愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用課件

1、愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 1 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 2 n免疫比濁回顧 n免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry） n在生化分析儀上進(jìn)行測(cè)定的有關(guān)問(wèn)題 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 3 免疫檢測(cè)的基礎(chǔ) 抗原抗體間的特異性反應(yīng)抗原抗體間的特異性反應(yīng) 手工操作 自動(dòng)化分析 核心核心基礎(chǔ)基礎(chǔ) 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 4 n免疫比濁技術(shù)是在免疫沉淀反應(yīng)（Precipitation）檢測(cè) 法的基礎(chǔ)上建立的。 n最早應(yīng)用的免疫沉淀反應(yīng)是Ouchterlony

2、在1948年建立 的瓊脂雙向擴(kuò)散法。 n1965年Mancini等和Fahey等分別建立了可以定量的單 向（輻射狀）免疫擴(kuò)散技術(shù)。 nLaurell等1966年建立了電免疫擴(kuò)散法，使報(bào)告結(jié)果的 時(shí)間由單向免疫擴(kuò)散法的24h縮短到4-5h。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 5 n經(jīng)典的免疫沉淀試驗(yàn)通常是在抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)的 終點(diǎn)判定結(jié)果，存在費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、敏感度低（10 100mg/L）、不能自動(dòng)化等缺陷。 n根據(jù)沉淀反應(yīng)時(shí)，抗原抗體結(jié)合后可使反應(yīng)系統(tǒng)透光 度發(fā)生改變，建立了以測(cè)定透光度為特征的微量免疫 沉淀測(cè)定法法，既免疫濁度測(cè)定技術(shù)。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析

3、在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 6 n1967年由Richie首次報(bào)告，20世紀(jì)70年代逐步完善， 80年代初期初步應(yīng)用臨床常規(guī)檢查。 n抗原抗體在液相（特殊的緩沖液）中快速結(jié)合，形成 抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 7 n液相中抗原與抗體的反應(yīng)結(jié)果與兩者的濃度比例有關(guān)。 抗原或抗體顯著過(guò)量時(shí)，都只能生成少量的可溶性免疫 復(fù)合物，分子極小，不適于免疫比濁法檢測(cè)。 n免疫比濁技術(shù)要求溶液中抗體要保持中等過(guò)量，此時(shí)免 疫復(fù)合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。 n在這種情況下，抗原與抗體的反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律（ Ag+AbAg.

4、Ab），形成IC的量是抗原或抗體的函數(shù)。 n當(dāng)抗體固定時(shí)，IC的量與抗原的量成正比。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 8 LIGHT SOURCE FILTER REACTION CUVETTE TURBIDIMETRIC DETECTOR NEPHELOMETRIC DETECTOR ICIC 散射比濁、透射比濁 光路圖 透射光透射光+ +散射光散射光 散散 光光 射射 平光線平光線 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 9 n目前，國(guó)內(nèi)開展的各項(xiàng)免疫檢驗(yàn)，均求使用國(guó)家食 品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）準(zhǔn)入和批準(zhǔn)的儀器和試 劑。這樣做不僅能使各項(xiàng)檢查更

5、加統(tǒng)一，規(guī)范，各 實(shí)驗(yàn)室之間檢查結(jié)果更具可比性，而且也可避免很 多不必要的醫(yī)療糾紛。 n免疫比濁技術(shù)中散射比濁法目前均用獲國(guó)家食品藥 品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)進(jìn)口的自動(dòng)化分析儀器 和配套的各種檢測(cè)項(xiàng)目的專用試劑。 n透射比濁法（生化分析儀）可用國(guó)產(chǎn)試劑。 全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 第3版 透射還是散射 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 10 n散射比濁 專用儀器 專用配套試劑 原裝進(jìn)口試劑昂貴 n透射比濁 生化分析儀 開放試劑 （可用國(guó)產(chǎn)試劑） 速率法和終點(diǎn)法測(cè)定； 速率法的靈敏度和特異性優(yōu)于終點(diǎn)法；終點(diǎn)法 的穩(wěn)定性較好； 透射還是散射 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自

