基于順鉑抗癌藥物的合成及DNA鍵和性質(zhì)的研究

1、基于順鉑抗癌藥物的合成及基于順鉑抗癌藥物的合成及 dna 鍵合性質(zhì)的鍵合性質(zhì)的 研究研究 【摘要摘要】 癌癥是嚴重威脅人類健康和生命的常見病和多發(fā)病，已經(jīng)成為人類死亡的第二大病因。自 1967 年發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌活性以來，經(jīng)過 30 多年的發(fā)展，鉑類金屬抗癌藥物的合成應用和研究得到了迅速的發(fā)展。 與此同時，研究藥物和 dna 的相互作用是藥物發(fā)現(xiàn)和藥品研發(fā)過程中最重要的課題之一。g-四鏈體是富含鳥嘌 呤堿基的 dna 通過氫鍵相互作用形成的四鏈螺旋結構。這種結構可以有效的抑制端粒酶的活性，它可以阻礙端 粒酶對端粒 dna 引物的識別，使細胞正常凋亡，從而達到抗腫瘤的效果，近年來，以 g-四鏈體

2、為靶點的抗癌 藥物研究引起了人們的廣泛注意。本文的工作重點是合成配合物，通過紫外滴定和熒光滴定手段研究已有釕配 合物對 g-四鏈體穩(wěn)定性、dna 對金屬離子的特異性識別。 【關鍵詞關鍵詞】 鉑(ii)配合物，g-四鏈體，dna，釕(ii)配合物。 application of bjerrum function in determination of stability constants 【abstract】 cancer is a common and frequently-occurring diseases seriously threatening human health and l

3、ife, which has become the second largest human death cause. since cisplatin was found having anti-cancer activity in 1967, after 30 years of development, the synthetic applications and research of metal anti-cancer drugs of platinum obtained a rapid development. at the same time, the research of the

4、 reaction betwwen drugs and dna is one of the most inportant issues in the process of discovery and development of drugs. g-quadruplex is rich in guanine bases of dna which formed through the hydrogen bonding interaction of the formation of the four chain spiral structure. this structure can inhibit

5、 the telomerase activity effectively, hinder telomerase to telomere dna primers recognition, and make normal cell apoptosis, so as to achieve antitumor purpose. in recent years, the g-quadruplex target cancer drug research has attracted widespread attention. this paper is focused on the synthesis of

6、 complexes, using the ultraviolet titration and fluorescence titration method to study the stability of existing metal ruthenium complexes to g-quadruplex and dnas identification to the specificity of the metal ions. 【key words】pt(ii) complexes, g-quadruplex, dna, ru(ii) complexes 目錄 1 引言.3 1.1 基于順鉑

7、抗癌藥物的研究意義.3 1.2 金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展.3 1.3 核酸的組成與結構.3 1.3.1 概述 1.3.2 dna 結構 1.4 g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系 1.4.1 g-四鏈體 1.4.2 g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系 1.5 本文所作的工作.3 2 理論部分 .4 2.1 dna 與配合物作用的研究方法.4 2.2 各種生成函數(shù)法的測定原理.4 2.2.1 光譜學方法.4 2.2.2 流體力學方法 .4 2.2.3 密度泛函計算與分子模擬 .4 3 實驗部分 .5 3.1 引言.5 3.2 藥品和儀器.5 3.2.1 實驗試劑.5 3.2.2 實驗儀器.5 3

8、.3 配合物的合成及表征 .5 3.2.1 配體的合成 3.2.2 鉑配合物的合成 3.4 不同輔助配體的多吡啶配合物與 g-四鏈體 dna 的相互作用的研究 3.4.1 緩沖溶液的配制 3.4.2 配合物與 dna 濃度的確定 3.4.3. 配合物與 g-四鏈體相互作用的紫外可見光譜滴定 3.4.4 配合物與 g-四鏈體作用的熒光光譜滴定 4 結果和討論.6 4.1 釕配合物與 g 四鏈體電子吸收光譜研究.7 4.2 釕配合物對端粒 g-四鏈體的選擇識別研究.7 5 結論和展望.8 5.1 結論.8 5.2 展望.8 參考文獻.9 謝辭.10 1 引言引言 1.1 金屬抗癌藥物的發(fā)展金屬抗癌

9、藥物的發(fā)展 1965年rosenberg偶然發(fā)現(xiàn)順二氯二氨合鉑(cis-pt(nh3)2cl2，又稱順鉑)對大腸桿菌的分裂有 抑制作用，并于1969年首次報道了順鉑具有很強的抗癌活性。1975年順鉑成為第一個用于臨床 的金屬配合物抗癌藥物。從此以后，金屬藥物及其抗腫瘤機理成為人們關注的研究熱點。 但是順鉑水溶性差，且僅能注射給藥，緩解期短，并伴有嚴重的腎、胃腸道毒性、耳毒性及 神經(jīng)毒性，長期使用會產(chǎn)生耐藥性。為此，人們開始展開對其它鉑系抗腫瘤藥物的研究，但結 果并不理想。 鉑系抗腫瘤藥物在臨床使用上具有毒副作用大以及耐藥性的問題，促使研究者積極尋找非 鉑系抗腫瘤藥物。目前非鉑系金屬抗腫瘤藥物研

10、究主要集中在釕、銠、錫、鍺等金屬配合物， 特別是釕配合物。作為鉑類配合物的對照物，釕配合物很早就被運用于抗腫瘤實驗。與順鉑相 較，釕配合物毒性相對較小，在生物體內(nèi)易于吸收，也易于代謝而且釕配合物有在腫瘤組織中 發(fā)生聚集的特點，能夠與dna 分子以共價鍵或者非共價鍵(靜電結合、溝面結合和插入結合)方 式締合。 從上世紀八十年代以來，釕配合物作為抗腫瘤藥物的研究已經(jīng)成為藥物化學、化學生物學、 配位化學以及生物無機化學的熱點研究領域之一。 1.2 金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展 自1967年美國密執(zhí)安州立大學教授rosenberg b.和camp v.發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌活性以來，經(jīng) 過30多

