(完整word版)實驗室做細胞常用染色(word文檔良心出品).doc

1、實驗室做細胞常用的細胞固定與染色方法一、爬片前蓋玻片處理方法對于懸浮培養(yǎng)的細胞，在進行各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細胞在長時間的染色過程中不從載玻片脫落，必須使其牢固貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細胞黏附的物質是經常采用的方法之一。能促進細胞黏附的物質主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸的涂布方法。1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如 Decon)浸泡 5min，間或振蕩。2、用自來水沖洗 5min。3、以 1鹽酸 70乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥 (至此即可用于普通染色 )。5、多聚 L- 賴氨酸 (1:10 溶于去離子水 )浸泡 5min，振蕩。6、入 60

2、烤箱 1 h，或室溫過夜干燥 (用于細胞化學、免疫細胞化學及原位雜交細胞化學 )。二、細胞固定常用方法固定細胞的目的在于把組織和細胞的原有結構盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細胞和組織內的各種酶失去活性，防止細胞和組織的各種分子變性、解離，使細胞的化學物質和酶能準確定位，并在以后的處理和制片過程中亦不發(fā)生改變和破壞。同時，固定還可使細胞的各部分易于著色，適于觀察、長期保存和分析。1.固定組織、細胞的基本原則：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。2.培養(yǎng)物的準備和固定前處理：各種細胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、

3、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。對雙蓋片懸滴培養(yǎng)物和懸液培養(yǎng)物來說，常通過離心收集細胞，PBS漂洗 23 次后，備固定制片；對蓋片單層培養(yǎng)物來說，將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，PBS 液漂洗 23次，以洗去血清和附著于細胞表面的殘渣，備固定用。3.常用固定液：常用的固定液分兩類，一類是以單一化學物質配成的固定液，稱簡單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸 )。另一類是用兩種或兩種以上化學物質配合成的固定液，稱混合固定液。如Mueller 固定液、Flemming 固液、 FAA 固定液、 Carnoy 固定液、 Ros

4、sman固定液、 Altmann 固定液、 Bouing 固定液等。不同的固定液對細胞的化學成分、酶類及細胞結構固定效果不同。因此，選擇合適的固定液是達到固定目的的基礎。(1)4甲醛 -PBS:甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無色，約含40甲醛。在很多情況下，甲醛常常產生多聚甲醛的白色沉淀。4甲醛 -PBS 使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織的外部形式，固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力較強，對組織固定均勻，能增強組織的彈性，大標本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色體、線粒體和高爾基體的固定液，在冷凍切片中，甲醛作固定劑具有顯著的優(yōu)點。用40甲醛水溶液

5、:PBS=1:9配方制備甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮為無色易揮發(fā)液體，用純冷丙酮(4 )固定細胞內酶效果較佳。(3)乙醇：乙醇又稱酒精，固定血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細菌和白細胞等效果優(yōu)良。無水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，還具有硬化和脫水的作用。作為固定用乙醇的適宜濃度為 70 100。乙醇的缺點是滲透力差，并使組織收縮。(4)醋酸：常用 0.3 5濃度的醋酸作固定劑。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白質，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它對細胞的膨脹作用顯著，這是由于它破壞了某些蛋白質分子的結合，所以，常用醋酸來減少其他固定劑引起的

6、細胞收縮。細胞學技術中，它能防止細胞收縮，并能較好地保存染色體，還能把染色質沉淀成為可染色的塊狀體。(5)苦味酸：苦味酸是黃色結晶體，強酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水溫變化而變化?？辔端峥梢猿恋戆椎鞍?、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，單獨使用時，造成組織嚴重收縮。它和其他藥物混合配制時，可以作為蛋白質的沉淀劑，同時可避免組織收縮、硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被廣泛采用。作固定用的最適濃度為 1。(6)鋨酸 (四氧化鋨 )：鋨酸是一種強氧化劑，不能同乙醇和甲醛混合使用。它的揮發(fā)性很強，揮發(fā)出來的氣體能固定結膜，對眼睛很有害，所以操作時應特別注

7、意。四氧化鋨是保存細胞結構的最好固定劑之一，配制時先在棕色試劑瓶中盛入 50100ml 0.1mol/L 磷酸緩沖液 (pH7.0 7.4)，再將裝有 1g 鋨酸的安培瓶放人 PBS 中，以玻棒擊碎安培瓶，搖蕩使鋨酸溶解，備用。常用的固定液濃度為 1 2。(7)戊二醛：戊二醛對組織的滲透率高，與蛋白質反應快，能較好地保存蛋白質，對微管和膜性結構保存亦比較好，并能較好地保存糖原。常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表 12-1 常用的戊二醛固定液配制方法Ph7.2 的 0.1mol/L磷酸緩沖液（ ml） 969692908825%戊二醛水溶液（ ml） 4681012戊二醛的終濃度1%1

