目的基因的克隆與分離鑒定

1、6 目的基因的克隆與分離鑒定目的基因的克隆與分離鑒定 目的基因的克隆目的基因的克隆 目的基因的分離鑒定目的基因的分離鑒定 v基因克隆與基因分離基因克隆與基因分離 1 1、克隆、克隆 個體水平上的克隆個體水平上的克隆 細胞水平上的克隆細胞水平上的克隆 分子水平上的克隆分子水平上的克隆 2 2、基因克隆、基因克隆 分子水平上的克隆，將某一段分子水平上的克隆，將某一段DNADNA或一個基因插入到或一個基因插入到 一個載體分子上，并導入特定的宿主細胞中，形成寄一個載體分子上，并導入特定的宿主細胞中，形成寄 主主/ /載體單元，稱為一個載體單元，稱為一個克隆?？寺?。 3 3、基因分離、基因分離 從復雜的

2、基因組中分離出單個具特定功能或特性的從復雜的基因組中分離出單個具特定功能或特性的 基基 因或因或DNADNA片段。片段。 該基因的功能或序列并不一定要了解。該基因的功能或序列并不一定要了解。 v基因工程或基因工程或DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物重組技術(shù)的前提條件是從生物 體基因組中分離克隆目的基因。體基因組中分離克隆目的基因。 確定其表達調(diào)控機制和生物學功能；確定其表達調(diào)控機制和生物學功能； 建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌 （細胞）；（細胞）； 將目的基因在體外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾；將目的基因在體外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾； 然后

3、轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人然后轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人 體基因治療。體基因治療。 v一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類： 另一類是利用另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至擴增技術(shù)甚至化學合成法化學合成法體外直接合體外直接合 成目的基因，然后將之克隆表達。成目的基因，然后將之克隆表達。 一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，基因文庫，即將某生物即將某生物 體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基 因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；因組文庫

4、中挑出含有目的基因的重組克??； 第一節(jié)第一節(jié) 目的基因的克隆目的基因的克隆 C PCR法法 B cDNA法法 A 鳥槍法鳥槍法 D 化學合成法化學合成法 E 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建 一、一、 鳥槍法鳥槍法 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 鳥槍法操作的改進 鳥槍法克隆目的基因的局限性 (一)鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 鳥槍法（鳥槍法（shot-gun approach)shot-gun approach)：隨機克隆供體細胞隨機克隆供體細胞 的全基因組的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程片段，然后通過快速有效的篩選程 序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，序從眾多克隆中分離

5、出含有目的基因的目的重組子， 進而獲得目的基因。進而獲得目的基因。 鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離。 1.1.染色體染色體DNA的切斷的切斷 超聲波處理：超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端；片段長度均一，大小可控，平頭末端； 全酶切：全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有 可能使目的基因斷開，大小不可控；可能使目的基因斷開，大小不可控； 部分酶切：部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基片段長度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。因完整。 2.2.與載體連接與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原

6、位雜交法或限制性酶切圖譜法如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法 篩選，則選擇多拷貝篩選，則選擇多拷貝克隆載體；克隆載體； 如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表表 達型載體；達型載體； 3.3.轉(zhuǎn)化受體細胞轉(zhuǎn)化受體細胞 如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能 使目的基因表達的受體細胞；使目的基因表達的受體細胞； 4.篩選含有目的基因的目的重組子篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的 建立）建立）

7、如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法 篩選，則選擇大腸桿菌作為的受體細胞。篩選，則選擇大腸桿菌作為的受體細胞。 問題問題 鳥槍法獲得的克隆群體龐大鳥槍法獲得的克隆群體龐大 以人的基因組為例，如果載體承受外源以人的基因組為例，如果載體承受外源DNADNA片段片段 的能力為的能力為1-3kb1-3kb；那么；那么, ,人類基因組人類基因組DNADNA需被切割成需被切割成 幾十萬個大小不等的片段；幾十萬個大小不等的片段； 每個片段都分別插入到一個載體分子上，這樣就每個片段都分別插入到一個載體分子上，這樣就 會形成由幾十萬個不同的重組分子組成的克

8、隆群體；會形成由幾十萬個不同的重組分子組成的克隆群體； 要想從如此巨大的克隆群體中篩選帶有目的基因要想從如此巨大的克隆群體中篩選帶有目的基因 的克隆，顯然是非常費事的。的克隆，顯然是非常費事的。 (二二) 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進 如果已知目的基因兩端的酶切位點，可用該酶處理如果已知目的基因兩端的酶切位點，可用該酶處理 染色體染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基然后與載體拼接，這樣可以保證目的基 因的完整性，從而提高重組子中因的完整性，從而提高重組子中目的重組子目的重組子的出現(xiàn)頻的出現(xiàn)頻 率。率。 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 使用