6、動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 11 n目前，由于技術(shù)的發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異 性已接近，而全自動(dòng)生化儀的自動(dòng)化程度和精密度要 勝于專用散射比濁儀，透射免疫比濁法在臨床上的應(yīng) 用日益廣泛。生化分析儀通過(guò)免疫比濁法技術(shù)，架起 了現(xiàn)代生化檢驗(yàn)和現(xiàn)代免疫技術(shù)的橋梁。 n免疫化學(xué)是免疫學(xué)技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)的結(jié)合。既具 有免疫學(xué)抗原抗體結(jié)合的特異性，又具有生物化學(xué)反 應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。 透射還是散射 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 12 n可溶性抗原與其特異性抗體，在一定緩沖液中形成的 復(fù)合物，經(jīng)一段時(shí)間聚合后出現(xiàn)濁度，人射光在滲過(guò) 反應(yīng)液時(shí)，由于溶液內(nèi)IC粒子對(duì)光線的反射和吸收， 引

7、起透射光減少，可用吸光度A表示。 n用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出待測(cè)抗 原的含量。 n透射比濁法主要用于生化分析儀。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 13 n免疫復(fù)合物直徑為35lOOnm，這一范圍要求近紫外光處 入射光發(fā)出最大的干擾(最大吸收峰)，選擇290410nm 波長(zhǎng)測(cè)定最佳。 n由于抗原抗體結(jié)合后在短時(shí)間內(nèi)(19s)形成 可見的復(fù)合物，才能進(jìn)行比濁。 n為了提高復(fù)合物形成速度，加入促聚劑，如4聚乙二醇 (MW：60008000)，可使復(fù)合物形成在310min完成。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 14 n比濁法中，少量的小的

8、抗原抗體復(fù)合物極難形成 濁度，除非放置較長(zhǎng)時(shí)間；如形成較大的復(fù)合物 ，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化 的要求。 n為解決快速反應(yīng)及微量化的要求，建立了免疫膠 乳濁度法（immunolatex turbidimetry）。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 15 n其基本原理是： v將特異性抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒 上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。 v單個(gè)膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)，不阻礙光線透過(guò)；兩 個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過(guò)光減少。 v免疫微球凝聚的程度為被測(cè)物濃度的函數(shù)，由此可測(cè) 出標(biāo)本中待測(cè)物的含量。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度

9、分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 16 (a)帶抗體的膠乳在帶抗體的膠乳在1個(gè)波長(zhǎng)之內(nèi)可透過(guò)光線個(gè)波長(zhǎng)之內(nèi)可透過(guò)光線 (b)結(jié)合后，則形成光線衰減結(jié)合后，則形成光線衰減 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 17 該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個(gè)方面： n首先是選擇適用的膠乳，其大?。ㄖ睆剑┮孕∮?波長(zhǎng)。用500nm波長(zhǎng)者，選擇100nm顆粒較適合；用 585nm波長(zhǎng)者，則選用100200nm顆粒為好。目前多 用200nm的膠乳顆粒。 n其次，膠乳與抗體結(jié)合時(shí)用化學(xué)交聯(lián)雖好，但失活 也較嚴(yán)重；一般用吸附法即可。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 18 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免

10、疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 19 n膠乳顆粒多為惰性微球和羧基化微球 n氨基化高分子納米微球 氨基化納米微球的顆粒大小較傳統(tǒng)的微球更?。s 0.1m），它與抗體的結(jié)合是通過(guò)其表面的氨基與抗 體的氨基端共價(jià)結(jié)合，在微球與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián) 化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率 ，而且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效 地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。 與采用惰性納米微球的傳統(tǒng)技術(shù)相比，檢測(cè)的靈敏度 得到了極大的改善，最高可達(dá)到1.0ng/ml。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 20 （1）操作簡(jiǎn)單，可在幾分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)血清 蛋白含量