11、年的發(fā)展，鉑類金屬抗癌藥物的合成應用和研究得到了迅速的發(fā)展。順鉑、卡鉑的開發(fā) 成功和臨床應用給癌癥的治療帶來了一場新的革命。 有數(shù)據(jù)表明，dna鏈中許多相鄰的堿基間兩個氮原子距離為340 pm，而順鉑中兩個氯原子 間的距離為330 pm，兩者恰好匹配，形成的鉑化dna壽命較長且不易被細胞蛋白如高移動組 (hmg)蛋白識別并修復，因而將破壞腫瘤細胞dna的復制，抑制細胞分裂，最終殺死腫瘤細胞。 現(xiàn)在，順鉑和其他鉑化合物已顯示出它與病毒、細菌、寄生菌作斗爭的潛力。除此此外， 鉑化合物也有希望用來診斷一些疾病。自從順鉑的抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來，鉑類抗癌藥物的研究 和應用得到了迅猛的發(fā)展。如今，順鉑和卡鉑

12、已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。1995年，世 界衛(wèi)生組織對世界上近百種抗癌藥物進行評價，順鉑的療效、市場等綜合評價得分名列前茅。 順鉑和卡鉑所獲得的成就極大地鼓舞了各國學者積極研究更好、更有效的鉑類抗癌新藥。 目前鉑類配合物的合成已歷經(jīng)三代。 順鉑是第一代鉑類抗癌藥物（結構如圖1.1所示），該藥的使用局限性是它的耐藥性及劑量 毒性人體器官尤其是對腎臟的損害較大。第二代鉑類配合物（結構如圖1.2所示），其中以卡鉑 為代表（結構如圖1.2所示），其水溶性優(yōu)于順鉑，腎毒性低于順鉑，主要不良反應為骨髓抑制。 第三代鉑類代表化合物樂鉑（結構如圖1.3所示），樂鉑全稱是環(huán)丁烷乳酸鹽二甲胺合鉑()， 研究

13、表明，該藥的抗腫瘤效果與順鉑、卡鉑的作用相當或者更好，毒性作用與卡鉑相同， 且與 順鉑無交叉耐藥。 圖圖1.1 第一代主要鉑類抗癌藥物的結構第一代主要鉑類抗癌藥物的結構 圖圖1.2 第二代主要鉑類抗癌藥物的結構第二代主要鉑類抗癌藥物的結構 圖圖1.3 第三代鉑類抗癌藥物結構第三代鉑類抗癌藥物結構 目前鉑類配合物研究的方向是:尋找比順鉑和卡鉑療效更好，不良反應更小，藥學特性得到 改善的化合物、擴大抗癌譜、開發(fā)與順鉑和卡鉑無交叉耐藥性的新型藥物。 1.3 核酸的組成與結構核酸的組成與結構 1.3.1 概述概述 構成生命物質(zhì)的兩類主要大分子是蛋白質(zhì)和核酸。核酸是由許多核苷酸聚合而成的生物大 分子化合

14、物，廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)，與蛋白質(zhì)構成生命物質(zhì)的兩類主要 的大分子。生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結合形成核蛋白。核酸是生物體的重要組成物質(zhì)，在蛋白 質(zhì)的生物合成上占重要位置，與生物的生長、發(fā)育等正常生命活動以及癌變、突變等異常生命 活動中起決定性的作用。因此，核酸是現(xiàn)代生物化學、分子生物學和醫(yī)學的重要基礎之一。 衰老和癌變是人類的兩大醫(yī)學難題，二者與端粒和端粒酶有密切關系。端粒是真核細胞染 色體末端富含鳥嘌呤的 dna 重復序列及一些結合蛋白組成的特殊結構。端粒除了提供非轉錄 dna 的緩沖物之外，還能保護染色體末端免于融合和退化，在染色體定位、復制、保護和控制 細胞生長及壽命方面

15、具有重要作用，并與細胞凋亡、細胞轉化和永生密切相關。在生理狀況下， 隨著細胞分裂次數(shù)增加，端粒在復制分裂過程中將逐漸丟失堿基，從而使端粒漸進性縮短。當 端?？s短至一定長度時細胞將進入生長停止衰老死亡階段，即出現(xiàn)細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，端 粒酶能保證端麗的正常復制。除了胚胎組織、生殖細胞和少數(shù)造血肝細胞中具有端粒酶火星外， 絕大多數(shù)體細胞中無端粒酶活性，但是，85%以上的腫瘤細胞端粒酶表達呈陽性。因此，以抑制 端粒酶活性為目標的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作用靶點，而且極有希望成為最安 全、有效的治療腫瘤的理想途徑。 核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物。單個核苷酸是由堿基、戊糖和磷酸三部分構成的。

16、根據(jù) 所含戊糖的差異，核酸可分為脫氧核糖核酸（dna）和核糖核酸（rna）兩大類。核苷酸中的 堿基分為嘌呤和嘧啶兩類。dna 主要由含腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的核 苷酸構成。rna 主要由含腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的核苷酸構成。 1.3.2 dna 結構結構 dna 之所以能含有生物物種的所有遺傳信息，是因為其結構非常復雜，每個人體細胞的 dna 約含有 100 億個堿基。dna 分子的結構，有以下三種： 第一，dna 的一級結構。四種脫氧核糖核酸按照一定的順序，通過 3-5-磷酸二酯鍵連結， 由一個核苷酸的戊糖環(huán)第 3位羥基與另一

17、個核苷酸的戊糖環(huán)第 5位的磷酸以酯鍵相連，具有一 定的方向性。堿基間遵循堿基互補配對原則，即腺嘌呤(a)一定與胸腺嘧啶(t)配對，鳥嘌呤(g) 一定與胞嘧啶(c)配對。（如圖 1-4）因為它是指組成核酸的核苷酸之間連鍵的性質(zhì)和排列的順 序，所以 dna 的一級結構也被稱為 dna 堿基序列。 圖圖 1-4 核酸一級結構模型核酸一級結構模型 第二，dna的二級結構。它是指磷酸和堿基按照一定順序排列時，由于扭轉角度和各種堿 基排列方式不同而產(chǎn)生各種各樣構型的dna。dna雙螺旋結構是dna二級結構的一種重要形式， 它是指兩條脫氧多核苷酸鏈反向平行盤繞所形成的雙螺旋結構。由watson和crick兩