9、這一改進方法的前提條件是：使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切目的基因的酶切 圖譜已知。圖譜已知。 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的的SalI片段中，將染色體片段中，將染色體DNA用用SalI 切開，瓊脂糖凝膠電泳分離；切開，瓊脂糖凝膠電泳分離； 在連接前將在連接前將DNA片段進行分級分離片段進行分級分離 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 用刀片切下相當于用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小大小 區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收 DNA片段，然后與載體進行拼接。片段，然后與載體進行拼接。 v凝膠凝膠DNA片

10、段回收技術(shù)片段回收技術(shù) 凍融法凍融法 濾紙法濾紙法 吸附法吸附法 低融點凝膠法低融點凝膠法 溶解法溶解法 v凝膠凝膠DNA片段回收程序片段回收程序 1.1.切膠回收于離心管中；切膠回收于離心管中； 2.2.加入等體積的加入等體積的溶液溶液I I； 3.50-603.50-60水浴加熱約水浴加熱約1010分鐘至膠融分鐘至膠融解解； 4.4.加入到加入到DNADNA純化柱內(nèi)，室溫放置純化柱內(nèi)，室溫放置1 1分鐘分鐘； 5 5. .離心離心1 1分鐘，倒棄收集管內(nèi)的液體分鐘，倒棄收集管內(nèi)的液體； 6 6. .加入加入700700微升微升溶液溶液IIII，室溫放置室溫放置1 1分鐘分鐘； 7 7. .

11、離心離心1 1分鐘，洗去雜質(zhì)分鐘，洗去雜質(zhì)； 8 8. .加入加入500500微升微升溶液溶液IIII，最高速離心最高速離心1 1分鐘分鐘； 9 9. .將將DNADNA純化柱置于純化柱置于1.51.5mlml離心管上，加入離心管上，加入 3030ulul溶液溶液IIIIII至管內(nèi)柱面上，放置至管內(nèi)柱面上，放置1 1分鐘分鐘； 1010. .高速離心高速離心1 1分鐘，所得液體即為高純度分鐘，所得液體即為高純度DNADNA。 ( (三三) )鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大，需要了解目的基因的背景知識工作量較大，需要了解目的基因的背景知識 不能獲得最小長度的目的

12、基因不能獲得最小長度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu) 二、二、cDNA法法 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序法分離目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性 (一一) cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mRNA 1.c1.cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH3 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH3 TTTTTTTTTTTTTTp5 5ppp 5 G G AAAA

13、AAAAAAAAAAOH3 TTTTTTTTTTTTTTp5 cDNA第一鏈第一鏈 引物引物退火退火 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs 2.c2.cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 煮沸煮沸NaOH 自身引導法：獲得的雙鏈自身引導法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失端會有幾對堿基缺失 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3 AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT OH 3 KlenowdNTPs S1 TTTTTTTTTTTTTTp 5 DNA

14、pol dNTPs RNaesH 置換合成法：獲得的雙鏈置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺端也會有幾對堿基缺 失失 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAA OH3 TTTTTTTTTTTTTT p5 S1 5 AAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 3 T4-DNA ligase 5 AAAAAAAAAAAAAAp 3 TTTTTTTTTTTTTTOH 5 5AAAAAAAAAAAAAA 3 TTTTTTTTTTTTTT 5 dCTPTdT 引導合成法：獲得的雙鏈引導合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列 5ppp

15、5 G G AAAAAOH3 TTTTTp53HO 5ppp 5 G G AAAAACCCCCCCOH3 3 HOCCCCCCCTTTTTp5 3 HOCCCCCCCTTTTTp5 5 pGGGGGGG 3 HOCCCCCCC TTTTTp5 5 pGGGGGGGAAAAAOH3 NaOH退火退火 KlenowdNTPs 3.3.雙鏈雙鏈c cDNA的克隆的克隆 雙鏈平頭的雙鏈平頭的cDNA與載體的連接：與載體的連接： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾同聚物尾， 這

16、樣重組分子可通過加熱局部變性和這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理核酸酶處理 回收插入片段回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 (二二) cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性 并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 細菌或原核生物的細菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短 mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感， 分離純化困難分離純化困難 僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 三三 PCR法法 使用使用PC

