2885.A根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)25A合成酶基因?qū)Ρ臼蠠煹倪z傳轉(zhuǎn)化研究

1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)2-5a合成酶基因?qū)Ρ臼蠠煹倪z傳轉(zhuǎn)化研究摘 要：煙草病毒病害是嚴(yán)重影響煙草生產(chǎn)質(zhì)量和數(shù)量的一大危害。而 2，5-寡腺苷酸合成酶（2-5as）有重要的抗病毒作用。我們利用構(gòu)建好的連接有2-5as基因的表達(dá)載體pbinplusa，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，用葉盤法侵染本氏煙，使用卡那霉素（kan）進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以期獲得具有廣普病毒抗性的轉(zhuǎn)基因煙草。目前已得到具有kan 抗性的愈傷組織并分化出不定芽。關(guān)鍵詞：2-5a合成酶基因，根癌農(nóng)桿菌，本氏煙，載體構(gòu)建， 轉(zhuǎn)化the transformation of 2,5-oligoadenylate synthetase gene mediated b

2、y agrobacterium tumefaciens in n.benthamina abstract :tobacco virus disease is one of the disasters that influence the tobacco production quality and quantityseriously. 2,5-oligoadenylate synthetase (2-5as) has important antivirus function. we utilize the well-constructed expression vector pbinplusa

3、 that has the2-5as gene to transform the abacterium tumefaciens, and transfect the n.benthamina with leaf dishes of law, then carry on the selection on the basis of the kanamycin (kan), in order to get the transgenic tobacco with wide general virus resisting. and now, we have got the unorgnized with

4、 the resistence to kanamycin and it has already developed the adventitious bud.key word：2，5-ohigoadenylate synthetase(2-5as),a grobacterium tumefaciens. n. benthamina, constructed vector, transformation. 前 言煙草病毒病是煙草生產(chǎn)中危害最大的病害，其發(fā)生遍及各煙區(qū)，它們不僅造成煙草產(chǎn)量的損失，而且使煙草品質(zhì)嚴(yán)重下降，近年來田間經(jīng)常出現(xiàn)的病毒粒子復(fù)合侵染現(xiàn)象，更加重了病毒病對(duì)煙株生長(zhǎng)的危害，使病

5、毒癥狀加重且表現(xiàn)復(fù)雜化。耕作制度的變遷，持續(xù)暖冬現(xiàn)象的發(fā)生和北方保護(hù)地蔬菜面積的不斷擴(kuò)大，造成了有利于病毒和其它毒介體越冬越夏的環(huán)境條件，使煙草病毒病有日趨嚴(yán)重之勢(shì)。自1988年以來，為提高我國(guó)煙草的抗病、抗蟲和煙葉質(zhì)量，我國(guó)開始開展轉(zhuǎn)基因煙草研究。轉(zhuǎn)基因煙草是通過植物基因工程技術(shù)將編碼特殊性狀的外源基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，通過生物、物理或化學(xué)等方法，導(dǎo)入到受體煙草細(xì)胞或組織中，然后由受體細(xì)胞或組織再生得到的煙草植株及其后代。當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因煙草研究主要集中在以下領(lǐng)域：(1)改善煙草的抗病、抗蟲、抗逆和抗除草劑等農(nóng)藝性狀；(2)提高煙草的品質(zhì)，降低煙草的有害成分；(3)利用轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)生物制品

6、；(4)利用轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行基因功能研究。由于煙草具有操作容易、培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單、組織培養(yǎng)周期短和轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，所以其實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的模式植物之一。通過遺傳工程選擇抗病毒的品種是防治煙草病毒病的一個(gè)重要途徑，對(duì)于減少農(nóng)藥，保護(hù)環(huán)境更有深遠(yuǎn)的意義。世界上的科技工作者對(duì)此方面進(jìn)行深入研究，并且獲取明顯成果。1957年,英國(guó)科學(xué)家alick lsaacs和lean lindenmann利用雞胚絨毛尿囊研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種能夠干擾病毒繁殖的物質(zhì),稱之為干擾素(interferon，ifn)。ifn是細(xì)胞和機(jī)體受到病毒感染，或者受核酸、細(xì)菌內(nèi)毒素、促細(xì)胞分裂素等作用后，由受體細(xì)胞分泌的一種廣譜抗病

