分子定向進化技術(shù)簡介

1、 molecular directed evolution 1 1 2 3 4 主要內(nèi)容 分子定向進化技術(shù)的概述及定義分子定向進化技術(shù)的概述及定義 分子定向進化技術(shù)的原理分子定向進化技術(shù)的原理 分子定向進化技術(shù)具體過程分子定向進化技術(shù)具體過程 分子定向技術(shù)的應(yīng)用及展望分子定向技術(shù)的應(yīng)用及展望 2 人們試圖利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和定人們試圖利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和定 點突變技術(shù)對蛋白質(zhì)進行合理的改造，點突變技術(shù)對蛋白質(zhì)進行合理的改造， 這些方法難度較大且要在了解蛋白質(zhì)的這些方法難度較大且要在了解蛋白質(zhì)的 三維空間的基礎(chǔ)上才能進行。而分子定三維空間的基礎(chǔ)上才能進行。而分子定 向進化技術(shù)是在不需了解相關(guān)蛋白

2、的三向進化技術(shù)是在不需了解相關(guān)蛋白的三 維空間結(jié)構(gòu)的情況下在維空間結(jié)構(gòu)的情況下在體外模擬體外模擬自然進自然進 化的過程化的過程( (隨機突變、重組和選擇隨機突變、重組和選擇) )，使，使 基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需 性質(zhì)或功能的蛋白。性質(zhì)或功能的蛋白。 3 概概 述述 生物在漫長的時生物在漫長的時 間里經(jīng)過自發(fā)突變間里經(jīng)過自發(fā)突變 (突變與重組突變與重組)，通，通 過自然選擇，逐漸過自然選擇，逐漸 形成了多樣性的生形成了多樣性的生 物。物。 基因在短時間通過基因在短時間通過 人為引發(fā)突變，經(jīng)人為引發(fā)突變，經(jīng) 過人工篩選，形成過人工篩選，形成 滿足人們需

3、要的新滿足人們需要的新 功能或者優(yōu)良性能功能或者優(yōu)良性能 生物物質(zhì)生物物質(zhì)(酶蛋白酶蛋白)。 分子定向進化分子定向進化 自然進化自然進化 自發(fā)、不定向、自然選擇、慢自發(fā)、不定向、自然選擇、慢 人為、定向、人工選擇、快人為、定向、人工選擇、快 4 一、分子定向進化技術(shù)的定義一、分子定向進化技術(shù)的定義 分子定向進化分子定向進化(molecular directed evolution)是在分子水平研究所需生物的是在分子水平研究所需生物的 特定基因或蛋白質(zhì)，是在體外模擬特定基因或蛋白質(zhì)，是在體外模擬突變突變、 重組重組和和選擇選擇的自然進化機制，使進化朝的自然進化機制，使進化朝 著人們需要的方向發(fā)展

4、其實質(zhì)，是達爾著人們需要的方向發(fā)展其實質(zhì)，是達爾 文進化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。文進化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。 5 二、分子定向進化技術(shù)的過程原理二、分子定向進化技術(shù)的過程原理 6 通常通常通常一個典型的定向進化技術(shù)涉及三步通常一個典型的定向進化技術(shù)涉及三步: : 1.1. 通過通過隨機突變隨機突變和和( (或或) )基因體外重組基因體外重組創(chuàng)造基創(chuàng)造基 因因多樣性，多樣性，即即將目的蛋白的編碼基因進行將目的蛋白的編碼基因進行 突突 變或是隨機重組產(chǎn)生一個含有多個基因變或是隨機重組產(chǎn)生一個含有多個基因 的突變體庫。的突變體庫。 2.2.導(dǎo)入適當(dāng)載體后導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫構(gòu)建突變文