17、R法克隆目的基因的前提條件是：法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目已知待擴增目 的基因或的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合 反應必需的雙引物反應必需的雙引物。 (一一)PCR法定向擴增目的基因的基本原理法定向擴增目的基因的基本原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，法，又稱為聚合酶又稱為聚合酶 鏈反應或鏈反應或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合聚合 程序。程序。 5 5 目的基因 變性加熱 5 5 引物退火 5 5 底物聚合 5 加熱變性 5 5 5 5 5 5

18、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 退火 引物 底物聚合 加熱變性 引物退火 底物聚合 1 2 3 5 由由Taq DNA聚合酶擴增的聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其產(chǎn)物中，其3末端總是會帶末端總是會帶 有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因因 為為Taq DNA聚合酶對聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基 的存在，克隆時即可以采取的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，末端加同聚尾的方法與載體拼接， 也可以使用專門

19、的也可以使用專門的T載體克隆。載體克隆。 (二二) PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序 5 5 A A T T5 5 PCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 T 載體載體 T7lacZ MCSoriApr 四四 化學合成法化學合成法 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略 化學合成的單元操作化學合成的單元操作 DNA化學合成的用途化學合成的用途 一、化學合成一、化學合成DNADNA的發(fā)展的發(fā)展 二、化學合成寡核苷酸片段的主要方法二、化學合成寡核苷酸片段的主要方法 磷酸二酯法磷酸二酯法 磷酸三酯法磷酸三酯法 亞磷酸三酯法亞磷酸三酯法 固相合成法固相合成法 自動化法自動化法 三、化學合成三、化學

20、合成DNADNA（寡核苷酸）的應用寡核苷酸）的應用 v作為合成基因的元件作為合成基因的元件 v作為測序的引物作為測序的引物 v作為核酸分析雜交的探針作為核酸分析雜交的探針 v用于基因定點誘變研究用于基因定點誘變研究 v作為作為PCRPCR反應的引物反應的引物 v作為重組作為重組DNADNA連接等的構(gòu)件連接等的構(gòu)件 (一一)化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成全基因合成 化學合成目的基因的前提條件是基因的化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：序列已知，有三種戰(zhàn)略： 1.小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火 根據(jù)目的基因全序列，分別合成根據(jù)目的基因

21、全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈堿基長的單鏈DNA小片段小片段 T4-DNAT4-DNA連接酶連接連接酶連接 連接入合適的載體連接入合適的載體 2.補釘延長法：補釘延長法： 混合退火混合退火 根據(jù)目的基因根據(jù)目的基因兩條互補鏈兩條互補鏈全序列，分別合成全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈堿基長的單鏈 DNA小片段以及小片段以及20-30堿基長的單鏈堿基長的單鏈DNA中片段中片段 T4-DNAT4-DNA連接酶連接連接酶連接 克隆入合適的載體克隆入合適的載體 KlenowKlenow酶聚合酶聚合 3.大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火 根據(jù)目的基因根據(jù)目的基因的的全序列，分別

22、合成全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈堿基長的單鏈DNA片段片段 T4-DNAT4-DNA連接酶連接連接酶連接 克隆入合適的載體克隆入合適的載體 KlenowKlenow酶聚合酶聚合 (二二)化學合成的單元操作化學合成的單元操作 v化學合成化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個 個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、基團保護、 縮合、氧化、去保護縮合、氧化、去保護等步驟；等步驟； v從反應機理上來講，從反應機理上來講，DNA化學合成有化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸

23、二酯法、磷酸三酯法、 亞磷酸液三酯法；亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有具體操作過程又有液相合成液相合成和和固相合成固相合成兩種形兩種形 式；式； v前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便，前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便， DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的。合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的。 化學合成的單元操作化學合成的單元操作 O H G H HH HO CH2 ODMT POMe N CH Me Me CH Me Me O H G H HH HO CH2 ODMT POMe N CH Me Me CH Me Me H DM

24、T： 二甲氧基三苯甲基 激活激活 縮合縮合氧化氧化脫取代基脫取代基 玻璃珠玻璃珠 連接臂連接臂 O H G H HH HO CH2 ODMT POMe O H A H HH HO CH2 O O (三三) DNA化學合成的用途化學合成的用途 合成天然基因合成天然基因 修飾改造基因修飾改造基因 設計新型基因設計新型基因 制備探針、引物、接頭制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、 干擾素基因等。干擾素基因等。 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等。如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等。 全基因合成的問題

25、全基因合成的問題 上述三種方法各有利弊：化學合成上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的的單片段愈單片段愈 短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本 較高；較高； 在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的 份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率 極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%，則則 合成合成50個堿基長的個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有單鏈大片段的總收率只有7.7% 第一節(jié)第一節(jié) 目的基