7、毒糖蛋白。它的產(chǎn)生和作用的發(fā)揮受細(xì)胞基因組的調(diào)控，其活性表現(xiàn)為重要的免疫調(diào)節(jié)功能，抑制病毒活性。干擾素的作用機(jī)制研究表明,它并非直接作為反式作用因子對(duì)其效應(yīng)分子的基因組進(jìn)行調(diào)控,而是借助受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引發(fā)一系列特異的生化反應(yīng),直至達(dá)到調(diào)控效應(yīng)分子的目的.一般認(rèn)為干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒作用主要是2-5a系統(tǒng)在發(fā)揮重要作用。2-5a系統(tǒng)主要由兩種酶組成：2,5-寡腺苷酸合成酶（2,5-oligoadenylate synthetase）和內(nèi)切核糖核酸酶(rnasel)。 在雙鏈rna存在時(shí)，2,5-寡腺苷酸合成酶被激活，以細(xì)胞中的atp和單鏈rna為底物，合成一種特殊結(jié)構(gòu)，激活rnase

8、l從而降解病毒rna，阻止病毒復(fù)制，達(dá)到抗病毒的目的。由于單鏈rna病毒的生命周期中都有雙鏈rna的中間體，因此，利用該基因有可能達(dá)到廣譜抗病毒目的。據(jù)此，truve等將一種來自大鼠的2,5-寡腺苷酸合成酶cdna通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入馬鈴薯。結(jié)果表明，在大田條件下，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉子和塊莖中馬鈴薯x病毒（pvx）的濃度要低于表達(dá)該病毒外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植株。人體干擾素（huifn）能在某些植物中誘導(dǎo)對(duì)病毒的抗性。orchansky等（1982）發(fā)現(xiàn)huifn能降低tmv對(duì)samsun煙葉碟和原生質(zhì)體的侵染。rosenberg等（1985）也證實(shí)huifn能抑制不同品種的煙草原生質(zhì)體中tmv的增殖。sel

9、a及其同事（1982）在普通煙-tmv系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)基因工程的huifn具有同天然huifn相類似的效應(yīng)。vicent等（1987）報(bào)道，除huifn外，huifn也能顯著地抑制tmv對(duì)曼佗羅（datura stramonium）的侵染。自從20世紀(jì)70年代末世界上產(chǎn)生第一例轉(zhuǎn)基因植物以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速，產(chǎn)生了許多植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，目前常用的轉(zhuǎn)基因方法有兩種：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和基因槍法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用根癌農(nóng)桿菌中的ti質(zhì)粒進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）技術(shù)簡(jiǎn)單，不需大型儀器設(shè)備；（2）對(duì)受體要求不嚴(yán)格，原生質(zhì)體、愈傷、器官、組織均可；(3)轉(zhuǎn)化周期短、遺傳穩(wěn)定性好、拷貝

10、數(shù)少。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化雙子葉植物特別有效，在眾多的雙子葉植物中，煙草已成為轉(zhuǎn)基因研究的模式植物，已獲得了各種用途的轉(zhuǎn)基因煙草，而且有很多已進(jìn)入大田實(shí)驗(yàn)10。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2-5a基因和rnasel基因在抗病毒中起關(guān)鍵作用的原理，將構(gòu)建好的2-5a基因植物表達(dá)載體通過根癌農(nóng)桿菌的侵染對(duì)本氏煙進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得對(duì)病毒有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草，并為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。1 實(shí)驗(yàn)材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料已構(gòu)建好的載體pbinplusa（載體具有抗kan基因），土壤農(nóng)桿菌lba4404，本氏煙（n. benthamina）河南農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供1.2酶和試劑dna/ecor+hind marker、

11、；x-gal、iptg、depc、pcr試劑盒、dna提取試劑盒、膠回收試劑盒購自上海生工。taq dna聚合酶、dntp購自takara公司?？敲顾?kan)，頭孢先鋒霉素（ce）、利福霉素（rif）、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(tris)、十二烷基磺酸鈉(sds)、甘氨酸等購自上海生工。 6-芐基嘌呤（6ba）、吲哚乙酸（iaa）其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3培養(yǎng)基 lb培養(yǎng)基：酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l ,調(diào)ph至7.0。 ms基本培養(yǎng)基：大量元素、微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽。共培養(yǎng)基：ms1 mg/l 6-ba +0.1 mg/l iaa (ph7.0

12、)1.4 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)流程為上圖：1.4.1pbinplusa轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404（1 ）感受態(tài)細(xì)胞制備挑取單菌落lba4404接種于2ml lb液體培養(yǎng)基（含50mg/ml rif）中，28振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液1ml接種于50ml lb中，28 振蕩培養(yǎng)至od500為0.5左右，5000rpm離心5min，棄上清，加入10ml 0.15m nacl，懸浮細(xì)胞，5000rpm離心5 min，棄上清，加入1 ml冰冷的20mm cacl2,，置冰浴中24h內(nèi)使用。（2）農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化植物表達(dá)載體pbinplusa凍融法直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404。取200l感受態(tài)細(xì)胞lba4404，