8、.5%2%2.5%3%(8)甲醇醋酸固定液：甲醇：醋酸為3:1 的固定液是應用最廣的一種培養(yǎng)細胞固定劑。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，兩者結合，能使固定細胞形態(tài)不變。不僅最適用于固定染色體，而且固定的染色體適于Giemsa染色 (注意：此固定液宜現(xiàn)用現(xiàn)配)。(9)FAA 固定液：此固定液適用于固定蓋片單層培養(yǎng)的細胞，固定效果好。配制方法： 90ml 80酒精中加 5ml 冰乙酸和 5m140甲醛。(10)Carnoy 固定液： Carnoy 固定液是較好的非水溶性固定液，是顯示細胞化學成分 (如粘多糖等 )時常用的固定劑，固定、保真效果好，但穿透力差，適于固定培養(yǎng)的單層細胞。配制方法：60

9、ml 純酒精加 30ml 氯仿和 10ml 冰乙酸。(11)Bouin 固定液：用于固定雙蓋片法培養(yǎng)的標本，固定30 分鐘后，用 70酒精褪去苦味酸黃色，如不立即染色，可將標本保存在70酒精中。本試劑適于固定組織細胞的糖原。配制方法：先將75ml 飽和苦味酸 (100ml 水中加 1.2 1.4g)過濾，加入 25ml 福爾馬林 (40甲醛，有沉淀時禁用 )，最后加入 5ml 冰醋酸，混和后存于4冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。該固定液對組織細胞穿透力較強，固定效果較好，保存的細胞結構完好。但因偏酸(pH 為 33.5)，對抗原有一定損害。(12)4多聚甲醛 -PBS 固定液：多聚甲醛為白

10、色固體，在50ml 蒸餾水中加入 4g 多聚甲醛，加熱至 6070時，邊攪拌邊逐滴加入 2mol/LNaOH ，至液體清晰透明。用 1mol/LHCl 調節(jié) pH 至 7.4，冷卻后加入 0.01mol/LPBS 液至100ml，4保存。本試劑適于固定腎纖維蛋白和細胞骨架蛋白。三、常見的細胞染色方法1 普通染色觀察蘇木精 -伊紅 (hematoxylin-eosin，HE) 染色和 Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細胞作為標本保存的主要方法。對于貼壁培養(yǎng)的細胞，以生長于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks 液、PBS、BSS 或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2 次

11、，去除妨礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。對于懸浮培養(yǎng)細胞，須先經離心沉淀(1000rmin，10min)， 棄上清液后 (留少量液體 )， 將細胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風吹干。1.1HE 染色法1.1.1 染液配制(1)蘇木精染液：這里介紹鄂征(1995)改良的 Mayer 法。稱取 0.5g 蘇木精，5.0g銨礬或鉀礬， 0.1g 碘酸鈉加溫溶于70m1 蒸餾水。 再加入 30ml 甘油， 2ml冰醋酸?；靹颉＿^濾后即成母液?？砷L久保存。用蒸餾水以1:20 稀釋即成工作液，可用很長時間。每次染色前宜過濾，去除氧化膜。(2)伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將

12、0.5g 伊紅溶于 100m170乙醇或蒸餾水即成工作液。1.1.2 染色程序（1）用 10甲醛 (福爾馬林 )固定培養(yǎng)物 30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸餾水洗 1 次后，入蘇木精染液5 10min 染細胞核。（3） 入 0.5鹽酸 -70乙醇溶液 301min， 脫去胞質的著色。此時核呈紫紅色。（4）入堿性溶液堿化，使細胞核變成藍色。如果時間允許，最好用自來水(呈弱堿性 )長時間浸泡。也可入1NaHCO3 溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時間。（5）蒸餾水洗 1 min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。（6）入伊紅染液 30s1 min。（7）用梯度乙醇溶液脫水

13、：70、 90、 95乙醇各 30s1 min； 100(2 次)各 2min。如伊紅為乙醇溶液，略去70乙醇。（8）用二甲苯透明 2 次，各 5min。（9）樹膠封固。1.1.3 染色結果細胞核呈紫藍色或深藍色，大部分細胞的胞質呈粉紅色。如果胞質內含較多核糖體(例如淋巴細胞 )則亦呈藍色。1.2 吉姆薩染色法此法可將細胞核與胞質同時染色，故便捷快速；但染液配制技術不易準確掌握，效果常不如 HE 染色穩(wěn)定。1.2.1 吉姆薩 (Giemsa)染液的配制（1）取 1.5g 吉姆薩粉末放入50ml 甘油，置于 60溫箱，約 3h 后溶解。（2）取出后倒入 50ml 中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長久保存。需要注意的是，有的甲醇內含醋酸，會使染液中的伊紅沉淀出來，不利染色。（3）將母液與 0.1 mol LPBS