26、因的克隆目的基因的克隆 三、三、PCR法法 二、二、cDNA法法 一、鳥槍法一、鳥槍法 四、化學合成法四、化學合成法 五、基因文庫的構(gòu)建五、基因文庫的構(gòu)建 五、基因（組）文庫的構(gòu)建五、基因（組）文庫的構(gòu)建 基因文庫的基本概念基因文庫的基本概念 基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫的構(gòu)建程序 (一一) 基因文庫的基本概念基因文庫的基本概念 v基因庫與基因文庫基因庫與基因文庫 基因庫（基因庫（gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在）特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（基因文庫（gene library or gene bank） 將特定生物個體的全部將特定生物個體的全部DNA片

27、段連接入載體片段連接入載體DNA分子上，并分子上，并 導入受體細菌或細胞中，經(jīng)擴增產(chǎn)生的包含該生物全部基因?qū)胧荏w細菌或細胞中，經(jīng)擴增產(chǎn)生的包含該生物全部基因 組序列的克隆群體。（人工構(gòu)建）組序列的克隆群體。（人工構(gòu)建） 基因組文庫基因組文庫（含有全部基因）（含有全部基因） cDNA文庫文庫（含有特定時期或組織中蛋白質(zhì)編碼基因）（含有特定時期或組織中蛋白質(zhì)編碼基因） 根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： v基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略 用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體材料來自染色體DNA。 用用cDNA法構(gòu)建法構(gòu)建c

28、DNA文庫，文庫，材料來自材料來自mRNA。 v 在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的 mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的 cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚 胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基 因組文庫。 1.1.重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力； 2.2.載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆；載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克?。?3.3.克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序；克隆與克隆之間必須存在足夠

29、長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序； 4.4.克隆片段易于從載體分子上完整卸下；克隆片段易于從載體分子上完整卸下； 5.5.重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選； 6.6.具有較高的完備性。具有較高的完備性。 v基因文庫的質(zhì)量標準基因文庫的質(zhì)量標準 基因文庫的完備性是指：基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概 率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N N之間的關(guān)系可用下式表示：之間的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中：其中： P = P = 任一基因被克隆

30、（或存在于基因文庫中）的概率任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/ /生物基因組的大小生物基因組的大小 基因文庫的完備性基因文庫的完備性 F例如，人的單倍體例如，人的單倍體DNADNA總長為總長為2.92.9x10 x109 9bpbp，基因文庫中基因文庫中 克隆片段的平均大小為克隆片段的平均大小為1515kb,kb,則構(gòu)建一個完備性為則構(gòu)建一個完備性為0.90.9 的基因文庫至少需要的基因文庫至少需要4545萬萬個克??；個克隆； F而當完備性提高到而當完備性提高到0.99990.9999時時, ,基因文庫至少需要基因文庫至少需要18

31、0180萬萬 個克隆。個克隆。 （二）基因文庫的構(gòu)建程序（二）基因文庫的構(gòu)建程序 1.基因組基因組DNA的制備的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因用于基因 組文庫構(gòu)建的組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂；在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂； AA AA 制備的制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末 端的端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。 2. 基因組基因組DNA的切割的切割 用于基因組文

32、庫構(gòu)建的用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理片段的切割一般采用超聲波處理 和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證第二，保證DNA片段大小均一片段大小均一 超聲波處理后的超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝片段呈平頭末端，需加裝人工接頭；人工接頭； 部分酶切法一般選用部分酶切法一般選用四對堿基識別序列四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶，如如： Sau3A I或或Mbo I等，這樣等，這樣DNA酶解片段的大小可控；酶解片段的大小可控；

33、連接前，上述處理的連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分級 分離，分離，以杜絕不相干的以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！片段隨機連為一體！ 3. 載體和受體的選擇載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常 選裝載量較大的選裝載量較大的-DNA或考斯質(zhì)粒；或考斯質(zhì)粒； 對于大型基因組（如動、植物和人類）需使用對于大型基因組（如動、植物和人類）需使用YAC或或BAC載體；載體； 由于絕大多數(shù)真核生物的由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于小于10 kb，因此用于因此用于c

34、DNA 文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。 -DNA 上述幾種載體的最大裝載量如下：上述幾種載體的最大裝載量如下： 質(zhì)粒質(zhì)粒 考斯質(zhì)粒考斯質(zhì)粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC300 kb YAC400 kb v用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌大腸桿菌或或酵母菌酵母菌 4. 基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題 v在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應引起重視的問題是：在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應引起重視的問題是： 避免外源避免外源DNADNA片段之間的連接！片段之間的連接！ v為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列