13、加入1g植物表達(dá)載體pbinplusa，冰浴30 min，液氮中凍1min，再加入到1ml lb培養(yǎng)基，28振蕩培養(yǎng)4h，1000rpm離心30s，加入0.1ml lb培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，涂布含有kan(100mg/l)和rif(125 mg/l)的lb固體平板上，28培養(yǎng)2天。（3） 陽性選擇分別隨機(jī)挑選4個(gè)克隆，菌落pcr鑒定。（4）保存固體平板培養(yǎng)基上于4下保存數(shù)月或15%甘油中-70長(zhǎng)期保存。1.4.2無菌苗的獲得（1）將煙草種子用細(xì)密紗布包裹，用清水沖洗（2）無菌條件下，將鑷子在酒精燈上方燒三次，再將煙種置于事先滅過菌的三角瓶中（3）70乙醇浸泡包有紗布的種子30s，再用升汞溶液消毒2m

14、in（4）菌水沖洗5次后將紗布打開，將種子置于已經(jīng)消毒的培養(yǎng)皿中的吸水紙上（5）稍風(fēng)干后均勻點(diǎn)播于1/2 ms固體培養(yǎng)基上（6）25暗培養(yǎng)3天（7）于25光照強(qiáng)度6000lux及光照時(shí)間16h/d條件下培養(yǎng)。1.4.3外源基因?qū)煵莸霓D(zhuǎn)化及再生（1）菌液制備將含有植物表達(dá)載體pbinplusa的土壤農(nóng)桿菌lba4404接種于50ml lb培養(yǎng)液（kan 100mg/l，rif 125mg/l）中，28, 150rpm搖菌過夜培養(yǎng)至od600 為0.51.0。（2）外植體的制備1）將溫室生長(zhǎng)的本氏煙無菌苗幼嫩葉片剪下，用自來水沖洗干凈后，經(jīng)70%乙醇消毒1min，15%次氯酸鈉消毒3min，滅菌

15、水洗滌34次，滅菌濾紙吸干后備用。2）將長(zhǎng)至六周的無菌苗取出(葉片2-3cm)，在無菌操作條件下，選幼嫩葉片剪下置于培養(yǎng)皿中備用（3）轉(zhuǎn)化及植株再生根據(jù)horsch等的葉盤法轉(zhuǎn)化。1）步驟（2）中的外植體去掉葉緣及大葉脈，將葉片剪成0.51cm2見方的小葉盤2）投入預(yù)先準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，室溫下不斷搖動(dòng)3）1015min后取出葉片，用濾紙吸干子葉盤表面菌液，置于鋪有一層濾紙的ms培養(yǎng)基上4）25-28在黑暗條件下共培養(yǎng)48h5）將外植體轉(zhuǎn)移到ms分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)(16h光照/d，25-28)6) 分化培養(yǎng)基：ms1 mg/l 6-ba 0.1 mg/l iaa +50mg/l kan +

16、400 mg/l ce (ph5.8),使用頭孢氨卡（400 mg/l）抑菌，卡那霉素（50mg/l）進(jìn)行抗性篩選。2結(jié)果分析2.1轉(zhuǎn)化pcr檢測(cè)植物表達(dá)載體pbinplusa凍融法直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，涂布含有kan(100mg/l)和rif(125 mg/l)的lb固體平板上，28培養(yǎng)2天。培養(yǎng)兩天后形成大量菌落，挑選4個(gè)菌落進(jìn)行pcr檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖一1 2 3 4 5圖一：轉(zhuǎn)化體pcr檢測(cè)結(jié)果泳道1,2,4,5 為 pbinplusa的條帶，pbinplusa基因大小為18.4kb，檢測(cè)引物是按照2-5a基因設(shè)計(jì)的，擴(kuò)出的片段為1.2kb；泳道3為dna/ecor+hind

17、marker。結(jié)果表明挑出的4個(gè)菌落均為陽性克隆,即pbinplusa已成功轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌中。2.2無菌苗的獲得將本氏煙種子在無菌條件下，使用70乙醇浸泡30s，升汞溶液消毒2min，無菌水沖洗5次，稍風(fēng)干后均勻點(diǎn)播于1/2 ms固體培養(yǎng)基上，25暗培養(yǎng)3天后，于25光照強(qiáng)度6000lux及光照時(shí)間16h/d條件下培養(yǎng)。6周后獲得葉盤為2-3cm的所需煙草無菌苗（見圖二）。圖二：經(jīng)無菌操作得到的煙草無菌苗2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的再生將在三角瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)六周左右的無菌苗，將其葉片切成小葉盤，浸入搖好的含有植物表達(dá)載體pbinplusa的土壤農(nóng)桿菌lba4404菌液中