18、位科學家于 1953年提出來的一種結構模型。在不同濕度和鹽濃度下，dna的雙螺旋有著不同的構象。dna 的二級結構分為兩大類：一類是右手螺旋，如a-dna、b-dna、c-dna、d-dna等；另一類是 左手雙螺旋，如z-dna。雙鏈dna 的構象與其核苷酸序列和堿基組成有密切關系。一般地，含 隨機的堿基組成和序列的dna雙螺旋分子通常只能形成a、b、c 構型；但嚴重重復的寡聚核苷 酸則可形成其它的構型，如d、e、z 和p 構型。改變一定的外界環(huán)境條件，如溫度、相對濕度、 鹽的濃度以及有機溶劑等可以使這些構型進行相互的轉化，并且這些轉變從本質(zhì)上都是改變核 酸分子的內(nèi)在運動來實現(xiàn)的。 圖圖 1-

19、5 a-dna、b-dna 和和 z-dna 第三，dna的三級結構。它是指dna中單鏈與雙鏈、雙鏈之間的相互作用形成的三鏈或四 鏈結構，由dna雙螺旋進一步扭曲，包括線狀雙鏈中間可能有的扭結和超螺旋、多重螺旋及環(huán) 狀dna中諸如超螺旋和連環(huán)之類的各種拓撲學狀態(tài)。在雙螺旋dna的大溝中存在多余的氫鍵給 體和受體，這些氫鍵給體和受體可以和專一的結合分子(如蛋白質(zhì))發(fā)生相互作用，形成專一的復 合物，也可以與單鏈dna分子結合形成三螺旋dna。三螺旋dna一般是由一條寡核苷酸鏈通過 與雙鏈dna形成hoogsteen 鍵或反hoogsteen 鍵，在其大溝處緊密纏繞而成。三螺旋dna 的組 成結構基

20、元是三堿基體，這些堿基體也具有專一性，具體體現(xiàn)在t、c、g、a 分別要接在 at、gc、gc 和at 堿基對上（見圖1-6） 。形成三螺旋dna的第三條鏈的抗酶括性、水溶性、 脂溶性和毒副作用等因素直接影響其作為治療藥物的可能性。因而合成能抗核酸酶能力強、水 溶性和脂溶性適當、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋dna穩(wěn)定性的主鏈修飾方法仍 是目前的研究熱點。 圖圖 1-6 三螺旋三螺旋 dna 結構結構 1.4 g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系 1.4.1 g-g-四鏈體四鏈體 g-四鏈體（g-quadruplex）是一類特殊的dna二級結構，在基因組中

21、的一些鳥嘌呤富集區(qū)域， 具有形成這一特殊結構的傾向。這些區(qū)域包括端粒末端g重復序列，以及一些重要基因的啟動子 區(qū)域，因此g-四鏈體的形成或拆散可能涉及到體內(nèi)的一些重要生理過程的調(diào)控，比如細胞凋亡、 細胞增殖、信號轉導和腫瘤形成等。此外，g-四鏈體結構作為一種特殊的dna二級結構，與普 通雙鏈具有顯著的結構差異，可以成為藥物選擇性識別的靶點。因此，研發(fā)與g-四鏈體相互作 用的小分子抗癌藥物受到了廣泛的關注。 四鏈體結構是由富含g dna單鏈，在特定離子強度和ph值條件下，由單鏈之間或單鏈內(nèi)對 應的g殘基形成hoogsteen堿基配對，從而使四條或四段富g dna單鏈旋聚成一段特殊的dna二 級結

22、構。由于富g dna中的g殘基都是成串排列的，因此，當四條或四段富g單鏈dna的g殘基 并肩形成hoogsteen堿基配對時，就形成了一個由4個g殘基的雜環(huán)平面聯(lián)合形成的g-quartet平面。 在4條鏈中相應的的g之間形成的四分體平面層層堆疊，就形成一段極其穩(wěn)定的四鏈體dna結構 （見圖1-7） 。由于這段四鏈體是以g殘基為主形成的，故稱為g-quadruplex。其中每個g堿基既是 氫鍵的受體，又是氫鍵的給體，他們在結構上是等價的。在兩個相鄰的四堿基體的中央會形成 一個空腔，空腔內(nèi)有負電性的羰基氧存在，使得此處易于結合陽離子。四鏈體四鏈體之間通過- 作用相互堆積結合在一起。g-quadru

23、plex特殊結構使得它能夠成為特異性的dna靶點。 nn n n r hnh h o n n n n r h n h h o n n n n r h n h h o nn n n r hnh h o 圖圖 1-7 g-quadruplex 結構結構 大量研究表明含不同 g 序列所形成的四螺旋結構是不同的，即使是相同的序列也可以按不 同的方式進行組裝。g-四鏈體 dna 可以通過單鏈，雙鏈以及四鏈形成三種不同的四螺旋結構， 每種結構又有多種異構體（見圖 1-8）。大量研究表明含不同 g 序列所形成的四螺旋結構是不 同的，即使是相同的序列也可以按不同的方式進行組裝?，F(xiàn)在普遍認為通過控制適當?shù)臈l件，

24、 如溫度、dna 濃度、緩沖液中的 na+和 k+的濃度等可以改變 g-四鏈體的構型。 圖圖 1.8 幾種典型的幾種典型的 g-四鏈體結構四鏈體結構 a：分子間四聚體結構：分子間四聚體結構(平行平行)；b：分子間二聚體鄰位發(fā)夾型結構：分子間二聚體鄰位發(fā)夾型結構(反平行反平行)；c：分子內(nèi)椅狀結構：分子內(nèi)椅狀結構(反平行反平行)；d：分：分 子內(nèi)藍狀結構子內(nèi)藍狀結構(反平行反平行)；e：分子內(nèi)螺旋槳狀結構：分子內(nèi)螺旋槳狀結構(平行平行)；f：分子內(nèi)混合型結構：分子內(nèi)混合型結構 1.4.2 g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系 端粒是由高度重復序列的端粒dna 和端

