植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技術(shù)

1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 第七章 植物脫毒快繁技術(shù) 一、病毒危害 多數(shù)栽培植物，尤其無性繁殖植物，都易受多數(shù)栽培植物，尤其無性繁殖植物，都易受 到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如，到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如， 草莓染草莓染60多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時間的推移，多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時間的推移， 侵染病毒的種類越來越多。侵染病毒的種類越來越多。 植物病毒病原體可通過維管束傳導(dǎo)。因此，植物病毒病原體可通過維管束傳導(dǎo)。因此， 對無性繁殖的植物來說，一旦感染上病毒之后，對無性繁殖的植物來說，一旦感染上病毒之后， 就會代代相傳。就會代代相傳。 受病毒侵染的植物生長緩慢、畸形

2、、產(chǎn)量大受病毒侵染的植物生長緩慢、畸形、產(chǎn)量大 幅度下降，品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價值。幅度下降，品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價值。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失很大，如草莓病病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失很大，如草莓病 毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄 扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10101818，花卉病毒的危害一般，花卉病毒的危害一般 會影響花卉的觀賞價值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、會影響花卉的觀賞價值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、 變色等。變色等。 由于病毒對植物造成如此嚴童的

3、危害，所以世界各由于病毒對植物造成如此嚴童的危害，所以世界各 國都積極開始重視這方面的研究。國都積極開始重視這方面的研究。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 小麥黃矮病毒病小麥黃矮病毒病 草莓鑲脈病毒 西瓜病毒病 煙草普通花葉病煙草普通花葉病 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 目前，對細菌和真菌侵染的病害，可通過藥目前，對細菌和真菌侵染的病害，可通過藥 物處理達到治愈的目的。但還沒有治病毒的特效物處理達到治愈的目的。但還沒有治病毒的特效 藥。種子一般不帶病毒，種子繁殖可得無毒植株。藥。種子一般不帶病毒，種子繁殖可得無毒植株。 但對于無性繁殖植物，必須采取一些特殊方法脫但對于無性繁殖植物，必

4、須采取一些特殊方法脫 除病毒。除病毒。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 無病毒植株培育的意義無病毒植株培育的意義 1. 1. 去除病毒危害，提高作物品質(zhì)與產(chǎn)量。去除病毒危害，提高作物品質(zhì)與產(chǎn)量。采用生物、物理、 化學(xué)等途徑防治病毒病收效甚微，甚至毫無成效。而通過 組織培養(yǎng)的方法可以脫除嚴重患病毒植物的病毒種類，提 高產(chǎn)量、質(zhì)量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果 樹等得到廣泛的應(yīng)用。 2. 2. 減少環(huán)境污染，有利于保護環(huán)境減少環(huán)境污染，有利于保護環(huán)境 栽培去病毒植物可 減少藥劑的使用。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 二、脫毒方法 (一) 熱處理脫毒 （一）發(fā)現(xiàn)：（一）發(fā)現(xiàn)： 1

5、889年印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎病的甘蔗(現(xiàn)證 明為病毒病)，放在50-52的熱水中保持30min，甘蔗就可 去病生長良好。以后此方法被廣泛用于防治許多植物的病 毒病。 熱處理又稱溫治療法。熱處理又稱溫治療法。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、熱處理脫毒原理： 病毒是病毒是DNADNA大分子，病毒進入植大分子，病毒進入植 物細胞后，隨植物細胞物細胞后，隨植物細胞DNADNA一起復(fù)制。一起復(fù)制。 熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒 的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或 增殖停止，而失去病毒的侵染能力。增殖停止，而失去病

6、毒的侵染能力。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 熱處理是一種物理效應(yīng)，可加速植物細熱處理是一種物理效應(yīng)，可加速植物細 胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋 白合成占優(yōu)勢，使植物細胞在與病毒繁白合成占優(yōu)勢，使植物細胞在與病毒繁 殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細 胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利 用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r間，進用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r間，進 行高溫處理，就