18、，1015min后取出葉片，用濾紙吸干多余菌液，共有111片外植體，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基ms1 mg/l 6-ba +0.1 mg/l iaa (ph7.0)上暗培養(yǎng)48h。然后轉(zhuǎn)入含有50mg/l kan +400 mg/l ce (ph5.8)的分化培養(yǎng)基上（ce抑菌，kan篩選抗性再生植株），誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，每15d換一次培養(yǎng)基，對(duì)于中途污染褐變的外植體要立即取出，在無菌條件下將同一培養(yǎng)皿中未污染的轉(zhuǎn)移到另一新培養(yǎng)皿。在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d左右，產(chǎn)生了愈傷組織，以后愈傷組織逐漸變綠，20d后從愈傷組織上分化出不定芽；30天后有57個(gè)外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生出了愈傷組織，其中有30個(gè)分化出了不定芽（見表

19、一，圖三）。表一：外植體愈傷分化情況天數(shù)外植體數(shù)(個(gè))愈傷組織的誘導(dǎo)率%不定芽分化率%1511130.003011151.1152.9注：愈傷組織的誘導(dǎo)率%=愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)/外植體數(shù)。不定芽分化率%=不定芽分化數(shù)/愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)。 a b c 圖三：由葉盤轉(zhuǎn)化法得到的煙草葉片愈傷組織及分化出的不定芽（a:15天后誘導(dǎo)出現(xiàn)愈傷組織；b:20天后愈傷組織繼續(xù)分化；c:30天后分化出的不定芽）由表一可以看出，我們獲得了有抗性的愈傷組織，并在篩選培養(yǎng)基上分化出了不定芽；圖三表明，可能目標(biāo)基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化，還需進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證是否就是轉(zhuǎn)基因煙草。3討論3.1葉片的取材葉片取材相當(dāng)容易，但是轉(zhuǎn)化要選用健

20、壯而較幼嫩的葉片（長(zhǎng)至2-3cm為宜），若葉片太嫩，則在農(nóng)桿菌侵染后葉片就會(huì)脫水；若葉片太老，農(nóng)桿菌侵染后葉片就會(huì)失去活力。在接種葉片時(shí)，要把葉片的正面貼在培養(yǎng)基上，因?yàn)檫@樣觀察到這樣放置的再生效果較好。3.2影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素轉(zhuǎn)化體的選擇是遺傳轉(zhuǎn)化過程中一個(gè)重要步驟，一般采用適當(dāng)?shù)倪x擇劑進(jìn)行篩選，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能在含有選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和分化，而未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則被抑制和殺死。一定要選用合適的選擇劑濃度，選擇能全部抑制或殺死外植體的最小(臨界)濃度作為選擇劑的最適濃度。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞時(shí),本實(shí)驗(yàn)采用頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng),卡那霉素用以篩選。對(duì)于卡那霉素所選的作用濃度為50ug/ml，如果

21、其濃度過小，在篩選抗性植株時(shí)就會(huì)出現(xiàn)較多的假陽性植株；如果濃度過大，就會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因植株的再生。選用頭孢霉素的作用濃度為400ug/ml,它可以抑制根癌農(nóng)桿菌的過度繁殖，因此濃度也要適量。然而，對(duì)于煙草來說，由于影響轉(zhuǎn)化效果的因素還很多，例如，植物的基因型、農(nóng)桿菌菌株以及農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)的條件等。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌作為一個(gè)獨(dú)立體系直接影響到轉(zhuǎn)化頻率的高低。在農(nóng)桿菌快速的生長(zhǎng)過程中常常會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、基因突變。因此，不但要選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)獲得單一菌落。取單一菌落進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在合適的時(shí)機(jī)與植物細(xì)胞或組織混合共培養(yǎng)，其余的菌落可在固體平板培養(yǎng)基上于4下保存數(shù)月或15%甘

