SILAC定量技術方案教學文案

1、SILAC定量技術方案一樣品制備1. 細胞培養(yǎng)和蛋白提取(1) . MEM培養(yǎng)基的準備(配制400 mL) 制備氨基酸儲液：分別在 20mL L-Arginine缺陷型MEM 培養(yǎng)基 中配置 0.30mM(50%正常濃度)的 13C6 L-Arginine hydrochloride 和 13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride儲存液(均稱取26 mg),待充分溶解后，分別用0.22pm的無菌濾器 過濾。 分別加入20mL除菌后的氨基酸儲液、10%的透析胎牛血清、1%的青鏈 霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸鈉并用缺陷型 MEM培養(yǎng)基定容到 40

2、0 mL,貯存于 4C。每種完全培養(yǎng)基中的氨基酸濃度見表 4-1:表4-1 MEM培養(yǎng)基中輕、中、重 L-Arginine的濃度Cell li nesAmi no AcidsM. W.Culture MediaAmoun t(c oncen trati on)AL-Argi nine174.2RPMI 1640241.9 mg/L (1.15mM)B13C6 L-Argi nine216.7MEM65.0 mg/L (0.3mM)Cl3C6, 15N4 L-Argi nine220.7MEM65.0 mg/L (0.3mM)(2) .細胞培養(yǎng) 將A、B、C三種細胞復蘇后，分別接種于10cm培養(yǎng)

3、皿中，在 常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基(添加10%的透析胎牛血清和 1%的青鏈霉素)中培養(yǎng) HL-7702，分別使用僅含有 13C6 L-Arginine hydrochloride 和 13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)B和C，經(jīng)過5-6個細胞世代的培養(yǎng)后，將細 胞數(shù)量擴增到107-108左右(5-6盤)。(3) .蛋白提取用500卩全細胞裂解液(50 mM Tris，pH 7.4; 150mM NaCl; 1%Triton-100; 1mM AEBSF; 20 卩 l/ 卩 g apro；n20 p l/ 卩 g leupeptin)2

4、. 蛋白質(zhì)含量測定(1) .采用改進的Bradford法，將BSA分別稀釋為從0-1.40mg/ml范圍內(nèi)若干濃度，待測樣品稀釋10倍、20倍，各取20丄加80pL0.12M HCI，輕輕混勻。(2) .各管再加入3.5ml過濾的稀釋4倍的dye reage nt輕輕混勻，靜置5min后 測A595值。(3) .取A595值對BSA標準濃度作標準曲線，再根據(jù)待測樣品的 A595值，從 BSA標準曲線中確定其濃度。(4) . 同位素標記樣品與非標記樣品按照蛋白含量 1:1 混合。3. SDS-PAGE分離和染色(1) . 電泳條件： 4%濃縮膠， 12%分離膠 ;(2) . 2 SDIS上樣緩沖

5、液的配制：2mL Tris-HCL buffer (0.5M, pH 6.8) ; 2 mL甘 油；1mL巰基乙醇；4mL10%SDS溶液；適量水補足體積至10mL，混勻即得。(3) .電泳條件：4%濃縮膠，12%分離膠，先恒流10mA，運行時間0.5h，再 于20mA運行至溴酚藍前沿到達分離膠底部。(4) . 膠體考馬斯亮藍染色方法如下：用 10%甲醇， 7%乙酸溶液固定 30min， 然后用膠體考馬斯亮藍溶液 (0.12%G-250， 10%硫酸銨， 10%磷酸， 20%甲醇)染 色過夜，用蒸餾水或 10%甲醇水溶液脫色，清洗膠數(shù)遍即可獲得背景清晰的染色 效果。4. 膠內(nèi)酶解、肽段提取(1

6、) .用干凈的解剖刀將膠按照從高分子量到低分子量全覆蓋切成3-4mm寬度的膠條，大約切成20個條帶左右。然后將每個膠條切成 1-2mm2大小的膠塊。(2) . 100此50%乙腈/25 mmol/L碳酸氫氨浸泡膠粒，超聲10 min，棄去溶液， 重復 1-2 次至膠粒的藍色褪盡。(3) .真空離心干燥至膠粒完全脫水，加入 10-1510ng/此的胰蛋白酶 (25mmol/L碳酸氫銨溶解)，4C冰箱放置30-40min,吸走多余酶液或補充25mM 碳酸氫銨覆蓋膠粒， 37C 保溫 18-20小時。(4) . 80-100 d 5%TFA 40 C提取1h，期間超聲兩次，取出上清。80-100 d

7、2.5%TFA/50%ACN 30 C提取1h，期間超聲兩次，合并上清，離心干燥。二 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫檢索1. LC-LTQ-FT 分析1) .毛細管色譜系統(tǒng)在AgillentllOO系統(tǒng)上進行，由自動上樣器上樣，上樣體 積為30卩,1上樣流速為10卩l(xiāng)/min色譜洗脫在由二元泵系統(tǒng)上進行，洗脫下來的組份經(jīng)過ESI離子源直接進入質(zhì)譜，液相色譜條件為：流動相 A : 0.1%FA-98%水 溶液；流動相B： 0.1%FA-80%ACN溶液。洗脫條件：0-90min,流動相比例由2%B 線性升至40%B; 90-105min，流動相比例由40%B線性升至100%B；維持15 min 后，以100%