7、能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低，行高溫處理，就能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低， 傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細胞仍然存?zhèn)鬟f速度減慢或失去活性，而寄主細胞仍然存 活，并加快分裂和生長?；睿⒓涌旆至押蜕L。 熱處理區(qū)熱處理區(qū) 低低 溫溫 高高 溫溫 生長區(qū)生長區(qū) 寄主無損傷寄主無損傷病原微生物被消除病原微生物被消除 寄主被殺死寄主被殺死 BAC 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) (1)溫湯浸漬處理 (2)熱空氣處理 2、熱處理脫毒方法 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （1 1）. . 溫湯浸漬處理溫湯浸漬處理 F 適用：適用：休眠器官、剪下的接穗或種植的 材料 F 方法方法：50左右的溫水中浸漬10

8、min 至數(shù)小時 F 特點：特點：方法簡便易行，但易使材料受傷。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （2.2.） 熱空氣處理熱空氣處理 F 適用：適用：對活躍生長的莖尖效果較好 F 方法：方法：將生長的盆栽植株移人溫?zé)嶂委熓?箱)內(nèi)，一般 在3540下處理幾十分鐘至數(shù)月。處理時間因植物而異， 如香石竹于38下處理兩個月，其莖尖所含病毒即可被清除。 馬鈴薯在35下處理幾個月才能獲得無病毒苗。 F 特點：特點：熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒。例 如在馬鈴薯中，應(yīng)用這項技術(shù)只能消除卷葉病毒。因此熱處 理需與其他方法配合應(yīng)用，才可獲得良好的脫毒效果 。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 熱

9、處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊熱處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊 花等植物。如：葡萄置于花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇葉病毒?？扇コ热~病毒。 熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋 果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒 不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效 果更好。果更好。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 葡萄扇葉病毒葡萄扇葉病毒 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 蘋果花葉病毒蘋果花葉病毒 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、莖尖培養(yǎng)

10、脫毒原理 2、培養(yǎng)基 3、莖尖培養(yǎng)方法 4、影響微莖尖培養(yǎng)的因素 外植體大小 培養(yǎng)條件 外植體的生理狀態(tài) （二）莖尖培養(yǎng)脫毒 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 植物的去病毒技術(shù)，實質(zhì)上就是采取不含植物的去病毒技術(shù)，實質(zhì)上就是采取不含 病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的病毒顆粒或病毒顆粒含量甚少的0.10.5mm 帶帶12個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁 殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術(shù)。殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術(shù)。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理 病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，其數(shù)量隨植株病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，其數(shù)量隨

11、植株 部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染 的程度越低，生長點即分生組織（約的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm） 幾乎不含或含病毒很少。幾乎不含或含病毒很少。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、植物體病毒的移動主要靠、植物體病毒的移動主要靠2條途徑：一是通過維管條途徑：一是通過維管 系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連 絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖 細胞不斷分裂和活躍的生長速度。細胞不斷分裂和活

12、躍的生長速度。 2、當(dāng)植物細胞分裂、當(dāng)植物細胞分裂DNA復(fù)制時，病毒復(fù)制時，病毒DNA隨著復(fù)制。隨著復(fù)制。 因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺 盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占 優(yōu)勢，使病毒無法進行復(fù)制。優(yōu)勢，使病毒無法進行復(fù)制。 3、莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。、莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。 4、在植物體內(nèi)存在有一種、在植物體內(nèi)存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)病毒鈍化系統(tǒng)”，在分生，在分生 組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。組織

13、中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。 分生組織不帶病毒，可能有分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：方面的原因： 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 2、培養(yǎng)基 一般以一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽 和銨鹽含量有利于莖尖生長。和銨鹽含量有利于莖尖生長。MS培養(yǎng)某些植物莖培養(yǎng)某些植物莖 尖時，有些離子濃度過高應(yīng)稀釋。尖時，有些離子濃度過高應(yīng)稀釋。 在雙子葉植物中，激素可能在第在雙子葉植物中，激素可能在第2對葉原基中對葉原基中 合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必 須加入生長素與細胞分裂素，濃度要合適。在生長

14、須加入生長素與細胞分裂素，濃度要合適。在生長 素中應(yīng)避免用易促進愈傷組織化的素中應(yīng)避免用易促進愈傷組織化的2，4-D，宜用宜用 NAA或或IBA；細胞分裂素用細胞分裂素用KT或或BA；GA3對某些對某些 植物莖尖培養(yǎng)有用。植物莖尖培養(yǎng)有用。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 3、莖尖的培養(yǎng)方法 需要一臺解剖鏡（需要一臺解剖鏡（8-40倍）。倍）。 剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有 無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行操作，以防莖尖變干。無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行操作，以防莖尖變干。 莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴 密