11、，真實(shí)反映病情進(jìn)展和評(píng)估治療效果，對(duì) 于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義； （2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測(cè)穩(wěn)定性和 重復(fù)性都很好； （3）能利用普通的生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，容易實(shí)現(xiàn)自 動(dòng)化，可在各級(jí)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及和應(yīng)用。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 21 n膠乳比濁分析 n顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法 （particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA） n膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定 （Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ） n粒子強(qiáng)化免疫濁度測(cè)定

12、愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 22 serum proteins 血清蛋白類 IgA（免疫球蛋白A） IgG（免疫球蛋白G） IgM（免疫球蛋白M） IgE（免疫球蛋白E） C3（補(bǔ)體C3） C4（補(bǔ)體C4） Microalbumin （微量白蛋白） 2-microglobulin （ 2球蛋白） -1- acid glycoprotein （ -1酸性糖蛋白） Ferritin（鐵蛋白） Transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白） 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 23 心血管疾病監(jiān)測(cè) Apo A-1（載脂蛋白A1） Apo B（載脂蛋白B） Lp(a

13、)（脂蛋白a） h-CRP(超敏感C反應(yīng)蛋白） Homocysteine （同型半胱氨酸） D-Dimer（D二聚體） Myoglobin（肌紅蛋白） cTnI（肌鈣蛋白I） 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 24 Rheuma 風(fēng)濕病 RF（類風(fēng)濕因子） ASO（抗鏈O） CRP（C-反應(yīng)蛋白） 腎小球過(guò)濾率最敏感的 指標(biāo) cystatin C （胱抑素C ） 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 25 TDM治療藥物監(jiān)測(cè) Phenobarbital （苯巴比妥） Phenytoin（苯妥英納） Valproic acid（丙戊酸） Carbamaze

14、pine （卡馬西平） Theophylline（茶堿） Gentamicin（慶大霉素） Digoxin（地高辛） Digitoxin（洋地黃） Vitamins維生素 Vitamin B12 （維生素B12） Folate（葉酸） infectious Diseases 傳染性疾病 TOXO（弓形體） RUBELLA（風(fēng)疹病毒） 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 26 R1（試劑試劑 I）: 緩沖液緩沖液 R2（試劑試劑 II）: 啟動(dòng)試劑啟動(dòng)試劑 ( (帶或不帶乳膠顆粒帶或不帶乳膠顆粒) ) STANDARDS（標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液） ( (一點(diǎn)或多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)一點(diǎn)或多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn))

15、) CONTROLS（質(zhì)控液質(zhì)控液） 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 27 免疫比濁法試劑的組成免疫比濁法試劑的組成 R R1 1緩沖液緩沖液 R R2 2啟動(dòng)試劑啟動(dòng)試劑 校準(zhǔn)血清校準(zhǔn)血清 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 28 反應(yīng)類型（不需要乳膠） Ag Ab (Reagent) 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 29 反應(yīng)類型（需要乳膠） LATEX PARTICLE Ag 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 30 緩沖液: 使反應(yīng)有最大限度的敏感性使反應(yīng)有最大限度的敏感性 避免非特異的結(jié)果避免非特

16、異的結(jié)果 降低反應(yīng)時(shí)間降低反應(yīng)時(shí)間 啟動(dòng)試劑: 產(chǎn)生抗原產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)抗體反應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)液: 建立濃度與信號(hào)（吸光度）之間的關(guān)系建立濃度與信號(hào)（吸光度）之間的關(guān)系 質(zhì)控液: 檢查定標(biāo)的情況檢查定標(biāo)的情況 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 31 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 32 nCRM 歐共體參考局（ BCR ）的認(rèn)可參考品。 nCRM470是14種（血清）蛋白分析物的參考制品。 nCRM470基于人血清（人血清蛋白參考制備物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Material n由以下組織共同發(fā)展

17、： IFCC BCR Brussels CAP USA 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 33 nCRM 470在歐洲由BCR制備提供。在美國(guó)則由美國(guó) 病理協(xié)會(huì)（CAP）提供材料。 n生產(chǎn)廠家用CRM470對(duì)自己的定標(biāo)液和質(zhì)控液進(jìn)行 標(biāo)化。 nCRM和SRM（Standard Reference Material標(biāo)準(zhǔn)參 考材料）可以認(rèn)為是目前可以提供的最高質(zhì)量的材 料。SRM主要用于USA（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院 NIST）。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 34 CRM470參考物及其參考范圍 血漿蛋白質(zhì)每個(gè)CRM470的參考范圍（g/L） 白蛋白