35、措施的組合：為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離片段根據(jù)載體的裝載量分級分離 用堿性磷酸單酯酶除去用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團片段的末端磷酸基團 用用TdT酶在酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端片段的末端上增補同聚尾末端 第二節(jié)第二節(jié) 基因的分離基因的分離 一、基于基因功能的基因分離技術(shù)一、基于基因功能的基因分離技術(shù) 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分離技術(shù)插入作用的基因分離技術(shù) 三、基于基因圖譜的基因分離技術(shù)三、基于基因圖譜的基因分離技術(shù) 一、基于基因功能的基因分離技術(shù)一、基于基因功能的基因分離技術(shù) 1、

36、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列 2、根據(jù)基因的同源性分離目的基因、根據(jù)基因的同源性分離目的基因 3、根據(jù)、根據(jù)mRNA的特異性分離目的基因的特異性分離目的基因 1 1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列（功能克?。üδ芸寺。?將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，根據(jù)某些蛋白將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，根據(jù)某些蛋白 質(zhì)的氨基酸保守性合成寡核苷酸探針從質(zhì)的氨基酸保守性合成寡核苷酸探針從cDNAcDNA庫或基庫或基 因組文庫中篩選編碼基因；因組文庫中篩選編碼基因； 將相應的編碼蛋白制成相應抗體探針將相應的編碼蛋白制成相應抗體探針, ,從從cDNAcDNA載載 體表達

37、庫中篩選相應克隆。體表達庫中篩選相應克隆。 根據(jù)某些蛋白質(zhì)的氨基酸保守性設計特異引物，根據(jù)某些蛋白質(zhì)的氨基酸保守性設計特異引物， PCRPCR擴增出目的基因；擴增出目的基因； v某段連續(xù)氨基酸序列的簡并探針的序列設計某段連續(xù)氨基酸序列的簡并探針的序列設計 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile TGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA C T G G G T T C TGTATGGACGAAATGAA 此外還可以參考各種生物體的此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計 總探針類型：總探

38、針類型：2222=16 密集鋪板（密集鋪板（1-10萬）萬） 雜 交 挖 取 鋪 板 鋪 板 目的重組克隆 v文庫篩選文庫篩選 氨基酸序列氨基酸序列核苷酸序列核苷酸序列PCR 特異蛋白質(zhì)特異蛋白質(zhì) 目的基因目的基因 抗體抗體 基因文庫篩選基因文庫篩選 評價評價 優(yōu)點優(yōu)點 - 在單基因性狀的基因分離方面仍為在單基因性狀的基因分離方面仍為常用常用策略策略 缺點缺點 - 特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難* - 難以分離微量表達基因難以分離微量表達基因 - 無法研究無無法研究無蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因產(chǎn)物的基因 - 難以進行多基因控制性狀的基因分離難以進行多基因控制性狀的

39、基因分離 根據(jù)近緣物種間或進化關(guān)系較近的物種間功根據(jù)近緣物種間或進化關(guān)系較近的物種間功 能相關(guān)的基因間核苷酸序列的保守性，設計能相關(guān)的基因間核苷酸序列的保守性，設計 探針，從基因文庫中篩選并鑒定目的基因。探針，從基因文庫中篩選并鑒定目的基因。 2 2、根據(jù)基因的同源性分離目的基因、根據(jù)基因的同源性分離目的基因 v文庫篩選法文庫篩選法 保守序列保守序列 保守序列保守序列 F5個個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的比對結(jié)果轉(zhuǎn)錄因子基因的比對結(jié)果 A. cDNA的合成的合成 vcDNAcDNA末端快速擴增末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 以以mRNA為模

40、板，用依賴于為模板，用依賴于RNA的的DNA聚合聚合 酶酶(反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶)來催化合成來催化合成cDNA。目前商品化反。目前商品化反 轉(zhuǎn)錄酶有禽類成髓細胞病毒轉(zhuǎn)錄酶有禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶和 鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶。 B. 同源片段的克隆同源片段的克隆 簡并引物的設計簡并引物的設計 利用利用DNAman、DNAstar等軟件對等軟件對GENbank中已公中已公 布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列進行同布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列進行同 源分析，然后，根據(jù)基因的保守區(qū)設計合成一對簡并源分析，然后，根據(jù)基因的保守區(qū)設計合成一對

41、簡并 引物。引物。 簡并引物簡并引物:是指編碼單個氨基酸的所有不同堿基可能是指編碼單個氨基酸的所有不同堿基可能 性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。 v為了增加特異性為了增加特異性,可以參考密碼子使用表可以參考密碼子使用表,根據(jù)不同生根據(jù)不同生 物的堿基使用偏好物的堿基使用偏好,減少簡并性。減少簡并性。 Gene1: TTC TAT CAC GAG TGC TGG Phe Tyr His Glu Cys Trp TTT TAT CAT GAA TGT TGG Gene2: Degenerate Primer: 5-TT(T/C) TAT CA(T/C) GA(A/G) TG(T/C)