15、保護，只要仔細解剖，密保護，只要仔細解剖，(無須表面消毒無須表面消毒)就可得就可得 到無菌的外植體。有時消毒處理會增加培養(yǎng)物的到無菌的外植體。有時消毒處理會增加培養(yǎng)物的 污染率。污染率。 即：葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只即：葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只 須須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽， 如香石竹、馬鈴薯等，則要用如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表次氯酸鈉表 面消毒面消毒10min。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 蘭花蘭花 馬鈴薯馬鈴薯 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 莖尖長莖尖長 （）（） 葉原基數(shù)葉原基數(shù) 小植

16、株數(shù)小植株數(shù) 脫毒植株脫毒植株 數(shù)數(shù) 脫毒率脫毒率 （）（） 0.120.121 1505024244848 0.270.272 24242181842.942.9 0.60.64 464640 00 0 離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響 切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成 活，過大又不能保證完全出去病毒，所以莖尖活，過大又不能保證完全出去病毒，所以莖尖 大小要合適。大小要合適。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) The Apical Meristem 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快

17、繁技 術(shù) 剝?nèi)∏o尖過程剝?nèi)∏o尖過程: 解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當(dāng)解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當(dāng) 一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀 片將帶片將帶1-2個葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。個葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。 將接種的莖尖置于將接種的莖尖置于22左右溫度下。左右溫度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能 進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。進入休眠；所以較高的溫度和充足的

18、日照時間必須保證。 微莖尖需數(shù)月才能成功。微莖尖需數(shù)月才能成功。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器 官的培養(yǎng)相同。官的培養(yǎng)相同。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代 穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最 重要的一個途徑。重要的一個途徑。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 4、影響微莖尖成活及脫毒的因素 （1）母體材料病毒侵染程度 被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。 （2）外植體大

19、小 在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存 活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機會也就越多?；盥?，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機會也就越多。 除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分 生組織形成植株的能力，一般認為，葉原基能向分生生組織形成植株的能力，一般認為，葉原基能向分生 組織提供生長和分化所必需的生長素和細胞分裂素。組織提供生長和分化所必需的生長素和細胞分裂素。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （2）培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培

20、養(yǎng)效果 好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當(dāng)莖已長到好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當(dāng)莖已長到1cm高時，光高時，光 照強度便增加到照強度便增加到4000lx。 （3）外植體的生理狀態(tài) 莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。 取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則 采用適當(dāng)?shù)奶幚?，打破休眠才能進行。采用適當(dāng)?shù)奶幚?，打破休眠才能進行。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （三）莖尖與熱處理相結(jié)合方法 能克服單獨莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低，能克服單獨莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低， 莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點。莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點

21、。 1、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 2、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無菌苗。然后將試管、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無菌苗。然后將試管 苗熱處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。苗熱處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （四）其它途徑脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 2、莖尖微體嫁接 3、化學(xué)療法脫毒 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 愈傷組織細胞帶病原菌不均一，部分細胞不帶病愈傷組織細胞帶病原菌不均一，部分細胞不帶病 毒，由這些細胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的毒，由這些細胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的 愈傷組

22、織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 愈傷組織的某些細胞不帶病毒原因：愈傷組織的某些細胞不帶病毒原因： 1、病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的增殖速度；、病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的增殖速度； 2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。 愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可 能會產(chǎn)生變異植株。能會產(chǎn)生變異植株。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 理由：理由：病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的增殖 速度； 有些細胞通過突變獲得了抗病毒 的抗性。 缺點：缺點

23、：植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異 植株 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （二）莖尖微體嫁接（二）莖尖微體嫁接 概念：概念：將無病毒莖尖（ 0.41.0mm ）嫁接在培養(yǎng)基 上培養(yǎng)的實生砧木上，以獲得脫毒苗木的技術(shù)。 適宜適宜：莖尖培養(yǎng)難以生根的植物，如桃、柑橘、蘋果等 無病毒莖尖來源：無病毒莖尖來源：成年無病毒植物、溫室培養(yǎng)的植物、 熱處理植物和脫毒試管苗。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) （三）化學(xué)療法脫毒（三）化學(xué)療法脫毒 F 許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基 酸、抗菌素等)對離體組織和原生質(zhì)體的培養(yǎng)具有脫 毒效果。 F 常用的藥品有：8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶、殺 稻瘟