18、3552 -1-抗胰蛋白酶0.92.0 （-1-抗胰蛋白酶抑制劑） C3C-補(bǔ)體0.91.8 C4-補(bǔ)體0.10.4 銅蘭蛋白0.20.6 C-反應(yīng)蛋白（CRP）0.005 -1-酸性糖蛋白（類粘蛋白）0.51.2 觸珠蛋白0.32.0 IgA0.74.0 IgG716 IgM0.42.3 -2-巨球蛋白1.33.0 前白蛋白（transthyretin）0.20.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白2.03.6 注：C3C在新鮮樣本中可期望較低的參考范圍 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 35 v對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理 解。解。 v理解

19、各個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的方法學(xué)原理。理解各個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的方法學(xué)原理。 v仔細(xì)認(rèn)真閱讀商品化試劑的說(shuō)明書。仔細(xì)認(rèn)真閱讀商品化試劑的說(shuō)明書。 v銷售商或者廠家技術(shù)部門的支持。銷售商或者廠家技術(shù)部門的支持。 “所謂生化分析儀就是將實(shí)驗(yàn)參數(shù)輸入儀器，由儀 器按照試驗(yàn)指令來(lái)完成整個(gè)試驗(yàn)。參數(shù)設(shè)置，基本 功在儀器之外，如果對(duì)分析化學(xué)、對(duì)酶動(dòng)力學(xué)、儀 器性能沒(méi)有一定的掌握，是很難設(shè)置好參數(shù)的?！?愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 36 免疫濁度法在生化分析儀上常見的測(cè)定（分析）方式 FINAL POINT D FINAL - SAMPLE BLANK D - A FINAL - INITIAL D

20、 - B KINETIC (C - B)/ time R2 (LATEX OR ANTISERA) SAMPLE AND R1 (BUFFER) TIME OD increment 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 37 測(cè)定CRP分析方式 采用雙試劑、兩步終點(diǎn)法采用雙試劑、兩步終點(diǎn)法 37 5min 37 5min A1A2 Sample en R1R2 R1R2 End 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 38 Heidelberger & Kendall Experience Excess antibody zone Equivalence zo

21、neExcess antigen zone Antigen concentration TURBIDITY ( OD ) （useful zone） A B C 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 39 n依據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫比濁測(cè)量選擇在A區(qū)， IC的濁度隨著抗原的增加而增加，但不是呈線性的對(duì) 應(yīng)關(guān)系（曲線往往有截距或呈S形），要得到正確的 結(jié)果，必須做一個(gè)多點(diǎn)定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 n自動(dòng)生化分析儀多推薦5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后選擇適當(dāng) 的數(shù)學(xué)模型作曲線擬合，如：Logit-Log變換； y=d+cx+bx2+ax3 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用

22、40 多點(diǎn)定標(biāo)：RF、CRP REAL RELATION AND CURVE OF CALIBRATION STRAIGHT LINE CALIBRATION (THERE IS AN ERROR) concentration OD increment 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 41 CONCENTRATION OD increment REAL RELATION STRAIGHT LINE CALIBRATION 一點(diǎn)定標(biāo)：例如ASO 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 42 校準(zhǔn)曲線的選擇和擬合效果檢驗(yàn)： v選擇何種校準(zhǔn)曲線作數(shù)據(jù)處理，是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵 之一。 v一般用試劑廠家提供的或文獻(xiàn)介紹的校準(zhǔn)模式。 v應(yīng)該對(duì)擬合曲線作檢驗(yàn)和比較。 愛(ài)愛(ài)醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用 43 n抗原或抗體過(guò)剩使免疫復(fù)合物部分或全部解離的現(xiàn) 象，稱為帶現(xiàn)象。 n免疫濁