25、粒結合蛋白組成的復合物。20世紀三四十年代， hermann muller 和barbara mcclintock 同時提出了端粒的概念。它是染色體末端的一種特殊結 構，能防止染色體dna 降解、末端融合、缺失及非正常重組維持染色體的完整和穩(wěn)定，并保證 細胞正常分化。端粒的主體是雙螺旋結構，富gt鏈與富ca鏈配對，但3末端突出為一段單鏈懸 掛。由于缺乏模板的引導，染色體合成過程中傳統(tǒng)的dna聚合酶就無法完全合成這個末端懸掛， 從而造成端?？s短，這就是所謂的“末端復制問題” 。 端粒是真核細胞染色體末端的一種特殊的核蛋白復合體，由高度重復序列的端粒 dna 和端粒 結合蛋白組成17。不同物種的端

26、粒dna序列存在差異，但都以富含鳥嘌呤(g)的重復序列為特征。 人的端粒約有15 kb 反復串聯(lián)的ttaggg 構成的，并且以50-200bp次分裂進行縮短，主要組 成部分為5-15 kb 長的雙鏈dna 和3末端100-200 bp 長的g-單鏈懸垂(g-overhang)dna。端粒 的主體是雙螺旋結構，富gt 鏈與富ca 鏈配對，但3末端突出為一段單鏈懸掛。這段單鏈在 名為shelterin18/telosome19的蛋白結構催化下折回到端粒內(nèi)部雙鏈，并將該端區(qū)域的一段自身 鏈置換出來，取而代之與互補鏈配對，形成t-loop (telomere loop)結構，而3末端單鏈被“包埋” 在

27、t-loop中，端粒末端便形成了一個與外界隔絕的閉合結構。正是由于這個閉合結構，端粒顯現(xiàn) 出了對于染色體的穩(wěn)定及其基因組的完整非常重要的作用，它為染色體末端提供保護性，防止 染色體互相融合、重組及一些外切酶、連接酶的作用，防止dna的損傷，并計數(shù)在線性dna復 制時出現(xiàn)的末端dna片斷的丟失。同時，這種結構也使端粒酶不可能持續(xù)與端粒3末端單鏈發(fā) 生作用，從而保證了端粒長度的恒定。 圖圖 1.9 左圖為人染色體末端的端粒左圖為人染色體末端的端粒 dna；右圖為人端粒結構示意圖；右圖為人端粒結構示意圖 正常細胞的端粒隨著細胞分裂進行性縮短，在每一次的復制循環(huán)中端粒都要減少50-100個堿 基對，細

28、胞在進行大約50次分裂后就開始衰亡。端粒的長短在細胞癌變和衰老中起著重要作用。 而端粒的長短可由端粒酶調(diào)節(jié)。1985 年greider 和blackburn 首次從四膜蟲細胞提取液合成端粒 的實驗中，發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性并同時證實了端粒酶具有維持端粒長度的作用。端粒酶是一種核 酸蛋白質(zhì)復合物，它能以自身rna為模板，將真核生物染色體末端端粒dna加以延伸的酶，所 以它又被稱為特化rna依賴性dna聚合酶、反轉錄酶、端粒末端轉移酶。端粒酶由三個部分組 成，包括端粒酶rna(htr)，逆轉錄酶催化亞基(htert)和端粒酶其它聚合蛋白(tep1)2，端粒 酶的生物功能是合成染色體末端的端粒，是一種依賴

29、于rna 的特殊的dna 聚合酶，屬于逆轉 錄酶類型。在胚胎發(fā)育期，端粒酶的活性很高，而在成熟體細胞中端粒酶的活性則會被關閉， 以此來調(diào)控細胞的生長、分化和衰老。但是在大部分腫瘤細胞(85)中，端粒酶則表現(xiàn)出了很 高的活性，而在癌周圍組織和正常組織中端粒酶幾乎是沒有活性的。在正常的體細胞中，端粒 酶的活性得到抑制，所以細胞每分裂一次，端粒就會縮短一些，當達到一個臨界長度時，細胞 染色體就會失去穩(wěn)定性，然后細胞將發(fā)生衰亡和凋亡。而在腫瘤細胞中，端粒酶的活性被激活， 使得它可以維持端粒的長度，從而維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖和生長，因此這個細胞不能進入 正常的老化和衰亡，從而獲得一種永生性。由此說明端

30、粒酶與細胞的惡性轉化及維持分裂增殖 具有密切的關系。因此，以抑制端粒酶活性為目標的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作 用靶點，而且極有希望成為最安全、有效的治療腫瘤的理想途徑。 端粒酶抑制劑的研究主要針對其不同的組分及不同的結構，由于 g-四螺旋能阻斷 rna 聚 合酶，因此當基因密碼區(qū)的富含 g 重復序列形成 g-四螺旋而又不易解聚時，會起到抑制 rna 聚合酶的作用，從而引起早期轉錄的停止。靶向端粒酶集中在以下三個方面：第一個方面以端 粒酶 rna 為靶點，第二個方面是抑制端粒酶逆轉錄酶活性，第三個方面是 g-四鏈體的穩(wěn)定劑， 第四個方面是開發(fā)端粒酶抑制劑的新靶點。g-四螺旋結構的穩(wěn)定劑

31、或 g-四螺旋形成誘導劑的優(yōu) 勢在于 g-四螺旋結構具有特異性，故具備更強的選擇性，從而大大降低了傳統(tǒng)化療藥物的毒性。 由此，以 g-quadruplex 為靶點來尋求能夠誘導、穩(wěn)定或識別四鏈體結構的小分子是當前研究開 發(fā)抗腫瘤藥物重要途徑之一。 綜合以上所述，g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系可以歸結為下面這個流程圖。 圖圖 1.10 g-四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系示意圖四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關系示意圖 1.5 本文所做的工作本文所做的工作 本文將合成一種順鉑配合物，用熒光光譜、紫外光譜觀察金屬配合物與dna的g-四鏈體的 鍵合作用及性質(zhì)。 主要做了以下工作： （1）合成配體