42、TGG-3 氨基酸序列氨基酸序列: : 為了增加特異性為了增加特異性，可以參考密碼子使用表可以參考密碼子使用表，根據(jù)不根據(jù)不 同生物的堿基使用偏好同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。減少簡并性。 簡并簡并PCR擴增同源片段擴增同源片段 瓊脂糖凝膠電泳對瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定；用潔凈的刀產(chǎn)物進行鑒定；用潔凈的刀 片在長紫外燈下切下含有目的片在長紫外燈下切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，片段的瓊脂糖凝膠， 放入放入1.5ml的微量離心管中；的微量離心管中；PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收產(chǎn)物回收試劑盒回收 目的片段。目的片段。 將回收的將回收的PCR產(chǎn)物連接至產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)

43、化大載體上，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌感受態(tài)，克隆目的片段，并測序鑒定。腸桿菌感受態(tài)，克隆目的片段，并測序鑒定。 C. cDNA 3末端序列的克隆末端序列的克隆 3RACE引物的設計引物的設計 根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設計基因特異的根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設計基因特異的 巢式引物巢式引物(nested PCR primer)。GSP1和和GSP2，巢式，巢式 PCR擴增擴增cDNA 3末端序列末端序列。 RNA的提取及的提取及cDNA的合成的合成 方法同前，但反轉(zhuǎn)錄引物不同方法同前，但反轉(zhuǎn)錄引物不同(帶有接頭序列帶有接頭序列)： QT: 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCA

44、TGACAGTG(T)18-3 可利用此接頭序列設計兩條接頭引物可利用此接頭序列設計兩條接頭引物Q1和和Q2。 Q1 Q2 巢式巢式PCR擴增擴增3-端端cDNA 以以QT引物反轉(zhuǎn)錄獲得引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，分別用基因為模板，分別用基因 特異引物特異引物GSP1與通用引物與通用引物Q1進行第一輪進行第一輪PCR； 將第一輪將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，分別用基倍作為模板，分別用基 因特異引物因特異引物GSP2與通用引物與通用引物Q2進行第二輪巢式進行第二輪巢式PCR； 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至產(chǎn)物并連接至 T載體，轉(zhuǎn)化大腸

45、桿菌載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5，利用，利用-互補及菌落互補及菌落 PCR篩選陽性克隆，并送測序公司測序。篩選陽性克隆，并送測序公司測序。 圖 ZmABC1-10 基因全長cDNA克隆 D. cDNA 5末端序列的克隆末端序列的克隆 5RACE引物的設計引物的設計 根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設計基因特異的巢式根據(jù)已獲得的基因的同源片段，設計基因特異的巢式 引物（引物（nested PCR primer）。）。GSP1和和GSP2，巢式，巢式PCR 擴增擴增cDNA 5末端序列。末端序列。 1）TaKaRa公司公司RACE原理原理 添加接頭序列添加接頭序列 以以RNaseH分解掉分解掉cDNA-

46、RNA雜交體中雜交體中RNA； 利用一利用一5端磷酸化的特異性引物對端磷酸化的特異性引物對mRNA進行反進行反 轉(zhuǎn)錄形成轉(zhuǎn)錄形成5端磷酸化的端磷酸化的cDNA第一鏈；第一鏈； 在在T4RNA連接酶的作用下將單鏈連接酶的作用下將單鏈cDNA環(huán)化或首環(huán)化或首 尾相連；尾相連； 用兩對基因特異性引物：用兩對基因特異性引物：A1、S1及及A2、S2分別分別 進行二次進行二次PCR擴增得到所需目的片段擴增得到所需目的片段 2） Clontech公司的公司的SMART 5 -RACE的原理的原理 以以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶M- MLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標準第

47、一鏈作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標準第一鏈cDNA； 利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反 轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的3末端時自動加上末端時自動加上3-5個個(dC)殘殘 基，退火后基，退火后(dC)殘基與含有殘基與含有SMART寡核苷酸序寡核苷酸序 列列Oliogo(dG)通用接頭引物通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以配對后，轉(zhuǎn)換為以 SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭； 然后用一個含有部分接頭序列的通用引物然后用一個含有部分接頭序列的通用引物 UPM（Universal Primer）作為上游引物，用一）作為上游引物

