重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化2解析

1、實驗?zāi)康?. 掌握通過酶切與PCF擴增鑒定重組DNA分子的基本方法。2. 學(xué)習(xí)和掌握PCRT增的基本原理和實驗技術(shù)。實驗原理1酶切法鑒定重組 DNA重組質(zhì)粒是外源基因通過單酶切（或雙酶切）與用相同的（或兩種）限制 性核酸內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒載體連接后獲得的，因此在連接處仍保留原限制性核 酸內(nèi)切酶的識別序列，用該酶（或兩種酶）再次切割重組質(zhì)粒，能把插入片段 切離載體，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見有載體片段和插入的外源DNA片段,并可知插入片段的大小。2. PCR擴增法鑒定重組質(zhì)粒PCF反應(yīng)可以用來鑒定載體上是否重組了外源 DNA片段，并可估測外源插 入片段的大小，。根據(jù)載體多克隆位點上下游基因的序列設(shè)

2、計一對PCF引物,兩引物之間的距離即是空載體PCF擴增的大小，如果在多克隆位點內(nèi)插入外源 DNA片段，就會改變PCF擴增產(chǎn)物的大小，擴增產(chǎn)物的大小減去兩引物之間的 距離即是插入片段的長度，也可以直接基于外源 DNAW端的序列設(shè)計一對引 物，分分別以空載體和重組質(zhì)粒為模板進行 PCF反應(yīng)，只有重組質(zhì)粒能擴增出 一定大小的產(chǎn)物，貝夠產(chǎn)物的大小即是插入片段的大小。3. PCR擴增原理具有模板DNA寡核苷酸引物，M0+, 4種脫氧核糖核苷酸（dNTPS、 DNA聚合酶和緩沖液所有組分的PCF反應(yīng)體系中，在模板變性，引物退火后，模擬體內(nèi)半保留復(fù)制過程一一即在 DNA聚合酶的作用下，以變性單鏈為模板， 依

3、據(jù)堿基互補配對原理，在引物的 3端加入合適的核苷酸分子，不斷延伸直 至完成新DNA的合成。新合成的DNA分子也可以作為模板，參與后續(xù)的擴增反 應(yīng)，使目的分子呈指數(shù)增長。因此，變性、退火和延伸循環(huán)反復(fù)2530次后，即可以從少量的模板DNA中擴增出大量的目的產(chǎn)物。PCRT增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例， 在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的 DNA為模板，引物是從3端開始延伸， 其5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片

4、段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即“長產(chǎn)物片段”結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段 3端被固定了止點，保證了新片段的起點和 止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR勺反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純 DNA 片段供分析與檢測用。主要儀器和試劑1儀器和材料微量移液器，吸頭和吸頭盒，37C恒溫水浴鍋，PCFT增儀，高速離心機，微波爐，電泳槽，電泳儀，Eppendof管（1.5mL，0.2mL），

5、制膠槽，梳子，錐形瓶，量筒，冰盒，手套，記號筆，凝膠成像檢測儀等2.實驗試劑酶切檢測：重蒸水，限制性核酸內(nèi)切酶 Hind IH（ 15U/卩L），限制性核酸內(nèi)切酶緩沖液（10X M Buffer ），Re-pUC19等。PCF檢測：TaqDNA聚合酶（5U/ 卩 L）, PCR反應(yīng)緩沖液（10X Buffer ）,dNTP昆合物，重蒸水，M13F(10y M M13R(1Qx M Re-pUC19(約 10ng/ 卩 L)等。瓊脂糖凝膠電泳試劑：6X上樣緩沖液，TAE緩沖液，瓊脂糖，DNA標準Marker (入 DNA/HindM),DL2000 Plus，溴化乙錠EB等。實驗步驟（一）重組質(zhì)