32、dpq-df。 （2）合成鉑配合物 （3）對所合成的配合物進行核磁與質(zhì)譜檢測。 （4）用熒光光譜、紫外光譜觀察兩種不同輔助配體的釕配合物與 dna 的 g-四鏈體的鍵合 作用及性質(zhì)。 2 理論部分理論部分 2.1 配合物與配合物與 dna 作用的基本形式作用的基本形式 作用于g-四鏈體的小分子配體是通過識別和穩(wěn)定g-四鏈體而抑制端粒酶活性的，研究表明， 小分子配體和不同結構的g-四鏈體結合模式不同。分子模擬顯示，配體可以非共價鍵結合形式 堆積在末端g四分體上，結合在溝上、環(huán)上或插入兩個g四分體平面之間。據(jù)文獻報道，小分子 配體與g-四鏈體的作用模式主要有兩種:外部堆積模式和插入模式(如圖2-1

33、所示)。 1) 外部堆積模式。即小分子配體和 g-quadruplex 的末端 g-四鏈體形成共軛結構； 2) 插入模式。即小分子配體插入到兩個 g-四鏈體之間； 3) 非特異結合模式。通過氫鍵和靜電作用于溝槽、loop 上。 由于溶液中小分子配體g-四鏈體之間的結合處于動態(tài)平衡狀態(tài)，導致nmr圖譜很難解析， 因此，關于復合物的nmr結構數(shù)據(jù)非常缺乏，給研究小分子配體的結合模式帶來了困難?？偟?來說，插入模式由于只有一部分堿基和配體結合，易失衡，從而導致整個g-quadruplex結構的分 解。外部堆積模式來有許多結構特點來維持整個分子能量穩(wěn)定，末端g-四分體更容易與配體形 成共軛結構，結合位

34、點較易識別，動力學穩(wěn)定， 化合物的作用模式更傾向于外部堆積模式。 圖圖 2-1 小分子與小分子與 g-四鏈體的作用模式四鏈體的作用模式 (a)外部堆積模式外部堆積模式(b)插入模式插入模式(c)非特異性結合非特異性結合 2.2 dna 與配合物作用的研究方法與配合物作用的研究方法 2.2.1 光譜學方法光譜學方法 2.2.1.1 紫外紫外- -可見光譜或電子光譜可見光譜或電子光譜 由于比較靈敏、直觀、方便，它是研究金屬配合物與dna作用最常用的方法之一。一般來 說，dna加入金屬配合物后，會對配合物的光、氧化還原等化學物理性質(zhì)產(chǎn)生影響，通過研究 dna加入前后配合物性質(zhì)的變化可對配合物與dna

35、的相互作用進行初步研究。吸收光譜是研究 配合物與dna 相互作用比較直接的一種方法。配合物與dna 結合后，使合物所處的環(huán)境發(fā)生 改變，吸收光譜波長和吸收強度發(fā)生變化，配合物與dna 作用方式不同，則波長和吸收強度變 化不同。依據(jù)電子躍遷的機制，可將配合物的電子吸收光譜分為三種類型： 1）以金離子mn+為中心的d-d 躍遷所產(chǎn)生的配位躍遷光譜； 2）配體至金屬或金屬離子（lmct）或金屬離子至配體（mlct）的電荷遷移光譜，簡稱 荷移光譜； 3）以配體l 為中心的配體間的電子轉移光譜（il） 。其中金屬離子向配體的電子躍遷發(fā)生 在金屬離子具有充滿的或接近充滿的t2g 軌道，而配體具有最低空軌道

36、的配合物中。 核酸分子由于其嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵體系，所以在紫外區(qū)260-290 nm 處有特征的 吸收，這種吸收隨分子中各堿基的種類、所占比例以及堿基間的堆積方式等的改變而有所不同。 一般來說，結構越有序，吸收值越低。因此，我們可利用紫外吸收光譜對上述各核酸分子結構 的形成進行初步判斷。當配合物插入到dna 堿基對時，對應的吸收峰產(chǎn)生明顯的減色效應，并 伴有一定程度的紅移。 2.2.1.2 熒光光譜熒光光譜 熒光光譜法是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。熒光物質(zhì)在激發(fā)光的激發(fā)下，由基 態(tài)躍遷到較高的能級(激發(fā)態(tài))后，首先通過內(nèi)轉換過程消耗一部分能量，回到第一電子激發(fā)態(tài)的 最低振動能級

37、，同時以光量子的形式發(fā)射能量，即為熒光。配合物以插入方式與 dna 作用后， 由于它的振動模式受到抑制，或免受水分子的淬滅，配合物受到了 dna 堿基疏水環(huán)境的保護， 其發(fā)光強度一般會增強。并根據(jù)強度的變化來判斷與 dna 作用的強弱。 2.2.1.3 圓二色譜及圓二色譜及 dna 解旋技術解旋技術 圓二色譜可以檢測有無旋光物質(zhì)的存在51，52，或比較左、右旋物質(zhì)的混合物中哪種含量更 多，測定透析后的配合物的 cd 光譜，還可幫助確定配合物與 dna 的相互作用有無異構選擇性。 g-四鏈體或 i-motif 結構在圓二色譜中有著特殊的峰結構：平行型 g-四鏈體在 265nm 附近有正 的最大吸

38、收峰，240nm 附近有負的最大吸收峰；反平行型的 g-四鏈體在 295nm 附近有最大正吸 收峰，260nm 有最大負吸收峰；混合式的 g-四鏈體構型則包括了 290nm 附近的正吸收以及特 征的 265nm 附近的肩峰。加入配合物后，會使其吸收峰發(fā)生移動并改變其強度，明顯影響 g-四 鏈體的 cd 光譜。這樣的一種現(xiàn)象便有了一定的選擇性變化，更容易區(qū)分 g-四鏈體的構型轉化， 反應配合物和 dna 的結合模式。又由于 cd 光譜法靈敏度高，樣品在很低的濃度下就可以檢測 到特征吸收，圓二色譜成為一個很有效的檢測手段。 利用圓二色譜儀同時可以做熱變性的實驗。dna 的變性指 dna 分子由穩(wěn)定