48、，用一 個基因特異引物（個基因特異引物（Gene Specific Primer，GSP） 作為下游引物，作為下游引物，PCR擴增目的基因擴增目的基因5末端的末端的 cDNA片段片段 3）Invitrogen的的 GeneRACER 5 -RACE的原理的原理 5 mRNA CAP3 Poly A tail Full-length mRNAm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA P/ Truncated mRNA P/ Non-mRNA CIP m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA 去磷酸化反應去磷酸化反應: 利用堿性磷酸酶利用

49、堿性磷酸酶(如牛小腸堿性磷酸酶，如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，水處理，水 解掉解掉RNA 5末端的磷酸。但末端的磷酸。但CIP不能破壞不能破壞mRNA5末端末端 的帽子結(jié)構(gòu)的帽子結(jié)構(gòu)； 去帽反應：去帽反應： 利用煙草焦磷酸酶利用煙草焦磷酸酶Tobacco Acid Pyrophosphatase （TAP）消化掉）消化掉mRNA5末端的帽子結(jié)構(gòu)末端的帽子結(jié)構(gòu)； m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAP/ TAP 接頭連接：接頭連接： 將經(jīng)去磷酸化和去帽處理的將經(jīng)去磷酸化和去帽處理的RNA轉(zhuǎn)入另一轉(zhuǎn)入另一PCR管中，加管中，加 入入RNA接頭片段，在接頭片段，

50、在RNA Ligase 作用下，將作用下，將RNA Oligo接接 頭連接于去帽的頭連接于去帽的mRNA5末端末端； AAAAAAAAAAAA RNA Ligase RNA Oligo AAAAAAAAAAAAP/ 反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄： 在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄獲得反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; RT AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAA RNA Oligo TTTTTTTTTTTTT 巢式巢式PCR： 利用接頭的通用引物利用接頭的通用引物UP（Universal Primer）和基因特）和基因特 異引物，巢式異引物，

51、巢式PCR獲得基因獲得基因5片段。片段。 UPGSP 5cDNA 巢式巢式PCR擴增全長擴增全長cDNA： 根據(jù)已獲得根據(jù)已獲得目的目的基因的基因的3序列序列和和5序列，設計基因特異序列，設計基因特異 的巢式引物的巢式引物5GSP和和3GSP，巢式，巢式PCR擴增擴增cDNA全長全長 序列。序列。 TTTTTTTTTTTTT 5GSP3GSP PCR 差別雜交差別雜交 Differential hybridization 扣除雜交扣除雜交 Substractive hybridization 抑制性消減雜交抑制性消減雜交Suppression substractive hybrid 差別顯示差

52、別顯示 Differential display 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) Gene chips 3 3、根據(jù)、根據(jù)mRNAmRNA的特異性分離目的基因的特異性分離目的基因 v差別雜交差別雜交(Differential hybridization)又叫差別篩選又叫差別篩選 (Differential screening)，適用于分離經(jīng)特殊處理而被，適用于分離經(jīng)特殊處理而被 誘發(fā)表達的誘發(fā)表達的mRNA之之cDNA克隆?？寺?。 v差別雜交差別雜交的技術(shù)基礎十分簡單，它不需要任何有關(guān)的技術(shù)基礎十分簡單，它不需要任何有關(guān) 目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要擁有兩種目的基因的核苷酸序列信息，但重要

53、的是要擁有兩種 不同的細胞群體。不同的細胞群體。 3.1 3.1 差別雜交差別雜交 1 1）差別雜交的操作程序）差別雜交的操作程序 mRMA mRMA cDNA探針探針 cDNA探針探針 cDNA cDNA文庫文庫 表達目的基因表達目的基因 mRNA的細胞的細胞 不表達目的基因不表達目的基因 mRNA的細胞的細胞 原初平板原初平板 影印影印 影印影印 2 2）差別雜交的局限性）差別雜交的局限性 差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐 度的度的mRNA而言，這個缺點就顯得更為突出。而言，這個缺點就顯得更為突出。 差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大

54、量的差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的 噬菌斑或克隆片段，因此成本較高、工作量較大。噬菌斑或克隆片段，因此成本較高、工作量較大。 由于兩套平行轉(zhuǎn)移的濾膜之間，由于兩套平行轉(zhuǎn)移的濾膜之間，DNA的保有量往的保有量往 往會有差別，導致雜交信號的強度不一致，從而降往會有差別，導致雜交信號的強度不一致，從而降 低了此法的可重復性。低了此法的可重復性。 不表達目的基因不表達目的基因 的總的總mRNA 表達目的基因表達目的基因 的總的總mRNA cDNA 雜交雜交 DNA-RNA 雜交分子雜交分子 游離的單鏈游離的單鏈 mRNA分子分子 3.2 3.2 扣除扣除( (消減消減) )雜交雜交(Sub