5、庫； 3.3.通過通過高通量的篩選高通量的篩選方法方法，選擇陽性突變子。，選擇陽性突變子。 這個過程可重復(fù)循環(huán)這個過程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。，直至得到預(yù)期性狀的酶。 7 1.基因的體外突變基因的體外突變 無性進化：無性進化： 易錯易錯PCR； 物理、化學(xué)方法介導(dǎo)的隨機誘變；物理、化學(xué)方法介導(dǎo)的隨機誘變； 由致突變菌株產(chǎn)生的隨機突變由致突變菌株產(chǎn)生的隨機突變。 有性進化：有性進化： DNA改組技術(shù)；改組技術(shù)； 隨機引物體外重組法；隨機引物體外重組法； 重疊延伸法。重疊延伸法。 三、分子定向進化的具體選擇策略三、分子定向進化的具體選擇策略 8 易錯易錯PCR(Error Prone P

6、CRError Prone PCR) 利用利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配，過程中出現(xiàn)的堿基錯配， 對特定基因進行隨機誘變的技術(shù)。對特定基因進行隨機誘變的技術(shù)。 9 向反應(yīng)體系中摻入核酸類似物向反應(yīng)體系中摻入核酸類似物(如次如次 黃嘌呤核苷酸黃嘌呤核苷酸) 限制其中一種核苷酸的用量，使聚合限制其中一種核苷酸的用量，使聚合 酶優(yōu)先選擇其他三種，從而增加錯配酶優(yōu)先選擇其他三種，從而增加錯配 率。率。 通過引物通過引物5 5端引端引入錯配堿基，插入或入錯配堿基，插入或 缺失一個或多個堿基。這種突變方法缺失一個或多個堿基。這種突變方法 是靶向的，突變發(fā)生在是靶向的，突變發(fā)生在DNADNA模板上預(yù)先模板上

7、預(yù)先 確定的位置。確定的位置。 向向PCR反應(yīng)體系中引入突變的方法：反應(yīng)體系中引入突變的方法： 10 在在TaqDNA聚合酶催化的聚合酶催化的PCR反應(yīng)體反應(yīng)體 系中加入一定量的系中加入一定量的Mn2+替代天然的輔助替代天然的輔助 因子因子Mg2+，由于，由于TaqDNA聚合酶缺乏校聚合酶缺乏校 對活性對活性(3 3- -5 5外切酶活性外切酶活性)，其錯配率會，其錯配率會 大大增加，通常可以達到每千堿基對大大增加，通?？梢赃_到每千堿基對1 個突變左右。個突變左右。 可以通過調(diào)節(jié)核苷酸、酶、可以通過調(diào)節(jié)核苷酸、酶、 鎂離子等鎂離子等 的用量，并加入錳離子等來控制錯配的的用量，并加入錳離子等來控

8、制錯配的 程度。程度。 11 連續(xù)易錯連續(xù)易錯PCR(Sequential error-prone PCR) 將第一次將第一次PCR擴增擴增 的有益突變作為的有益突變作為 下一次下一次PCR擴增的擴增的 模板，這樣連續(xù)模板，這樣連續(xù) 反復(fù)隨機誘變，反復(fù)隨機誘變， 使得每次獲得的使得每次獲得的 少量突變進行積少量突變進行積 累累而得到更重要而得到更重要 的有益突變。的有益突變。 12 重疊延伸重疊延伸PCR(SOE-PCR) 原理：原理： 重疊延伸重疊延伸PCR 技術(shù)由于使用了具有技術(shù)由于使用了具有 互補末端的引物，使互補末端的引物，使PCR 產(chǎn)物形成產(chǎn)物形成 了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)了重

9、疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng) 中通過重疊鏈的延伸，將不同來源中通過重疊鏈的延伸，將不同來源 的擴增片段重疊拼接起來?？珊唵蔚臄U增片段重疊拼接起來?？珊唵?迅速的將兩個迅速的將兩個DNA 片段連在一起，片段連在一起， 用于融合基因的構(gòu)建。用于融合基因的構(gòu)建。 13 5， 5，3，3，5， A基因 B基因 3，5， a b c d a.不需要設(shè)計酶切識別位點，可將不同來不需要設(shè)計酶切識別位點，可將不同來 源的源的DNA識別位點連接起來構(gòu)建融合基識別位點連接起來構(gòu)建融合基 因；因； b.不需要經(jīng)過接頭處理連接酶，利用不需要經(jīng)過接頭處理連接酶，利用PCR 拼接基因；拼接基因； c.可進行高保真定點、定位