39、的雙螺旋結構 松解為無規(guī)則線性結構的現(xiàn)象。核酸由多鏈結構(雙螺旋或四螺旋)變?yōu)閱捂溄Y構的中點溫度反應 了該結構的穩(wěn)定性，該溫度的變化也反應了結構穩(wěn)定性的變化。配合物與 dna 作用方式不同， 則 dna 熔化溫度(tm)變化程度就不同。當配合物與 dna 以插入方式作用時，dna 熔化溫度 (tm)變化最大。 2.2.1.4 其他光譜法其他光譜法 線二色譜(ld)和電二色譜(ed)：線二色譜和電二色譜都是采用與固定光軸方向(在流動梯度 體系中旋轉和外加電場，使 dna 螺旋軸取向固定)平行或垂直的平面偏振光，測量結合 dna 后 的配合物對垂直和平行于 dna 的線偏振光的不同吸收。 瞬時共振

40、拉曼光譜：可以探測微環(huán)境的變化對配合物激發(fā)態(tài)的性質(zhì)或行為的影響，從而可 以用來研究配合物與 dna 的作用機理。 2.2.2 流體力學方法流體力學方法 應用流體力學技術測試 dna 雙螺旋長度變化。在確定小分子化合物與 dna 作用模式方面， 流體力學方法(如粘度53，沉降速度及在凝膠中的泳動速度等)有其獨特的應用。 2.2.3 密度泛函計算與分子模擬密度泛函計算與分子模擬 密度泛函理論能夠很好地考慮到體系中電子的相對能量，特別適合于單線態(tài)金屬配合物的 計算。由于密度泛函方法考慮了電子相關，計算速度快，并且能有效地估算配合物的分子結構、 電子結構及其與 dna 相互作用的前線分子軌道，引起了理

41、論化學家的注意。密度泛函理論的計 算對于科學家們設計新的功能獨特的配合物有著重要的理論指導意義。 此外，還有 ph 滴定、熱力學方法和電化學方法等，不過這些方法在研究小分子化合物與 dna 鍵合機理方面不太常用。 3 實驗部分實驗部分 3.1 引言引言 本章介紹了鉑多吡啶配合物的合成步驟，及其配合物的表征。在表征過程中特別是質(zhì)譜方 面上，有些系列的配合物均與應得的分子量有偏差，說明反應過程中可能發(fā)生了其他的副反應， 所以實驗步驟還有待探索?，F(xiàn)列出實驗步驟，以供參考、指正，預防此后的科研出現(xiàn)不必要的 重復工作。 本文設計合成得出了鉑配合物(ptap)pt(en)(pf6)2，通過核磁、質(zhì)譜表征方

42、法證明為此種配 合物。 3.2 藥品和儀器藥品和儀器 3.1.1 實驗試劑實驗試劑 試劑名稱純度級別生產(chǎn)廠家或提供商 1，10-鄰菲咯啉 ar國藥 鹽酸羥胺ar國藥 甲醇ar國藥 氯仿ar國藥 鈀碳催化劑 ar國藥 丙酮ar國藥 乙醇 ar國藥 氫氧化鉀ar國藥 濃硫酸 ar國藥 石油醚ar國藥 氫氧化鈉 ar國藥 二甲基甲酰胺ar國藥 乙二醇ar國藥 四氯合鉑（）酸鉀ar國藥 乙二胺ar國藥 乙二醇ar國藥 六氟磷酸銨98%阿拉丁 乙醚ar國藥 氯化鉀ar國藥 氯化鈉ar國藥 tris 堿ar國藥 3.1.2 實驗儀器實驗儀器 核磁共振波譜 brucker 400m 核磁共振波譜儀記錄； 電

43、噴霧質(zhì)譜（es-ms）用 lcms-2010a 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀； 高純水用 sz97 自動三重蒸餾水發(fā)生器獲得； 電子吸收光譜用 lambda bio 40 紫外分光光度計測量； 熒光光譜用 hitachi fp7000 熒光光度計測量。 3.2 配合物的合成及表征配合物的合成及表征 3.2.1 配體的合成配體的合成 1）5-硝基鄰菲羅啉的合成 n n n n 150，reflux h2so4hno3 no2 molecular weight: 180.21molecular weight: 225.20 稱取鄰菲羅啉 5g 置于 100ml 圓底燒瓶，加入 30ml 濃硫酸，緩慢升溫

44、至 150，再逐滴加 入 15ml 濃硝酸，反應物繼續(xù)回流 3 小時后停止反應，冷卻至室溫，將反應混合液傾入含 500g 冰的燒杯中，用事先配制好的 naoh 溶液（50g naoh 溶于 200ml 左右蒸餾水）調(diào)節(jié)反應液的 ph 值至接近中性（ph5） 。抽濾得淺黃色固體，用冰水洗滌三次以上，所得產(chǎn)物在 50干燥后 備用。產(chǎn)率 87%。 2）5-氨基-6-硝基鄰菲羅啉 n n no2 nh2ohhcl koh(etoh) n n no2 nh2 molecular weight: 225.20 molecular weight: 240.22 將 4g（17.8mmol）5-硝基-6-氨基

45、鄰菲羅啉溶于 100ml 無水乙醇并加熱回流，待反應物全溶 之后加入 8g（118.9mmol）鹽酸羥胺，此時析出淺黃色懸浮固體，并在 45 分鐘之內(nèi)，往上述混 合液中滴加 koh 的乙醇溶液（9g koh 溶于 100ml 無水乙醇） ，反應混合物逐漸變?yōu)樽攸S色。 繼續(xù)回流 30 分鐘后停止反應，冷卻至室溫后，將反應液倒入 300-600ml 冰水中，靜置一夜后抽 濾，濾餅分別用水、甲醇和氯仿洗滌后干燥，得產(chǎn)物 1.6g 產(chǎn)率 35%。 3）5，6-二氨基鄰菲羅啉 n n no2 nh2 n2h4h2o pd/c n n nh2 nh2 molecular weight: 240.22mol

