié)果 采用飽和硫酸銨沉淀和 Sephacryl S-300 HR 層析法對 1B8、 5E1 和 5E2 這 4 株雜交 瘤細(xì)胞經(jīng)小鼠體內(nèi)誘生法所采集 到的腹水進(jìn)行純化。純化后的單 抗進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,如右圖 所示。 收集的蛋白中以 Ig抗重 鏈和輕鏈為主 , 分子量分別在 45.0 kD 和25.0 kD 左右, 2、 3 株單抗的電泳條帶符合預(yù)期的大 小，

9、1為陰性對照。 結(jié)果 膠體金的外觀顏色及電鏡觀測 制備的膠體金溶液呈酒紅色, 待其冷卻后加入一定量的蒸餾水 控制其濃度, 合格可用的膠體金 溶液檢測波長 OD520nm 在 1.11.2 范圍內(nèi)。工作中所制備 的膠體金直徑通過在透射電鏡觀 察顆粒大小。測得(n=250)平均 粒徑為(40.060.7)nm。符合標(biāo) 記用膠體金要求。 結(jié)果 金標(biāo)試紙條特異性試驗結(jié)果 從試驗結(jié)果中可以看出 , 所制備的試紙條與 Asia1 型 FMDV 發(fā)生反 應(yīng), 而與 陰性對照及PBS均不發(fā)生反應(yīng)。 結(jié)果 試紙條的特異性試 驗 分別與表達(dá)的Asia1 型細(xì)胞毒、乳鼠病 毒、 VP1蛋白發(fā)生 反應(yīng), 而與A型、O

10、 型及SVDV均不發(fā)生 反應(yīng)。 結(jié)果 試紙條的敏感性測試 將 Asia1 型口蹄疫細(xì)胞毒 (毒價為 6.25TCID50)做 10 倍梯度稀釋, 用 PBS 作陰性對照, 用全病毒液 作陽性對照, 結(jié)果見圖 4。 從圖中可以看出把 Asia1 型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒 10-5 稀釋仍然可以檢測到.。 結(jié)果 Asia1型口蹄疫金標(biāo)試紙條田間試驗 分別用反向間接血凝試劑盒和金標(biāo)試紙條檢測96份樣品的結(jié)果 討論 隨著口蹄疫病毒不斷變異, 新的變異株和亞型的不斷出現(xiàn), 給口蹄疫 的預(yù)防和控制帶來了極大的困難。由于口蹄疫病原的診斷首先要采集 疫區(qū)發(fā)病動物尚未潰破的新鮮水泡皮和水泡液, 由專人送至專門實驗 室

11、后方可進(jìn)行診斷, 一方面運輸過程中的不確定因素往往會引起樣品 腐敗, 產(chǎn)生假陰性、漏檢等結(jié)果, 從而貽誤確診的時機(jī), 另一方面還存 在因病料保存不善, 引發(fā)散毒的危險。而現(xiàn)有的口蹄疫診斷方法中, 病 毒分離、中和試驗、間接ELISA、RT-PCR等方法都必須在具備一定 條件的實驗室中才能完成。發(fā)展一種快速、簡便、無需專業(yè)人員和儀 器, 可在野外、田間進(jìn)操作的新型診斷方法已成為一項急需解決的問 題。 討論 口蹄疫有 7 個血清型, 因型間抗原性的明顯差異, 某個血清型的感染 康復(fù)動物不能交叉保護(hù)其他血清型病毒的攻擊。在特異性實驗中, 本 研究將各型 FMD 與其他水泡性疾病特別是 SVD 一同檢

12、驗, 檢測結(jié)果 顯示, 非 Asia1 口蹄疫病料結(jié)果均為陰性, 而對 FMD 血清型的鑒定符 合率為 100%, 由此證實該試劑盒檢測口蹄疫病毒時, 與臨床癥狀相似 疾病的病原無交叉, 無假陽性反應(yīng), 具有很好的特異性。 敏感性實驗結(jié)果顯示, 試紙條在檢測倍比稀釋的同型陽性參考樣本時, 隨著稀釋倍數(shù)的增加, 檢測帶的紅色條帶顯色越淺, 說明隨著病毒含 量的不斷減少, 試紙條的檢測能力不斷下降。通過與間接血凝試劑盒 以及 PCR 對比發(fā)現(xiàn), 金標(biāo)試紙條與間接血凝的結(jié)果完全一致。與傳統(tǒng) 診斷口蹄疫的方法相比, 金標(biāo)試紙條的樣品符合率為 98.75%。而且金 標(biāo)試紙條檢測迅速, 一般在35 min 就可以得出檢測結(jié)果。 討論 在本檢測方法的建立過程中, 采用磁力攪拌加熱裝置制備的膠體金, 可有效保證不同批次膠體金制備的實驗條件, 包括反應(yīng)容器、反應(yīng)時 間、攪拌速度等因素的一致性。 電鏡觀察膠體金平均粒徑為(40.060.70)nm, 顆粒外形均一, 尺寸變 異系數(shù)小, 可在NC膜上自由流動。根據(jù)文獻(xiàn)選擇40 nm膠體金顆粒, 因為這一尺寸的顆粒大小適中, 既易于辨識, 又不會影響蛋白質(zhì)與顆 粒表面的結(jié)合, 可使標(biāo)