22、油中-70長(zhǎng)期保存。利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌進(jìn)行保存、篩選、繁殖和轉(zhuǎn)化最為有效。農(nóng)桿菌的濃度也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，在對(duì)農(nóng)桿菌的稀釋過程中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌濃度過高，會(huì)對(duì)葉片造成污染，致使葉片死亡，而濃度過低，農(nóng)桿菌進(jìn)入植物體的數(shù)目減少，轉(zhuǎn)化的成功率會(huì)降低。溫度與轉(zhuǎn)速同樣也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，若溫度過高，可能會(huì)引起質(zhì)粒丟失，而溫度過低，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)緩慢。同樣轉(zhuǎn)速低于250r/min，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間就長(zhǎng)。農(nóng)桿菌葉盤直接浸泡法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化時(shí),感染后共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，如果太短，外源dna還來不及整合到植物dna中，而時(shí)間過長(zhǎng)，根癌農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)，又會(huì)損壞植物細(xì)胞造成再生困難。不同的煙草品種

23、在整個(gè)轉(zhuǎn)基因的過程中所需的時(shí)間不一樣，這與不同的煙草品種的生長(zhǎng)周期有關(guān)。通常共培養(yǎng)時(shí)間為2d.而在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不能完全依賴天數(shù)來確定培養(yǎng)的最佳時(shí)間.菌液濃度、溫度、植物材料的不同,結(jié)果可能也會(huì)完全不同,有時(shí)培養(yǎng)2d后,外植株已被菌包埋,有時(shí)2d后未見菌落,此時(shí)轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基很難獲抗性愈傷,芽的再生頻率極低(5%).這可能是農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)導(dǎo)致外植體的養(yǎng)分供應(yīng)困難,而造成再生困難;菌與外植體有效接觸時(shí)間過短外源基因尚未整合到植物基因組中之故。對(duì)于影響轉(zhuǎn)化效率的因素，本實(shí)驗(yàn)還可繼續(xù)進(jìn)行研究其他條件對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，如農(nóng)桿菌侵染葉片的時(shí)間長(zhǎng)短，培養(yǎng)時(shí)間、溫度、光照以及培養(yǎng)基內(nèi)抗生素含量等，這些因素都可能

24、對(duì)植株的再生產(chǎn)生影響。再者，為了提高實(shí)驗(yàn)效果還可以在稀釋后的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中加入乙酰丁香酮，這樣可以增加菌株的侵染活力。有人報(bào)道如果在轉(zhuǎn)化前把植物組織與乙酰丁香酮共培養(yǎng)34個(gè)小時(shí)效果會(huì)更好。本實(shí)驗(yàn)選用了轉(zhuǎn)基因模式植物本氏煙，培養(yǎng)基、激素濃度、抗生素及其濃度的選擇都是用了經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。已經(jīng)初步篩選獲得抗性愈傷組織與再生芽，下一步的工作是將不定芽切下接種于含kan的ms生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根至獲得完整的抗性植株，然后進(jìn)行pcr檢測(cè)驗(yàn)證是否為轉(zhuǎn)基因植株；進(jìn)一步的工作是將黃瓜花葉病毒(cmv)、煙草花葉病毒（tmv）等植物病毒對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)植株對(duì)病毒的抗性變化，進(jìn)而驗(yàn)證目的基因的表達(dá)，如

25、果該轉(zhuǎn)基因煙草品種能夠成功培育獲得，并具有對(duì)植物病毒的廣譜抗性，在保證安全性的前提下，將有望在較大程度上提高煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量，在煙草轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域也有著重大的理論和實(shí)踐意義！參考文獻(xiàn)：1 屈艾,汪承潤(rùn) 干擾素及其研究進(jìn)展 徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 第20卷第2期2 陳炬,孫勇如,李向輝等. 干擾素cdna在轉(zhuǎn)化的煙草植株中的表達(dá).中國(guó)科學(xué)(輯),1990,(3):253.3 陳谷，葉長(zhǎng)明，李寶健等， 植物抗病毒基因工程的研究進(jìn)展 生物技術(shù)通報(bào) 1999年第6期4 洪劍明，印莉萍，邱澤生等，植物抗病基因工程進(jìn)展 植物學(xué)通報(bào)1998,15(1):8165 楊學(xué)習(xí)，煙草花葉病毒地黃分離物移動(dòng)蛋白基因的克隆、序列分析及對(duì)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化6 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)論文 20037 j.薩姆布魯克 e.f.弗里奇 t.曼尼阿蒂斯 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第二版） 科學(xué)出版社 8 佟英. 魯世軍. 張務(wù)水煙草病毒感染機(jī)理及其綜合防治 中國(guó)煙草學(xué)報(bào) 2003年02期39-429 高書穎，范三紅，郭藹光. 朱幫福. 陳蘇民hbmp-3m基因在煙草中的表達(dá)西北植物學(xué)報(bào)2003,23 4 :57758010 郭麗紅,陳善娜1,龔明3根癌農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化煙草的條件探索 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,25(