6、粒的酶切驗證Re-pUC192.01.對于電泳顯示插入片段在2.0kb以上的重組質(zhì)粒，米用以下酶切體系進行驗證：大片段或咼產(chǎn)成分量(卩L)ddH O6.210xM1.0BufferHind 川0.8共計10.0輕彈混勻后， 短暫離心，37C保溫2hr后，保 存于-20C,備電泳檢測。表一：大片段酶切反應(yīng)體系2. 對于電泳顯示插入片段在2.0kb以下的重組質(zhì)粒，不推薦使用酶切法進行驗 證，如若使用，則是適當更改反應(yīng)體系：小片段或低產(chǎn)成分量11.0-ddH O10xMBufferRe-pUC19Hind 川共計9.02.06.08.01.020.0輕彈混勻后， 短暫離 心，37C保溫2hr后，保

7、存于-20C,備電泳檢測。表二：小片段酶切反應(yīng)體系3. 利用空載體片段和目的基因片段作為對照，對酶切后重組質(zhì)粒的片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，從酶切后的片段的數(shù)目及大小上進行確認：大片段：10.0卩L酶切產(chǎn)物+2.0卩L 6 x Loading Bf，混勻一取6.0卩L點 樣，電泳，染色，檢測。 小片段：20.0卩L酶切產(chǎn)物+3.0卩L 10 x Loading Bf，混勻取12.0-13.0卩L 點樣，電泳，染色，檢測。（二）重組質(zhì)粒的 PCR驗證/PCR擴增目的基因?qū)τ陔娪倦娨暡迦肫卧?.0kb以下的重組質(zhì)粒，推薦采用 PCR1行驗證。1. 以提取的質(zhì)粒為模板，加入合成的引物，進行PCR反

8、應(yīng)，其反應(yīng)體系如下：小片段或低成分產(chǎn)量（大體系，ddH2O13.610x Buffer2.0dNTP1(2.5mmol each ).60M13F(10D M.80M13R(10D M.8模板（約110ng/L).0Taq酶0.2總體積20.0輕彈混 勻后，短暫離心，進行PCRPCR后保存于20C,備電泳檢測。備注：取1卩L質(zhì)粒+49卩LddH20（即稀釋50X），然后從中取1卩L作為PCR勺模板。表三：PCR反應(yīng)體系2. PCR反應(yīng)程序：94C，變性3min :94C，變性30s :58C，復(fù)性30s ;72C，延伸1min,轉(zhuǎn)，循環(huán)29次；72C，延伸lO.Omin ; 4C, 保存。3.

9、 PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測（1 %的瓊脂糖凝膠）PCR反應(yīng)結(jié)束，用DL2000 plus作對照，電泳，確定PCR產(chǎn)物的大?。?0.0卩L PCR產(chǎn)物+3.0卩L 10 x Loading Bf，混勻取5.0卩L點樣，電泳， 染色，檢測。4. 產(chǎn)物長度預(yù)測PCRT增產(chǎn)物的長度（bp）二載體pUC19兩引物間序列的長度（150bp+插入 片段的長度。實驗結(jié)果（一）重組質(zhì)粒的酶切驗證電泳結(jié)果:2246812入/Hind樣川品(Ma r k e rJD1R1/Hind出JD1R2/Hind出JD2R1/Hind出PUC19/Hind出入/Hin d 出 (M a r k e r樣量6(0l6

10、6 60 0 0表四：從左至右各泳道的樣品及樣量（酶切）1w圖一：重組質(zhì)粒的酶切驗證電泳圖第2和第22泳道為入/Hind川（Marker，起定位作用。因為實驗組比較多，橫向距 離比較長，所以在實驗組兩側(cè)都設(shè)有入/Hind IH （Marker，防止因為電泳時凝膠擺放不正等因素，而導(dǎo)致的條帶位置判斷失誤。第21泳道為pUC19/HindH,起對照作用。每個實驗組質(zhì)粒在酶切后都應(yīng)該含有一 條線性pUC19段，故設(shè)置pUC19/HindH為對照組，有助于判斷酶切后的線性 pUC19段所對應(yīng)位置。除第2,第22和第21條帶外，其他各泳道均為各小組樣品的電泳情況。我們小組 的實驗結(jié)果在第13-16泳道，

