病毒鑒定的方法有哪些

1、病毒鑒定的方法有哪些？從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離病毒， 然后采用免疫熒光和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)已被 成功地用于病毒的鑒定。 目前最常用的病毒定量檢測(cè)方法有以下三大類： 用于病毒感染力檢 測(cè)的技術(shù)，如病毒空斑形成試驗(yàn)，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量TCID50 測(cè)定和免疫熒光等；病毒核酸和病毒蛋白檢測(cè)技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)（qPCR），免疫印跡，免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ ELISA）和血凝試驗(yàn)等；還有就是那些直接對(duì)病毒顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，如 流式細(xì)胞分析或透射電鏡技術(shù)。病毒檢測(cè)方法的局限性病毒鑒定方法1. 培養(yǎng)細(xì)胞的顯微學(xué)觀察材料和儀器細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基： 含 10% FBS胎（ 牛血清 ）, 4

2、-6 mM Glutamine （谷氨酰胺） 的高葡萄糖 DMEM， 若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等 維持培養(yǎng)基：上述新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，但血清FBS濃度減少至為 2%宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的 8 孔培養(yǎng)腔室玻片（ chamber slides ）PBS磷酸緩沖液Bouins 固定液吉姆薩（ Giemsa）緩沖液吉姆薩（ Giemsa）染色液 丙酮，丙酮：二甲苯（ 2:1），丙酮：二甲苯（ 1:2），二甲苯 中性樹膠移液槍頭 （10 到 100 微升 ） 移液管生物安全柜（超凈臺(tái)） 二氧化碳培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)方案接種宿主細(xì)胞至 Chamber Slides：選擇合適的細(xì)胞

3、接種密度（比如 8-孔 Chamber Slides， 接種 30,000 細(xì)胞/ 孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ 10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃 chamber slides 使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確 認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到 80%以上的融合度。制備不同稀釋度的病毒液： 標(biāo)記 6支無菌離心管， 第 1管加入 990 l細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基， 剩下 5管加入 900 l細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。按以下方法進(jìn)行梯度稀釋：在第1 管中加入 10 l病毒原液（稀釋度 1:100）充分混勻，然后從第 1 管吸 100 l 至第 2 管中混勻，依次類推， 進(jìn)行

4、10 倍梯度稀釋。管 1 至管 6 的稀釋度分別為 10-3 到 10-7。感染細(xì)胞：吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL 維持培養(yǎng)液（ 2%FBS-DMEM），再加入 100 l 不同稀釋度（ 10-2 至 10-7 稀釋）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作為空白 對(duì)照。將細(xì)胞置二氧化碳培養(yǎng)箱 37oC 或 34oC 培養(yǎng) 1-4 周，追蹤觀察致細(xì)胞病變效應(yīng) （ CPE） 發(fā)生情況。吉姆薩染色：一旦觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)，輕輕地用PBS將細(xì)胞洗 3 次，每次 5min ，然后加入 Bouins 固定液固定 10 min。用吉姆薩緩沖液洗 3 次，然和加入 Giemsa染液染色 1 h， 再用

5、吉姆薩緩沖液清洗后依次用丙酮處理15s，2:1 的丙酮 -二甲苯處理 30s，1:2 的丙酮 -二甲苯處理 30s，最后用二甲苯處理 10 min 緊接著用中性樹膠封片。 顯微鏡下觀察 CPE，包涵體， 細(xì)胞融合及病毒空泡形成情況。 病毒感染細(xì)胞后形成的 CPE圖片范例可以在很多圖譜， 網(wǎng)站 和博客上找到，例如 ASM Microbe Library2. 免疫熒光 （IF）檢測(cè)方法 材料和儀器細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基：含 10%FBS胎（ 牛血清 ）, 4-6mM Glutamine （谷氨酰胺）的高葡萄糖 DMEM，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等 宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的 8 孔培

6、養(yǎng)腔室玻片（ chamber slides ） PBS磷酸緩沖液 一抗FITC標(biāo)記的二抗 細(xì)胞核染料 DAPI5-4 %多聚甲醛（ PFA，pH7.4），或者甲醇 移液槍頭 （10 到 100 微升 ） 離心管生物安全柜（超凈臺(tái)） 二氧化碳培養(yǎng)箱 熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)方案接種宿主細(xì)胞至 Chamber Slides：選擇合適的細(xì)胞接種密度（比如 8-孔 Chamber Slides， 接種 30,000 細(xì)胞/ 孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ 10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃 chamber slides 使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確 認(rèn)細(xì)胞是否分布

7、均勻并達(dá)到 80%以上的融合度。病毒感染： 每孔細(xì)胞加 0.1 mL 病毒儲(chǔ)存液， 留一孔不加作為陰性對(duì)照。 將細(xì)胞放回 CO2 培養(yǎng)箱， 37C 或 34 C 培養(yǎng) 48h。免疫熒光染色觀察： 病毒感染 48h 后，吸去培養(yǎng)液， 將細(xì)胞用預(yù)冷的甲醇固定 5min(也 可用新鮮制備的 4%多聚甲醛固定)后，用含 0.2% triton X 的 PBS室溫破膜 5min 。將細(xì)胞用 PBS清洗后，加入推薦濃度的一抗孵育2h，PBS清洗 5遍，然后再加入熒光( Alexa fluor 488或 FITC)標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育， PBS 清洗 5 遍，加入 DAPI 染細(xì)胞核，在相差及熒光顯微鏡 下觀

8、察結(jié)果。3. 分子學(xué)方法用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR(Real-time RT-PCR)來檢測(cè)流感病毒比終點(diǎn)檢測(cè)方法更為快捷， 且敏感度跟細(xì)胞培養(yǎng)法相當(dāng)甚至更佳用分子技術(shù)從臨床樣本中直接對(duì)病毒基因組進(jìn)行鑒定是 21 世紀(jì)的重大發(fā)現(xiàn)之一。核酸 擴(kuò)增技術(shù)包括 PCR、基于核酸序列的擴(kuò)增 (NASBA)和勞倫斯利弗莫爾微生物檢測(cè)陣列 (LMDA) 等都無疑是快速檢測(cè)和鑒定大多數(shù)已知人類病毒的領(lǐng)先技術(shù)。PCR 可以在 體外 將 DNA 序列的一段特定區(qū)域擴(kuò)增 106 倍，因此是一種極其敏感的檢測(cè)手段。 PCR還可以用于病毒 RNA 的鑒定， 只需先將 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 DNA，然后再進(jìn)行 PCR分析，這一方法被稱之為逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)。采用特異性的引物鑒定甲型流感病毒。 M：Marker，