10、突變，并且突可進行高保真定點、定位突變，并且突 變和重組可以同時進行；變和重組可以同時進行； d.容易產(chǎn)生隨機突變，需要對容易產(chǎn)生隨機突變，需要對PCR反應(yīng)條反應(yīng)條 件進行優(yōu)化。件進行優(yōu)化。 特點特點 15 16 DNA改組技術(shù)改組技術(shù)(DNA shuffling) 又稱又稱有性有性PCR，指，指DNA分子的體外重組，分子的體外重組， 是基因在分子水平上進行有性重組。通是基因在分子水平上進行有性重組。通 過改變單個基因過改變單個基因(或基因家族或基因家族)原有的核原有的核 苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn) 物以新功能。物以新功能。 17 從突變體基因庫中分離

11、出來 的DNA片段用脫氧核糖核酸 酶I隨機切割 得到的隨機片段經(jīng)過不加引 物的多次PCR循環(huán) 在PCR循環(huán)過程中，隨機 片段之間互為模板和引物進 行擴增，直到獲得全長的基 因，這導(dǎo)致來自不同基因片 段之間的重組。 18 基因家族改組技術(shù)基因家族改組技術(shù)(family shuffling) 19 1. DNaseI產(chǎn)生隨機片段；2. 隨機片段變性；3. 隨機片 段復(fù)性；4.延伸(重復(fù)2-4步) 20 幾種不同突變方法產(chǎn)生的突變積累的情況比較 21 隨機引物體外重組法隨機引物體外重組法(RPR) RPR RPR 法是用一套隨機序列引物法是用一套隨機序列引物, ,產(chǎn)生產(chǎn)生 互補于模板不同位點的短互補

12、于模板不同位點的短DNADNA片段庫片段庫( (由于由于 堿基錯配堿基錯配, ,這些短這些短DNADNA片段含有少量的點突片段含有少量的點突 變變),),然后進行類似于然后進行類似于DNADNA改組的全長基因改組的全長基因 裝配反應(yīng)裝配反應(yīng), ,獲得突變文庫。獲得突變文庫。 特點：特點：是可用單鏈?zhǔn)强捎脝捂淒NADNA或或mRNAmRNA作模板、不作模板、不 受模板長度限制。受模板長度限制。 22 2.突變基因文庫的構(gòu)建突變基因文庫的構(gòu)建 構(gòu)建基因文庫首先考慮的因素：構(gòu)建基因文庫首先考慮的因素： 文庫的質(zhì)量文庫的質(zhì)量 文庫的代表性文庫的代表性 突變基因的結(jié)構(gòu)完整性突變基因的結(jié)構(gòu)完整性 文庫容易

13、篩選文庫容易篩選 文庫的大小與特定的篩選容量相適應(yīng)文庫的大小與特定的篩選容量相適應(yīng) 23 突變體基因的載體系統(tǒng)突變體基因的載體系統(tǒng) 噬菌體載體系統(tǒng)噬菌體載體系統(tǒng) 優(yōu)點：插入片段的裝載容量大，適合于大片優(yōu)點：插入片段的裝載容量大，適合于大片 段的克隆段的克隆 構(gòu)建出的基因文庫質(zhì)量高、代表性構(gòu)建出的基因文庫質(zhì)量高、代表性好、適合好、適合 長期保存。長期保存。 缺點：可選用的篩選方法較有限缺點：可選用的篩選方法較有限 24 質(zhì)粒載體系統(tǒng)質(zhì)粒載體系統(tǒng) 優(yōu)點：體外操作簡便，優(yōu)點：體外操作簡便， 最大優(yōu)點是能實現(xiàn)對基因文庫的功能性篩選最大優(yōu)點是能實現(xiàn)對基因文庫的功能性篩選 缺點：是插入片段的載體容量較小，