24、抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。 F 例如，將100ug2-硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除 去煙草愈傷組織中的PVY (馬鈴薯病毒)。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 三、脫毒快繁材料的選擇 應(yīng)注意以下幾點：應(yīng)注意以下幾點： 1）品種要可靠）品種要可靠 2）要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來作）要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來作 為脫毒材料為脫毒材料 3）名貴的植物良種）名貴的植物良種 4）植物生長旺盛期，再生率高，脫毒效果好）植物生長旺盛期，再生率高，脫毒效果好 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 四、植物病毒的鑒定 1、外觀判斷法 2、指示植物法 3、抗血清鑒定法 4、電子顯微鏡檢查

25、法 5、酶聯(lián)免疫鑒定法(ELISA) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 1、外觀判斷法： 帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這 些表現(xiàn)來判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還些表現(xiàn)來判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還 不夠。不夠。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 2、指示植物檢測法： 指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特 定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。 通常不同病毒應(yīng)選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指通常不同病毒應(yīng)選用

26、不同的植物。馬鈴薯病毒常用指 示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。 分為2種 汁液感染法 嫁接檢測法 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 千日紅千日紅 曼陀羅曼陀羅 豇豆豇豆 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 3、抗血清鑒定法（抗原抗體反應(yīng)） 原理：由于病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的，是一種較原理：由于病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的，是一種較 好的抗原。將病毒給動物注射后產(chǎn)生抗體。抗原和抗體好的抗原。將病毒給動物注射后產(chǎn)生抗體?？乖涂贵w 結(jié)合產(chǎn)生血清反應(yīng)?？乖翰《?。抗體：是指生物體在結(jié)合產(chǎn)生血清反應(yīng)。抗原：病毒。抗體：是指生物體在 外來抗原的刺激下產(chǎn)生的一

27、種免疫球蛋白，主要存在于外來抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，主要存在于 血清中，含抗體的血清稱為抗血清。血清中，含抗體的血清稱為抗血清。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 鑒定方法：鑒定方法： 抗原的制備 抗血清的采收，分離 把稀釋的抗血清與未知的病毒植物的汁液在小 試管內(nèi)混合根據(jù)沉淀反應(yīng)來鑒定病毒種類。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 植物無病毒苗的培育植物無病毒苗的培育 3. 3. 特點：特點： 特異性高（這種抗血清是高度專一 性的試劑），測定速度快，一般幾小時甚 至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為 植物病毒鑒定中最有用的方法之一。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 植物無病毒

28、苗的培育植物無病毒苗的培育 4 4、電子顯微鏡檢查法、電子顯微鏡檢查法 F 病毒有一定的形態(tài)（病毒有一定的形態(tài)（ 球狀、桿狀、線狀等）球狀、桿狀、線狀等） 和大?。ê痛笮。?0.010.3um 0.010.3um ）。）。 F 采用電子顯微鏡（分辨率采用電子顯微鏡（分辨率0.0001um0.0001um）可以）可以 直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，并鑒定病直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，并鑒定病 毒的種類。毒的種類。 F 優(yōu)點：靈敏度高，能在植物粗提取液中定量優(yōu)點：靈敏度高，能在植物粗提取液中定量 測定病毒。測定病毒。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 5、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA

29、) 把抗原把抗原-抗體的免疫反應(yīng)于酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而發(fā)展抗體的免疫反應(yīng)于酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而發(fā)展 起來的一種綜合性技術(shù)，靈敏度高，特異性強，發(fā)展最快起來的一種綜合性技術(shù)，靈敏度高，特異性強，發(fā)展最快 應(yīng)用最廣的方法。應(yīng)用最廣的方法。 原理：采用酶標記的特異抗體指示抗原原理：采用酶標記的特異抗體指示抗原-抗體的結(jié)合，抗體的結(jié)合， 從而檢測樣品中的抗原定量測定法。從而檢測樣品中的抗原定量測定法。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 操作程序：將待檢植物汁液注入酶聯(lián)板（聚苯乙烯多操作程序：將待檢植物汁液注入酶聯(lián)板（聚苯乙烯多 孔微量反應(yīng)板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶孔微量反應(yīng)板）中，使抗原吸