11、其中第13，15泳道為試劑盒抽提出來的兩組質(zhì)粒的 電泳情況，第14，16泳道為兩種質(zhì)粒對應(yīng)的Hind H酶切產(chǎn)物電泳情況。下面將分 別就我們組每種質(zhì)粒以及其酶切產(chǎn)物的電泳條帶進行分析：第13泳道對應(yīng)抽提的1號質(zhì)粒（編號：JD-4-1 ）。其中最亮的主條帶對應(yīng)超螺 旋構(gòu)象的質(zhì)粒，在主條帶上方由上至下分別為開環(huán)和線性構(gòu)象的質(zhì)粒。通過前期的 電泳結(jié)果初步判斷該質(zhì)粒為pUC19空載體質(zhì)粒，與其他各組超螺旋質(zhì)粒對比，其超 螺旋構(gòu)象泳動的距離最長，其條帶位于最靠下的位置。第14泳道為JD-4-1質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，泳道中主條帶與第 21泳道的pUC19/HindH條帶平齊，且位于 marker 中從上至下第4

12、條帶（4361bp）和第5條帶（2322bp）對應(yīng)位置之間，說明為線性 PUC19片段。同時，由于酶切沒有進行完全，在主條帶下方有一條與第13泳道超螺旋質(zhì)粒平齊的微弱條帶。酶切結(jié)果再一次證明，JD-4-1質(zhì)粒為空載體質(zhì)粒。第15泳道對應(yīng)抽提的2號質(zhì)粒（編號：JD-4-2 ）。其中最亮的主條帶對應(yīng)超螺旋 構(gòu)象的質(zhì)粒，在主條帶上方由上至下分別為開環(huán)和線性構(gòu)象的質(zhì)粒。通過前期電泳結(jié)果初步判斷該質(zhì)粒為連接125bp入/Hind H外源片段的重組質(zhì)粒，其超螺旋構(gòu)象 的涌動距離僅次于空載體質(zhì)粒，在 Marker中從上至下第6條帶（2027bp）對應(yīng)位 置偏下。第16泳道為JD-4-2質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，泳道中

13、共有 3個條帶，至上而下分別對應(yīng)：與第21泳道pUC19/HindH條帶平齊的線性pUC19片段，與第15泳道超 螺旋構(gòu)象質(zhì)粒平齊的未完全酶切的超螺旋構(gòu)象重組質(zhì)粒，與 入/Hind H（ Marker）中從上至下第八條帶（125bp）平齊的外源片段。酶切結(jié)果再一次證實，JD-4-2質(zhì)粒為插入125bp入/Hind川外源片段的重組質(zhì)粒。（二）重組質(zhì)粒的 PCR驗證電泳結(jié)果泳道1 ,678910111213 ,16DL2000r 1 一JD-3JD-3 JD-3JD-3JD-3JD-4JD-4JD-3樣品R2R2564Puc19H2O564bpR1R2DL2000PlusPlus樣量（卩l(xiāng)）5.0

14、5.05.05.05.05.05.05.0表五：從左至右各泳道的樣品及樣量（PCR圖三：重組質(zhì)粒的PCR驗證電泳圖第1和第18泳道為DL2000 Plus（Marker，起定位作用。第9、10、11泳 道分別為：以pUC19為模板的PCR產(chǎn)物，以水作空白對照的PCR產(chǎn)物，以插入 564bp入/Hi ndM外源片段的重組質(zhì)粒為模板的 PCR產(chǎn)物。其余泳道為各小組 PCF產(chǎn)物電泳條帶。第12、13泳道為以我們組抽提的質(zhì)粒（JD-4-1，JD-4- 2）為模板的PCR產(chǎn)物電泳條帶.第1和第18泳道為DL2000 Plus （Marker，起定位作用。因為實驗組比 較多，橫向距離比較長，所以在實驗組兩