46、ecular weight: 210.23 將 0.4g 5-硝基-6-氨基鄰菲羅啉溶于 400ml 無水乙醇，加熱回流至全溶，再加 0.2g pd/c 催 化劑（10% pd）攪拌混合均勻，并在 15min 之內(nèi)逐滴加入 4ml 水合肼（80%） 。繼續(xù)回流 1 小 時后停止反應，趁熱過濾，旋蒸濃縮濾液，再加入過量的石油醚后析出黃色固體，抽濾后用石 油醚洗滌濾餅 真空干燥。產(chǎn)率 68%。 4）雙呋喃基 dpq-df 的合成 n n nh2 nh2 o o o o n nn n o o chemical formula: c22h12n4o2 molecular weight: 364.36

47、chemical formula: c12h10n4 molecular weight: 210.23 chemical formula: c10h6o4 molecular weight: 190.15 dmf 140 2d 5，6-二氨基-1，10-鄰菲羅啉（0.25g，1.2mmol） ，2，2-雙呋喃二酮（0.23g，1.2mmol） ，溶 于 20mldmf 置于 100ml 三頸瓶中，在氮氣保護下回流 2 天。反應結束后，冷卻抽濾，所得固 體用溫甲醇洗滌，干燥，產(chǎn)物黃綠色絮狀固體，凈重 0.25g，產(chǎn)率 57%。 3.2.2 鉑配合物的合成鉑配合物的合成 對于鉑配合物的合成，設計了

48、如下一種，并對其進行了合成。因時間關系，沒有對其進行 再次的純化。 1)(dpq-df)ptcl2的合成 將 dpq-df0.1822g(0.5mmol)加入一圓底燒瓶中，向其中加入 35ml 乙二醇加熱近沸，全部溶 解后，緩緩加入用 5ml 高純水溶解的 0.2090g(0.5mmol)的 k2ptcl4(梅紅色晶體)，130oc 加熱回流 6 小時，出現(xiàn)紅棕色沉淀。將其自然冷卻至室溫，避光放置過夜。過濾，用水洗滌，去掉未反應 的 k2ptcl4，然后用少量乙醇、乙醚洗滌并進行干燥。最后得紅棕色粉末固體 0.2432g，產(chǎn)率： 77.15%。 2)(dpq-df)pt(en)(pf6)2的合

49、成 將乙二胺 240l 加入混有 20ml 乙二醇和 0.2400g (dpq-df)ptcl2 的圓底燒瓶中，加熱 100oc 回流 3h，未全部溶解。待反應完成后，加少量水稀釋，過濾出不溶物(為反應的配體)，向濾液中加入 nh4pf6飽和溶液，產(chǎn)生沉淀，靜置一夜后，用慢速濾紙(因沉淀顆粒太小)兩層進行過濾。用乙 醇、乙醚洗滌干燥，得到咖啡色固體 0.2804g，產(chǎn)率 81%。 3)(dpq-df)pt(en)(pf6)2的表征 圖圖 3-1 (dpq-df)pt(en)(pf6)2的的 1h nmr 譜 譜 圖圖 4.2 (ptap)pt(en)(pf6)2的質(zhì)譜示意圖的質(zhì)譜示意圖 3.3

50、 不同輔助配體的多吡啶配合物與不同輔助配體的多吡啶配合物與 g-四鏈體四鏈體 dna 的相互作用的研究的相互作用的研究 3.3.1 緩沖溶液的配制緩沖溶液的配制 緩沖溶液用高純水配制 緩沖溶液 1：100mm kcl，10mm tris，ph=7 緩沖溶液 2：100mm nacl，10mm tris，ph=7 3.3.2 配合物與配合物與 dna 濃度的確定濃度的確定 3.3.2.1 配合物濃度的確定配合物濃度的確定 配合物 1：ru(bpy)2(dpqdf)2+ 配合物 2：ru(phen)2(dpqdf)2+ 稱取一定質(zhì)量配合物分別用高純水和緩沖液 1、2、3、4 溶解 3.3.2.2

51、dna 的處理和濃度確定的處理和濃度確定 1）富 g 單鏈 dna 取一定質(zhì)量富 g 單鏈 dna，溶于高純水，放入 4冰箱保持 24h，備用。 濃度確定：用紫外分光光度計測量 dna 在 260nm 的吸光度值 a260。摩爾消光系數(shù)為 2.285105m3cm-1，dna 濃度dna=ka260/2.285105（k 是稀釋倍數(shù)） ，單位是 moll-1。 2）富 g 四螺旋 dna 取兩份一定質(zhì)量富 g 單鏈 dna（核苷酸序列為 5 - agggttagggttagggttaggg - 3） ， 分別溶于緩沖液 1 及緩沖溶液 2 中，緩沖溶液 476ul，密封加熱到 90，并保持 5

52、 分鐘。然后 自然冷卻到室溫，放入 4冰箱中保持 24 小時，備用。 濃度確定：用紫外分光光度計測量 dna 在 260nm 的吸光度值 a260。摩爾消光系數(shù)為 2.285105m3cm-1，取 dna50ul，再加入 4950 的緩沖液，稀釋倍數(shù)為 100 倍，dna 濃度dna =ka260/2.285105（k 是稀釋倍數(shù)） ，單位是 moll-1。 3.2.2.3. 配合物與配合物與 g-四鏈體相互作用的紫外四鏈體相互作用的紫外可見光譜滴定可見光譜滴定 在紫外-可見吸收光譜儀的雙光路系統(tǒng)中，先往參比池中加入 475ul 緩沖溶液做參比，基線 穩(wěn)定后，往樣品池中加入濃度為 10um 的