55、tractive hybridization) 差異分離程序差異分離程序 利用兩組細胞利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異種類的差異，分離克隆差異 mRNA所對應的所對應的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆因而這種程序較適用于分離克隆 新基因新基因 例如：例如：正常的大鼠正常的大鼠FR3T3成纖維細胞成纖維細胞中，有些新基因中，有些新基因 是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。 任務是：任務是：分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能。分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能。 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3細胞細胞

56、 正常的正常的FR3T3細胞細胞 總總mRNA 總總mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 單鏈單鏈cDNA 提取提取mRNA 合成合成cDNA 合成第二鏈合成第二鏈 克隆克隆 提取提取mRNA 共價交聯(lián)共價交聯(lián) 上柱上柱 原位雜交原位雜交 病毒誘導表達的基因病毒誘導表達的基因 cDNA克隆克隆 3.3 3.3 抑制性消減雜交抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH) FSSHSSH的核心技術(shù)是抑制性的核心技術(shù)是抑制性PCRPCR，它是一種將檢測子，它是一種將檢測子cDNAcDNA 單鏈標準化步驟和消減雜交步驟融為一體的技術(shù)；單鏈標準化

57、步驟和消減雜交步驟融為一體的技術(shù)； F抑制性抑制性PCRPCR是利用鏈內(nèi)復性優(yōu)先于鏈間復性的原理，是利用鏈內(nèi)復性優(yōu)先于鏈間復性的原理， 是非目標序列片段兩端的長反向重復序列在復性時產(chǎn)是非目標序列片段兩端的長反向重復序列在復性時產(chǎn) 生生“鍋柄樣鍋柄樣”結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)或“發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu)”而無法與引物配對，而無法與引物配對， 從而選擇性地抑制了非目標序列的擴增。從而選擇性地抑制了非目標序列的擴增。 (In excess) 總總mRNA （B） 總總mRNA （A） cDNA cDNA 電泳，電泳， 顯影顯影 比較差異條帶比較差異條帶 RT-PCR （加入已標記的加入已標記的dCTP) 3.4 差別顯示

58、差別顯示(Differential display) 基因芯片基因芯片(gene chip) 基因芯片又稱為基因芯片又稱為DNADNA微陣列微陣列(DNA microarray)，它是，它是 指通過微電子技術(shù)和微加工技術(shù)將大量特定序列的探針指通過微電子技術(shù)和微加工技術(shù)將大量特定序列的探針 有序地固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，有序地固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交， 通過雜交信號的強弱檢測靶分子的一種檢測工具。通過雜交信號的強弱檢測靶分子的一種檢測工具。 基因芯片技術(shù)上的特點是具有基因芯片技術(shù)上的特點是具有高度可行性、多樣性、高度可行性、多樣性、 微型化微型化和和自動化自動化

59、四大特點。四大特點。 激光共聚焦熒光掃描顯微鏡檢測雜交信號激光共聚焦熒光掃描顯微鏡檢測雜交信號 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分離技術(shù)插入作用的基因分離技術(shù) 1 1、原理：、原理： 由于插入的由于插入的DNADNA序列相當于人為地給目的基因加上一個序序列相當于人為地給目的基因加上一個序 列標簽，因此用此列標簽，因此用此DNADNA插入突變分離基因的技術(shù)又稱為插入突變分離基因的技術(shù)又稱為DNA 標簽法標簽法(DNA tagging).(DNA tagging). 當一段特定的當一段特定的DNA序列插入到基因組中某一個基因的內(nèi)序列插入到基因組中某一個基因的內(nèi) 部或其鄰近位點時，便會誘發(fā)該基因

60、發(fā)生突變，并最終導部或其鄰近位點時，便會誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導 致表型變化，形成突變體。如果此段致表型變化，形成突變體。如果此段DNA插入序列是已知插入序列是已知 的，則可作為的，則可作為DNA雜交的分子探針，從突變體基因組雜交的分子探針，從突變體基因組DNA 文庫中篩選到突變基因。再以突變基因為探針，從其原始文庫中篩選到突變基因。再以突變基因為探針，從其原始 個體的基因組個體的基因組DNADNA文庫中篩選目的基因。文庫中篩選目的基因。 v利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用使被插入的目的基因突變利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用使被插入的目的基因突變 失去活性，而轉(zhuǎn)座子的刪除作用又可使目的基因失去活性，而轉(zhuǎn)座子的刪