堿性磷酸酶比活力測定課件

1、堿性磷酸酶比活力測定1 堿性磷酸酶比活力的測定堿性磷酸酶比活力的測定 堿性磷酸酶比活力測定2 1.1.學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法 掌握堿性磷酸酶比活測定的方法掌握堿性磷酸酶比活測定的方法 一、目的要求 堿性磷酸酶比活力測定3 二、原理二、原理 （一）、比色分析法（一）、比色分析法 光的互補示意圖光的互補示意圖 1. 物質(zhì)的顏色和波長：物質(zhì)的顏色和波長： 可見光：波長（可見光：波長（）400760nm 紫外光：紫外光：小于小于400nm 紅外光：紅外光：大于大于760nm 2. 溶液的顏色和光吸收的關(guān)系：溶液的顏色和光吸收的關(guān)系： 溶液的顏色，是由于不同的有色物

2、質(zhì)有選擇地吸收某種顏溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏 色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相 互補的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深?；パa的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。 堿性磷酸酶比活力測定4 3. 物質(zhì)濃度，液層厚度與光吸收的關(guān)系物質(zhì)濃度，液層厚度與光吸收的關(guān)系 （Lambert-Beer定律）：定律）： 當(dāng)一束單色光通過溶液后，光被溶液吸收的程度（當(dāng)一束單色光通過溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 與溶液的濃度（與溶液的濃度（C），），液層的厚（液層的厚（L）以及入射光的強以及入射光的強

3、 度（度（I0）有關(guān)。溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多，有關(guān)。溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多， 這就是物質(zhì)（均勻透明固體，液體，氣體）對光的吸收這就是物質(zhì)（均勻透明固體，液體，氣體）對光的吸收 定律。定律。 堿性磷酸酶比活力測定5 4. 待測溶液濃度的計算：待測溶液濃度的計算： （1 1）標(biāo)準(zhǔn)管法：）標(biāo)準(zhǔn)管法： 在同樣條件下，測得標(biāo)準(zhǔn)液和待測液的光密度（在同樣條件下，測得標(biāo)準(zhǔn)液和待測液的光密度（D D） 值，然后計算：值，然后計算： C C未知 未知 = =（D D未知 未知/ /D D標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)） ）C C標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn) （2 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：）標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 分析大批待測樣品時，采用此法較方便。

4、先配制一系列分析大批待測樣品時，采用此法較方便。先配制一系列 濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測出它們的光密度（濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測出它們的光密度（D D）值。值。 在一定濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（在一定濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（C C）與其光密度（與其光密度（D D）之之 間呈直線關(guān)系。以各管間呈直線關(guān)系。以各管D D為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，C C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線。待測溶液準(zhǔn)曲線。待測溶液D D值測出后，在曲線上查出值測出后，在曲線上查出C C。 堿性磷酸酶比活力測定6 1%1%濃度，濃度，1 1cmcm厚度溶液中測得：厚度溶液中測得：K = E1cm1%K = E1cm1% 或克

5、分子濃度，或克分子濃度，cmcm厚度溶液中測得：厚度溶液中測得：K = K = C = D/E1cm%, C = D/E1cm%, 或或 C = D/C = D/ 常用于紫外吸收法測定蛋白質(zhì)，核酸含量，二者分常用于紫外吸收法測定蛋白質(zhì)，核酸含量，二者分 別在別在280280nmnm和和260260nmnm處有最大吸收，其消光系數(shù)可查處有最大吸收，其消光系數(shù)可查 到，在同樣條件下，測定待測溶液的光密度到，在同樣條件下，測定待測溶液的光密度, , 帶入帶入 上式即可求得上式即可求得C C。 （3 3）消光系數(shù)法：）消光系數(shù)法： 堿性磷酸酶比活力測定7 （二）、酶活力（二）、酶活力 在在37 C下，

6、以下，以5mmol/L pNPP為底物，在為底物，在pH 10.1的的 碳酸鹽緩沖液含碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L 的測活體系中每分的測活體系中每分 鐘催化產(chǎn)生鐘催化產(chǎn)生的酶量定為的酶量定為1個酶活力單個酶活力單 位。位。 酶的比活力定義為每酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位蛋白所具有的酶活力單位 數(shù)。數(shù)。 堿性磷酸酶比活力測定8 酶活性測定前處理酶活性測定前處理 1、2號樣品稀釋號樣品稀釋50倍（用洗脫液稀釋）倍（用洗脫液稀釋） 3號樣品稀釋號樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋）倍（用洗脫液稀釋） 4號樣品不稀釋（用洗脫液稀釋）號樣品不稀釋（用洗脫液稀釋） 蛋白濃度測定前處理蛋白濃度測

7、定前處理 1、2號樣品稀釋號樣品稀釋100倍（用洗脫液稀釋）倍（用洗脫液稀釋） 3號樣品稀釋號樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋）倍（用洗脫液稀釋） 4號樣品對倍稀釋（用洗脫液稀釋）號樣品對倍稀釋（用洗脫液稀釋） 堿性磷酸酶比活力測定9 12支試管，支試管，1-4做兩組平行測定管，做兩組平行測定管，01-04作為空白對照作為空白對照 管管 號號空白空白（01-04） 1-12-23-34-4 5 mM pNPP(mL) 各各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入各管加入0.2 mL H2O (mL) 各各0.

8、50mL 混勻，混勻，37，5分鐘分鐘 酶液（酶液（mL） /各各0.1mL 37，精確反應(yīng)，精確反應(yīng)10分鐘分鐘 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入各管加入2.0 mL 酶液（酶液（mL） 0.1mL OD 405 nm 堿性磷酸酶比活力測定10 蛋白濃度測定蛋白濃度測定 1. 測定測定100 g/mL牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白溶液的OD值值； 2. 將稀釋后的樣品在將稀釋后的樣品在280nm下測定吸光度；下測定吸光度； 3. 以洗脫液作空白。以洗脫液作空白。 蛋白濃度按下式計算：蛋白濃度按下式計算： 280280 OD C OD /100 未知 牛血清白蛋白mLg 堿性磷酸酶比活力測定11 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 單位時間單位時間0.1mL酶液催化產(chǎn)物量計算：酶液催化產(chǎn)物量計算： 克分子消光系數(shù)法克分子消光系數(shù)法 OD C 108 . 8OD )1 (/1 3 405 未知 ）（ 光程 cmLmolPNP 即即 C未知OD/(8.8103) 堿性磷酸酶比活力測定12 A V C = (mg/mL) Vt B =(U/mL) 2 1 蛋白濃度 酶活力 計算： 式中：A為稀釋倍數(shù)，B為由消光系數(shù)法計算得的 pNP m