53、配合物溶液 25ul，用微量進樣器每次往參比池和樣品 池中加入 5ul 的 dna 儲備液，混勻 5min 后，使 dna 在配合物溶液中的濃度比值不斷增加， 直至飽和。在 200-800nm 范圍內(nèi)檢測配合物的電子吸收光譜的變化。 3.2.2.4 配合物與配合物與 g-四鏈體作用的熒光光譜滴定四鏈體作用的熒光光譜滴定 在樣品池中加入 1950ul 的緩沖溶液以及 50uldna 儲備液，測定溶液在 620nm（440nm 激發(fā)）處發(fā)光強度，隨后樣品池中每次加入 10ul 濃度為 200um 的配合物 1、2 溶液，用移液 槍反復吸吐，混勻，5 分鐘后檢測熒光情況，如此反復，滴加 10 次。

54、4 結果和討論結果和討論 4.1 配合物與配合物與 g 四鏈體電子吸收光譜研究四鏈體電子吸收光譜研究 紫外光譜是研究小分子配合物與dna相互作用的一種最簡便、最常用的技術。價鍵理論認 為，每個分子都有一系列嚴格分立的能級，處于低能級的分子受到光的能量激發(fā)時，可吸收特 征頻率的光子而躍遷到較高的能級，進而產(chǎn)生吸收光譜。許多小分子配合物本身在紫外可見光 區(qū)有特征吸收峰，當小分子配合物與dna 相互作用時，通常會出現(xiàn)相應的特征變化，表現(xiàn)為吸 收譜帶變寬、吸收峰紅移(或藍移)及減色效應） 。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生往往來源于小分子配合物發(fā)色 團與dna 堿基電子云的強烈相互作用。因此，紫外可見吸收光譜可以用來研

55、究小分子配合物與 g-四鏈體dna 的相互作用，進而根據(jù)其產(chǎn)生的相應特征變化推測其作用模式。 在紫外光譜圖中(圖4-1、4-2、4-3、4-4)，300 nm 以下的吸收峰為配體間的-*躍遷峰 （il)， 而可見光區(qū)450 nm 附近的吸收峰為配合物 的mlct 峰，可以歸屬為ru(d) dpqdf(*)的 躍遷吸收。但是由于兩個吸收峰所在波長比較接近，因此在圖中只表現(xiàn)為一個寬的吸收帶。配 合物與兩種端粒dna作用后的lc 峰和mlct 峰表現(xiàn)出了明顯的減色效應和一定程度的紅移現(xiàn) 象，因為dna 在可見光區(qū)沒有吸收，推測配合物1、2在k+、na+緩沖溶液環(huán)境中都能與g-四鏈 體發(fā)生某種相互作用

56、。 同時，一般認為配合物與dna 作用時，峰值減小并伴隨紅移，電子吸收值改變越大，則配 合物與dna 作用越強。從圖中可以看出，對于k+緩沖條件下，以mlct 峰看，配合物與dna 作用后的減色率比在na+緩沖條件下的減色率大。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因可能是由于k+環(huán)境下形成 的dna 微觀結構更有利于其與配合物的鍵合。 300400500 0 1 abs wavelength/nm 合合合 5ul dna 10ul dna 15ul dna 20ul dna 25ul dna 圖圖4-1 鉀離子緩沖溶液配合物鉀離子緩沖溶液配合物1與端粒與端粒g-quadruplex作用的紫外滴定曲線作用的紫外滴定

57、曲線, ru=10um,450nm左右的吸收峰變化是由于左右的吸收峰變化是由于dna濃度的增加濃度的增加(從從0,1,2,3,4,5m)。 300400500 0 1 abs wavelength/nm 合合合 5ul dna 10ul dna 15ul dna 20ul dna 25ul dna 圖圖4-2 鈉離子緩沖溶液配合物鈉離子緩沖溶液配合物1與端粒與端粒g-quadruplex作用的紫外滴定曲線作用的紫外滴定曲線, ru=10um,450nm左右的吸收峰變化是由于左右的吸收峰變化是由于dna濃度的增加濃度的增加(從從0,1,2,3,4,5m)。 300400500 0 1 abs w

58、avelength/nm 合合合 5ul dna 10ul dna 15ul dna 20ul dna 25ul dna 30ul dna 35ul dna 40ul dna 圖圖 4-3 鉀離子緩沖溶液配合物鉀離子緩沖溶液配合物 2 與端粒與端粒 g-quadruplex 作用的紫外滴定曲線作用的紫外滴定曲線, ru=10um,450nm左右的吸收峰變化是由于左右的吸收峰變化是由于dna濃度的增加濃度的增加(從從0,1,2,3,4,5,6,7,8m)。 300400500 0 1 abs wavelength/nm 合合合 5ul dna 10ul dna 15ul dna 20ul dna

59、 25ul dna 30ul dna 35ul dna 40ul dna 圖圖 4-4 鈉離子緩沖溶液配合物鈉離子緩沖溶液配合物 2 與端粒與端粒 g-quadruplex 作用的紫外滴定曲線作用的紫外滴定曲線, ru=10um,450nm左右的吸收峰變化是由于左右的吸收峰變化是由于dna濃度的增加濃度的增加(從從0,1,2,3,4,5,6,7,8m)。 四種配合物在260-280 nm 附近出現(xiàn)較強的吸收峰，在450 nm 附近出現(xiàn)較弱的的吸收峰，均 可歸屬為配體中的-*躍遷，450 nm 附近的吸收峰對應于金屬釕配位體電荷轉移（mlct） 。 從圖中顯示，隨著ag3(t2ag3)3濃度的逐

60、漸增加，配合物在紫外區(qū)吸收光譜都能夠出現(xiàn)明顯減色 現(xiàn)象和一定紅移，但mlct 峰的峰值與位移變化不大。以上信息表明配合物可以與ag3(t2ag3)3 的堿基發(fā)生強烈的-*作用。根據(jù)圖4-5、4-6、4-7、4-8，dna滴定緩沖溶液450 nm 附近的 吸收峰變化趨勢圖表明，dna結合了釕配合物，保護了釕配合物的主配體，使得吸收峰減小。 一般對于雙鏈dna 來說，當配合物以插入方式進入dna 的堿基對時，與堿基對發(fā)生 電子堆 積效應，其*空軌道與堿基的 電子軌道發(fā)生耦合，能級下降，從而導致-*躍遷能減小， 產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。同時，耦合后的 軌道因部分填充電子，使-*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效 應。但