30、附在它的孔壁，加入酶 (過氧化物過氧化物酶或堿性磷酸酶酶或堿性磷酸酶)標記的特異抗體，標記的特異抗體，抗抗 原原-抗體充分反應(yīng)后，清洗，固相載體抗體充分反應(yīng)后，清洗，固相載體酶聯(lián)板表面只酶聯(lián)板表面只 留下以酶標記的留下以酶標記的抗原抗原-抗體復(fù)合物。加入酶嘚無色底抗體復(fù)合物。加入酶嘚無色底 物，復(fù)合物上的酶催化底物降解，生成有色物。結(jié)果物，復(fù)合物上的酶催化底物降解，生成有色物。結(jié)果 可由肉眼識別，也可可由肉眼識別，也可用特殊分光光度計對底物的用特殊分光光度計對底物的 降解量進行測定。降解量進行測定。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 五、快速繁殖 莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴大繁殖

31、。莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴大繁殖。 擴繁方法：擴繁方法： 1）組培快繁）組培快繁 2）無毒苗栽到土壤中進行擴繁。如甘薯、草）無毒苗栽到土壤中進行擴繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁 殖。為了預(yù)防病毒再感染，擴繁應(yīng)在培育溫室或殖。為了預(yù)防病毒再感染，擴繁應(yīng)在培育溫室或 防蟲罩內(nèi)，因為昆蟲傳播病毒。防蟲罩內(nèi)，因為昆蟲傳播病毒。 3）兩種方法相結(jié)合，試管內(nèi)擴繁，移栽后再）兩種方法相結(jié)合，試管內(nèi)擴繁，移栽后再 擴繁。擴繁。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 注意：注意： 1、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應(yīng)及時去除、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應(yīng)

32、及時去除 2、脫毒苗并非永遠是無毒苗，由于昆蟲等的傳播，、脫毒苗并非永遠是無毒苗，由于昆蟲等的傳播， 不免會再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗不免會再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗 用用13代代 。 脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原 1代原代原2代代 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 六、脫毒苗在生產(chǎn)中的應(yīng)用 脫毒苗用于生產(chǎn)可以明顯提高產(chǎn)量和質(zhì)量，一般產(chǎn)量脫毒苗用于生產(chǎn)可以明顯提高產(chǎn)量和質(zhì)量，一般產(chǎn)量 可提高可提高30以上。以上。 目前，甘薯、馬鈴薯、草莓、大蒜、百合花、菊花、目前，甘薯、馬鈴薯、草莓、大蒜、百合花、菊花、 康乃馨等都廣泛利用脫毒

33、苗?？的塑暗榷紡V泛利用脫毒苗。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 小結(jié)：脫毒快繁的一般過程 1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類 2、莖尖培養(yǎng)脫毒或結(jié)合熱處理、莖尖培養(yǎng)脫毒或結(jié)合熱處理 3、鑒定、鑒定 4、繁殖、繁殖 5、馴化移植、馴化移植 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 馬鈴薯 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 微型薯 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 馬鈴薯營養(yǎng)繁殖時易受病毒浸染，當(dāng)條件 適合時，病毒就會在植株內(nèi)增殖，轉(zhuǎn)運和積 累，隨著世代傳遞，病毒危害逐年加重，一 般造成減產(chǎn)50以上。研究發(fā)現(xiàn)，有30多種 病毒易感染馬鈴薯，并引起品種退化，嚴重 影響馬鈴薯的生產(chǎn)。通過微莖尖組織培養(yǎng)技 術(shù)能從馬鈴薯體內(nèi)脫除PVY、PVA、PAF、 PVG、PVM、PSW等病毒。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物脫毒快繁技 術(shù) 全國現(xiàn)有馬鈴薯播種面積300多萬公頃， 且有逐步增加的趨勢，每年需合格種薯45 億公斤，脫毒原種4億公斤，脫毒小薯或微 型薯4