細(xì)胞生物學(xué)研究方法1

1、METHODS AND TECHNIQUES 第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法 進(jìn)行初步觀察 形成可驗(yàn)證的假說(shuō) 設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn) 收集資料 解釋結(jié)果 作出合理結(jié)論 查閱已 有知識(shí) Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana 生物學(xué)研究模式生物 不同物種享有共同分子機(jī)制 l第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)的觀察方法顯微技術(shù)顯微技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù) l第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)

2、技術(shù) l第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù) l第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 l光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。 l電子顯微鏡：以電子束為光源。 l1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng):光源、折光鏡和聚光鏡，有時(shí)附加濾光片控制 光的波長(zhǎng)。 光學(xué)放大系統(tǒng):目鏡和物鏡組成。 機(jī)械裝置 l2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。 Light Pathway of Microscope 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 l光學(xué)顯微鏡的分辨力光學(xué)顯微鏡的分辨力 R=0.61/NA 其中其中為入射光線波長(zhǎng)；為入射光線波長(zhǎng)； NA為鏡口率為鏡口率 sin/2， n=介質(zhì)折

3、射率； =鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角） 。 l顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)： 介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin /2的最大值小于1；油鏡介質(zhì)為香柏油，鏡 口率可接近1.5。 普通光線的波長(zhǎng)為400700nm，光鏡分辨力約 為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡 的最大有效倍數(shù)為1000X。 光鏡樣本制作 樣品 固定 包 埋 切片 染色 （如伊紅和美藍(lán)能 與蛋白質(zhì)結(jié)合；品 紅能與DNA結(jié)合） l特點(diǎn)：光源為短波光；特點(diǎn)：光源為短波光； l有兩個(gè)特殊的濾光片；有兩個(gè)特殊的濾光片； l照明方式通常為落射式。照明方式通常為落射式。 原理原理 Fluor

4、escence image, DNA in blue and Microtubules in green l用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光 觀察、基因定位、疾病診斷。觀察、基因定位、疾病診斷。 l用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描,形成立體圖 像，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。 l能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 l分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 l用途類似熒光顯微鏡，但可以排除焦平面以外光的干擾， 增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率。 laser confocal scanning microscope, LCSM 激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖(原理) LCS

5、M Image of a Xenopus Melanophore (爪蟾黑色素細(xì)胞） microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) / l把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差光程差或相位差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差振幅差，從 而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。 可用于觀察活細(xì)胞。可用于觀察活細(xì)胞。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通 光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。 1.環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。 2.相位板（annular phaseplate）：物

6、鏡中加了涂有氟化鎂的相 位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。 可用于觀察活細(xì)胞可用于觀察活細(xì)胞 l1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面 偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果， 能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可 略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像 的立體感更強(qiáng)。 l偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的 微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣 品反差且具有立體感。適于研究活細(xì) 胞中較大的細(xì)胞器。 微分干涉顯微鏡原理微分干涉顯微鏡原理 （六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopy） 計(jì)算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及 細(xì)胞

7、器的運(yùn)動(dòng) l聚光鏡中央有擋光片，照明光 線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被 標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物 鏡，因而視野背景是黑的，物 體邊緣是亮的。 l可觀察 4200nm的微粒子，分 辨率比普通顯微鏡高50倍。 l用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠 原、染色體等。 l光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏 振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 l載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。 淀粉 l采用組合方式，集普 通光鏡、相差、熒光、 暗視野、DIC、攝影 裝置于一體。 l自動(dòng)化與電子化。 （一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡 transmission electron micro

8、scope, TEM l以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與 加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 l由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、 記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 l分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。 l用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM C CW V 電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造 TEM LIGHT PATHWAY 電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別 分 辨 本 領(lǐng) 光 源 透 鏡 真 空 成 像 原 理 人

9、 眼 0.2mm 可 見(jiàn) 光 光 學(xué) 顯 微 鏡 200nm 可 見(jiàn) 光 (波 長(zhǎng)400 700nm) 利 用 樣 本 對(duì) 光 的 吸 收 形 成 明 暗 反 差 和 顏 色 變 化 100nm 紫 外 光 （ 波 長(zhǎng) 約200nm） 玻 璃 透 鏡 不 要 求 真 空 電 子 顯 微 鏡 接 近0.1nm 電 子 束 (波 長(zhǎng)0.01 0.9nm) 電 磁 透 鏡 1.33 10 -3 1.33 10 -5Pa 利 用 樣 品 對(duì) 電 子 的 散 射 和 透 射 形 成 明 暗 反 差 電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較 l(1) 超薄切片超薄切片 l用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50

10、nm的超薄 切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。 l通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水， 環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切 片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。 l用重金屬鹽(如磷鎢 酸或醋酸雙氧鈾) 染 色；吸去染料干燥 后，樣品凹陷處鋪 了一層重金屬鹽， 而凸出的地方?jīng)]有 染料沉積，從而出 現(xiàn)負(fù)染效果，分辨 力可達(dá)1.5nm左右。 Negative Stained Archaebacteria 金屬投影金屬投影 l亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后 斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴斷開(kāi)，升溫后，冰升

11、華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴 涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的 膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（replica）。）。冰凍斷裂與蝕 刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表 面結(jié)構(gòu)。 技術(shù)示意圖技術(shù)示意圖 an onion root tip cell with no etching. l斷面的三種處理方法： l蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ，主要用于觀察細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白） 培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 Clathrin衣被 快速

12、冷凍深快速冷凍深 度蝕刻技術(shù)度蝕刻技術(shù) (4) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要 應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核 磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Structural Biology,主要 研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系)的主要實(shí)驗(yàn)手段。 l20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 l分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距 離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大 倍率為0.2mm/10nm=20000X。 l電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)

13、器 收集二次電子成象。 CO 2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題。 Scanning electron microscope（ SEM） l工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面 激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)， 次級(jí)電子由探測(cè)器收集，并經(jīng)閃爍器轉(zhuǎn)變成光信號(hào)，再經(jīng) 光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變成電壓信號(hào)來(lái)調(diào)制熒光屏上電子 束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 l為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后， 要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次 級(jí)電子信號(hào)。 SEM LIGHT PATHWAY 人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞 酵母酵母 人類精子人類

14、精子 l原理：根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖 在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外 加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電 流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電 流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 l裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和 數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。 l分辨率：分辨本領(lǐng)高，橫向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。 l用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。屬非 破壞性測(cè)量。是納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具 掃描隧道顯微鏡原理 引自引自http:/www.iap.tuwi

15、en.ac.at STM image of a DNA molecule METHODS AND TECHNIQUES 激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖(原理) （六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopy） 計(jì)算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及 細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng) l以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與 加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 l由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、 記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 l分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。 l用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。 電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別 分 辨 本 領(lǐng) 光 源 透 鏡 真 空 成 像 原 理 人 眼 0.2mm 可 見(jiàn) 光 光 學(xué) 顯 微 鏡 200nm 可 見(jiàn) 光 (波 長(zhǎng)400 700nm) 利 用 樣 本 對(duì) 光 的 吸 收 形 成 明 暗 反 差 和 顏 色 變 化 100nm 紫 外 光 （ 波 長(zhǎng) 約200nm） 玻 璃 透 鏡 不 要 求 真 空 電 子 顯 微 鏡 接 近0.1n