15、側(cè)都設(shè)有DL2000 Plus，防止因為電泳時凝膠擺放不正等因素導(dǎo)致條帶位置判斷失誤。第9泳道為以pUC19為模板的PCR產(chǎn)物，和第1泳道對比，看出以pUC19 （空載體）為模板PCR反應(yīng)產(chǎn)物條帶對應(yīng)于第1泳道自上而下第7條帶 （250bp）和第8條帶（100bp）之間，說明其大小介于100250bp之間，符合 預(yù)期實驗結(jié)果，因為理論上，空載體 PCR產(chǎn)物大小為150bp。第10泳道為，以水作空白對照的PCF產(chǎn)物。在PCF反應(yīng)體系中沒有加模 板，理論上電泳時不應(yīng)該出現(xiàn)條帶，但是從圖中看出，第10泳道有3條帶，從上至下第一條帶對應(yīng)大小在 500bp-750bp之間，第二條帶與Marker中 25

16、0bp帶基本持平，第三條帶與100bp帶位置基本持平，與預(yù)期結(jié)果不符，分 析如下：可能是提供的ddH2O被污染，因為各小組共用一瓶重蒸水，如果取水時未更換用過的槍頭，就會導(dǎo)致重蒸水中混入部分重組質(zhì)粒。如第一條帶位置與第11泳道中條帶位置較接近；第二條帶位 置與第13泳道中條帶位置基本持平。M13F,M13R兩引物形成二聚體，并以此二聚體為模板進行PCR反應(yīng)，其大小應(yīng)為47+48=95bp,對應(yīng)于第三條帶；物大量與模板結(jié)合，引物之間很難形成二聚體或形成的量很少。同時，如果水被 污染，加入模板后，模板的量遠遠大于摻雜的質(zhì)粒的量，所以主反應(yīng)仍然對模板 的PCR反應(yīng)，對雜質(zhì)粒PCR反應(yīng)很少，幾乎為零。

17、第11泳道為以插入564bp入/Hind川外源片段的重組質(zhì)粒為模板的 PCR產(chǎn)物，與第 18泳道相比，其條帶對應(yīng)于第18泳道自上而下第5條帶(750bp)和第6條帶(500bp)之間，且靠近第5條帶，說明其大小介于500750bp之間，這也符合預(yù) 期結(jié)果，因為理論上，插入 564bp大小入DNA/Hin d川片段的重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物 大小為 564+150=714bp=第12泳道為以JD-4-1為模板的PCR產(chǎn)物。理論上，因為JD-4-1為pUC19空載體質(zhì)粒，故其電泳條帶應(yīng)與第9泳道pUC19對照組電泳條帶平齊。但是，從電泳圖 中可以看出，第12泳道有3條微弱條帶，且3條帶分別與第10泳道空

18、白對照組中 的3條帶相對應(yīng)。說明在配制PCR體系時，可能忘記加JD-4-1模板或者錯誤的把 水當做模板。第13泳道為以JD-4-2為模板的PCR產(chǎn)物。泳道中只有一條帶，大小為 250bp左 右。由于JD-4-2為插入了 125bp入/Hind川外源片段的重組質(zhì)粒，其 PCR產(chǎn)物大小 理論上為125+150=275bp,與實際電泳結(jié)果相符。注意事項1. 實驗中加樣后及時更換吸頭，以避免試劑的污染。2. PCR反應(yīng)高度靈敏，應(yīng)設(shè)法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸頭，反應(yīng)加樣區(qū)與DNA模板制備區(qū)及PCR電泳檢測區(qū)分開等。3. 將除了 TaqDNA聚合酶的其他試劑從-20C的冰箱中取出，室溫融化離心后置于 冰浴中待用。TaqDNA聚合酶用時從-20C的冰箱中