8、流動相A平衡色譜柱30min。流動相流速為300nL/min。2) . 質(zhì)譜儀為線性離子阱 -傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀 (LTQ-FT ， ThermoFinnigan)，磁場強度為7特斯拉。霧化N2氣流速(sheath gas)12 L/min；碰撞氣為高 純氬氣；噴霧電壓(spray voltage)為3.2kV;毛細管溫度(capillary temperature)為 160C;毛細管電壓(capillary voltage)為2.8kV。分析柱為 PicoFritTM 反相柱 (BioBasic C18, 5 pm, 75 pm i.d. x 10cm, 15pm i.d.spr

9、ay tip, New Objective, Woburn, MA, USA) 。一級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描模式 (Data Dependent MS/MS Scan)；依次選取一級質(zhì)譜中離子強度最強的 5個離子進行CID二級串聯(lián)質(zhì)譜。采 用串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除功能(dynamic exclusion)，設置排除時間為3min。離 子自動增益控制設置為：一級質(zhì)譜掃描為5X105個電荷，二級串聯(lián)質(zhì)譜為1X104個電荷。一級質(zhì)譜的在m/z為400處的分辨率為100000。離子傳輸毛細管溫度為 200C;從電噴霧電壓1.8KV。二級串聯(lián)質(zhì)譜母離子窗口為4Da,歸一化碰撞能量 為35%；質(zhì)譜的

10、一級全掃描質(zhì)荷比范圍是 4002000(Mass range， m/z 400-2000)。三數(shù)據(jù)庫檢索1. 應用DTA supercharge將raw文件轉(zhuǎn)成 mgf文件(1) . DTAsupercharge軟件可以從網(wǎng)上下載,http:/ 網(wǎng)站定期 有版本更新。(2) .安裝前需要安裝 Xcalibur, Bioworks，不同版本的 DTAsupercharge對 Xcalibur 的版本要求不同。安裝時若版本不符會有提示。安裝 Xcalibur 時要安裝 XDK 功 能，見下圖A. 還需要Microsoft .net Framework的支持（1.1或2.0,不同版本要求不同）B.

11、功能：把raw文件提出dta文件再合并成mgf文件。C. 界面如下：(3) .轉(zhuǎn)換單個raw文件：DTA processing標簽下，選擇raw文件。然后點“ Con ver菜單下的 “Start Con version”(4) .批量轉(zhuǎn)換：把指定文件夾下所有的raw文件進行轉(zhuǎn)換：automation菜單 下選擇 “set parameters for processing several raw file設定這些 raw 文件所在 的文件夾。然后點 process raw files in folder”這樣會把指定文件夾下所有的raw文件轉(zhuǎn)換成dta和mgf文件。2. Mascot 搜庫使

12、用Mascot檢索合并好的 mgf文件。設置檢索參數(shù)：(1) .所用數(shù)據(jù)庫；(2) .可變修飾設置為半胱氨酸烷基化修飾(+57.0214Da)，甲硫氨酸(Met)氧化(+15.99Da),13C6 L-Arginine 修飾(+6.02Da), 13C6,15N L-Arginine 修飾(+10.01Da)。 (即將SILAC同位素的修飾設置為可變修飾)(3) .最大胰酶漏切位點為1個，一級母離子誤差20ppm,二級碎片離子誤差0.8Da。(4) .將搜庫的網(wǎng)頁結果以peptide summary的方式保存。(5) .這樣每個mgf文件就得到1個html格式的搜庫結果。四數(shù)據(jù)定量分析1. M

13、ascot檢索后的肽段定量分析是由 MSQua nt完成。2. 軟件在,網(wǎng)站定期更新，可下載最新版本。3. 軟件安裝與datasupercharge樣，需要在裝Xcalibur時安裝XDK功能，還需 要 Microsoft .net Framework 的支持。4. 軟件在使用時，將raw文件與其相對應的Mascot搜索結果html文件相關聯(lián)(associated)5. MSQua nt定量軟件的參數(shù)設置主界面示意圖如下：肽段Mascot打分卡值蛋白Mascot打分卡值SILAC標記模式定量形式(一般用full scan定量)設置SILAC定量分析的參數(shù)：主要是設置肽段 mascot打分卡值；SILAC定量 標記同位素氨基酸模式；以及定量形式（定量形式一般米用full scan定量的 形式）。設置完定量參數(shù)后可以進行定量分析了。6. 定量分析主界面如下：肽段定量結果txiCmx料帖* whig i id fw*rihiFife Ww保留時間及峰強度定量質(zhì)譜圖Frhfi rhtapK49rntDiv HRe r i| ?： w，m IE：I212311 rifiFftirMbjji.il? nMiI fin *1-1H W重構色譜圖在定量軟件結果的基礎上需要作