14、含有缺點：是插入片段的載體容量較小，含有 長片段的重組克隆的群體擴增過程中容易長片段的重組克隆的群體擴增過程中容易 丟失、轉(zhuǎn)化效率普遍較低，不易長期保存。丟失、轉(zhuǎn)化效率普遍較低，不易長期保存。 25 突變體基因文庫的篩選突變體基因文庫的篩選 特點：篩選方法必須靈敏，可借助相關(guān)儀器特點：篩選方法必須靈敏，可借助相關(guān)儀器 實現(xiàn)高通量篩選，一般根據(jù)目的基因表達的實現(xiàn)高通量篩選，一般根據(jù)目的基因表達的 靶蛋白選擇篩選的方法靶蛋白選擇篩選的方法 活體篩選法活體篩選法; 噬菌體展示法；噬菌體展示法； 細(xì)胞表面展示法；細(xì)胞表面展示法； 核糖體展示技術(shù)；核糖體展示技術(shù)； 26 幾種高通量篩選的方法：幾種高通量

15、篩選的方法： 1. .突變微生物分離法：突變微生物分離法： 瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變 菌菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、 特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 2.微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合法：微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合法： 將單個細(xì)胞附著在單個固體珠上，對將單個細(xì)胞附著在單個固體珠上，對 突變體進行分離和篩選。突變體進行分離和篩選。 。 27 3.3.噬菌體展示技術(shù)：噬菌體展示技術(shù)： 外源蛋白以融合形式與噬菌體的外殼外源蛋白以融合形式與噬菌體的外殼 蛋白共同表達于

16、噬菌體表面蛋白共同表達于噬菌體表面,經(jīng)過“吸附 洗脫擴增”過程過程，可篩選并富集外源肽，可篩選并富集外源肽， 進而研究其功能。進而研究其功能。 4.4.流式細(xì)胞計數(shù)法：流式細(xì)胞計數(shù)法： 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系 統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計數(shù)儀統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計數(shù)儀 進行測定進行測定。 28 (1)噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)(Phage Display) 突變突變DNA片段插入噬菌片段插入噬菌 體或噬菌粒的基因組中體或噬菌粒的基因組中，以以 融合蛋白的形式與噬菌體的融合蛋白的形式與噬菌體的 外殼蛋白共同表達于噬菌表外殼蛋白共同表達于噬

17、菌表 面，經(jīng)過面，經(jīng)過“吸附吸附洗脫洗脫擴擴 增增”能夠特異吸附產(chǎn)物的層能夠特異吸附產(chǎn)物的層 析柱析柱,帶有活性蛋白的噬菌體帶有活性蛋白的噬菌體 被分離出來被分離出來。 29 有有細(xì)菌細(xì)菌和和噬菌體表面展示噬菌體表面展示技術(shù)，結(jié)合熒光激技術(shù)，結(jié)合熒光激 活細(xì)胞篩選儀活細(xì)胞篩選儀(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)或流式細(xì)胞儀或流式細(xì)胞儀(flow cytometry)是是 非常有效的高通量篩選方法非常有效的高通量篩選方法 。該技術(shù)是目前惟一。該技術(shù)是目前惟一 能夠定量檢測單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活能夠定量檢測單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活 性

18、的方法。還能夠決定突變體庫中每個克隆的功性的方法。還能夠決定突變體庫中每個克隆的功 能特性能特性 。 細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)(Bacterial CellSurface Display) 30 四、分子定向進化技術(shù)的應(yīng)用四、分子定向進化技術(shù)的應(yīng)用 1.在環(huán)境污染治理方面的應(yīng)用在環(huán)境污染治理方面的應(yīng)用 相關(guān)基因通過多輪相關(guān)基因通過多輪DNA改組和篩選，分離改組和篩選，分離 得到的突變體可提高對甲基對硫磷、對三氯丙得到的突變體可提高對甲基對硫磷、對三氯丙 烷、烷、 三氯乙烯、五氯苯酚的降解。三氯乙烯、五氯苯酚的降解。 2.農(nóng)業(yè)飼料酶制劑的中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)飼料酶制劑的中的應(yīng)用 如木聚糖

19、酶如木聚糖酶(最適最適pH和耐高溫和耐高溫)；高比活低；高比活低 pH淀粉酶；耐堿耐高溫高活性的纖維素酶；耐淀粉酶；耐堿耐高溫高活性的纖維素酶；耐 高溫的二塘水解酶高溫的二塘水解酶.通過易錯通過易錯PCR和和DNA改組改組 技術(shù)均可獲得相應(yīng)能較野生型功能強的酶制劑技術(shù)均可獲得相應(yīng)能較野生型功能強的酶制劑。 31 3. .酶制劑藥物方面的應(yīng)用酶制劑藥物方面的應(yīng)用 主要是對酶制劑藥物進行分子改造，主要提高主要是對酶制劑藥物進行分子改造，主要提高 其活性和穩(wěn)定性其活性和穩(wěn)定性 4.4.抗生素生產(chǎn)的相關(guān)限速酶活力方面提高抗生素生產(chǎn)的相關(guān)限速酶活力方面提高 如各種抗生素合成路徑中的關(guān)鍵酶活性的提高，如各

20、種抗生素合成路徑中的關(guān)鍵酶活性的提高， 從而增加相應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量，這一過程可以單從而增加相應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量，這一過程可以單 獨使用易錯獨使用易錯pCR技術(shù)也可以結(jié)合技術(shù)也可以結(jié)合DNA重組技術(shù)進重組技術(shù)進 行分子定向進化。行分子定向進化。 32 頭孢菌素頭孢菌素C(CPC) 和和7- 氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸(7- ACA)分別是工業(yè)半合成生產(chǎn)頭孢菌素類分別是工業(yè)半合成生產(chǎn)頭孢菌素類 抗生素的重要前體和中間體，由于在頂頭抗生素的重要前體和中間體，由于在頂頭 孢霉中中直接生產(chǎn)孢霉中中直接生產(chǎn)7-ACA 也存在酶表達和也存在酶表達和 菌株培養(yǎng)最適條件的矛盾，因此，采用易菌株培養(yǎng)最適條件的矛盾，因

21、此，采用易 錯錯PCR技術(shù)對技術(shù)對CPC 酰化酶進行定點突變，?；高M行定點突變， 從而提高從而提高CPC的轉(zhuǎn)化效率。的轉(zhuǎn)化效率。 33 頭孢菌素頭孢菌素C(CPC) 戊二?；於；?7-氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸 （GL-7-ACA) D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 頭孢頭孢C氨基?；赴被；?7- 氨基頭孢烷酸氨基頭孢烷酸(7-ACA) 34 易錯易錯PCR 對對CPC 酰化酶進行無性突變?；高M行無性突變 突變重組子的初篩與復(fù)篩突變重組子的初篩與復(fù)篩 將易錯將易錯PCR所得到的基因所得到的基因ecs與適宜的載體連接與適宜的載體連接 易錯突變子的結(jié)果分析易錯突變子的結(jié)果分析 35 用易錯用易錯PCR，用不同濃度的，用不同濃度的Mg2+ 和和Mn2+，應(yīng)，應(yīng) 用低保真用低保真DNA聚合酶，以一定的頻率向氨基?；妇酆厦?，以一定的頻率向氨基?；?基因基因(ecs)中引入隨機突變。由于希望獲得錯配的中引入隨機突變。由于希望獲得錯配的ecs 基因序列，因此采用了基因序列，因此采用了Mg2+ 濃度濃度7.5 mmol/L、 Mn2+