微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖及酶法降解殼聚糖的研究

1、微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖及酶法降解殼聚糖的研究 分類號(hào):. 學(xué)校代碼:密級(jí):機(jī)密研究生學(xué)號(hào):微生一?疊,葉上卟廠.、“天津科技大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外,本論文不包括任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果內(nèi)容,也不包括為獲得天津科技大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。對(duì)本文研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體,均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名:訕拓禾】日期:加年月日知識(shí)產(chǎn)權(quán)和專利權(quán)保護(hù)聲明本人鄭重聲明:所呈交的論文是本人在導(dǎo)師具體指導(dǎo)下并得到相關(guān)研究經(jīng)

2、費(fèi)支持下完成的,其數(shù)據(jù)和研究成果歸屬于導(dǎo)師和作者本人,知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬天津科技大學(xué);所涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權(quán)及使用權(quán)完全歸天津科技大學(xué)所有。本人保證畢業(yè)后,以本論文數(shù)據(jù)和資料發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名第一單位仍然為天津科技大學(xué)。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名:切硝秤。一日期:圳年多月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,同意公布論文的全部或部分內(nèi)容,允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)天津科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或

3、掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密卣請(qǐng)?jiān)诜娇騼?nèi)打卟,在年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密.】請(qǐng)?jiān)诜娇騼?nèi)打巾.作者簽名:訓(xùn)攜剝 日期:訓(xùn)年弓月廂日期:加/年;月,日導(dǎo)師簽名:當(dāng)年摘要?dú)ぞ厶?是自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的唯一的天然高分子堿性多糖,是甲殼素脫乙?；a(chǎn)物。具有獨(dú)特的生理活性和良好的成膜性、保濕性、吸附性和抗菌性,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖降解產(chǎn)物低聚殼聚糖,的水溶性大大改善,具有許多殼聚糖所不具備的獨(dú)特的生理活性和功能。本論文對(duì)如何利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖,并用非專一性酶降解殼聚糖制備低聚殼聚糖進(jìn)行了研究。論文首先對(duì)幾種常見真菌培養(yǎng)生產(chǎn)殼聚糖進(jìn)行了研究,確定雅致放射毛霉為發(fā)酵制備殼聚

4、糖優(yōu)良菌種。通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了雅致放射毛霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件。研究表明:發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的組成為玉米漿.%、玉米粉.%、 .%;優(yōu)化的發(fā)酵條件為培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基.%、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速/、接種量%、裝液量/。初始其次,采用稀酸稀堿處理菌體提取殼聚糖,對(duì)提取工藝路線和參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。先用%氫氧化鈉,固液比:,處理除去菌體表面蛋白,再用%醋酸下提取,殼聚糖得率可達(dá)到.%。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件和提取條件,殼聚糖產(chǎn)量可達(dá)./,脫乙酰度為.%,粘均分子量為.曠。此外,論文選用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行酶解,以酶解液中還原糖濃度為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)考察這四種

5、非專一性酶對(duì)殼聚糖的酶解效果。結(jié)果表明:各酶降解殼聚糖的能力大小為:纖維素酶胃蛋白酶果膠酶木瓜蛋白酶。采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶和胃蛋白酶組成的復(fù)合酶酶解條件。結(jié)果表明:優(yōu)化后的酶解條件為 .,溫度為.胃蛋白酶量為/.纖維素酶量為/。在優(yōu)化后的條件下還原糖的濃度可以達(dá)./,均高于單一的纖維素酶和胃蛋白酶的酶解效果。最后,對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了凝膠色譜分析和薄層層析。凝膠色譜分析洗脫曲線顯示酶解產(chǎn)物中含主要含有低聚殼聚糖和氨基葡萄兩個(gè)洗脫峰。酶解產(chǎn)物薄層層析表明酶解產(chǎn)物中低聚殼聚糖是由兩種分子量的低聚糖組成.此外,通過薄板層析割膠法回收低聚殼聚糖和氨基葡萄糖,回收率分別為%和%。關(guān)鍵詞:雅致放射毛霉;發(fā)

6、酵;殼聚糖;低聚殼聚糖;復(fù)合酶;酶解【一 . .,/ . .既. . .%, .%,. .%, ./ %,.: 也%:, 嘶 % .%. . 以 . .%,、宅.:. ., ,/ ,/././ . ? .,% %. . , ,目前言?.殼聚糖和低聚殼聚糖?.殼聚糖和低聚殼聚糖的結(jié)構(gòu).殼聚糖和低聚殼聚糖的性質(zhì)?“.殼聚糖的來源?.真菌中殼聚糖的生物合成.殼聚糖和低聚殼聚糖的應(yīng)用?.殼聚糖的應(yīng)用.低聚殼聚糖的應(yīng)用.殼聚糖的制備方法一.從蝦殼、蟹殼中提取殼聚糖.從昆蟲外殼提取殼聚糖”.微生物法生產(chǎn)殼聚糖?.低聚殼聚糖的制備方法.酸水解法?.氧化降解法.酶降解法.本課題的研究背景與意義?.本課題的研究

7、內(nèi)容?材料與方法” .實(shí)驗(yàn)材料?.菌種.主要藥品.儀器與設(shè)備?”.培養(yǎng)基和溶液?.實(shí)驗(yàn)方法”.原料預(yù)處理?“.菌體培養(yǎng) .菌絲體收集.殼聚糖提取.殼聚糖的酶解?.凝膠柱層析分析酶解產(chǎn)物?” .薄層層析法分析酶解產(chǎn)物?.薄板層析割膠制備低聚殼聚糖?,.發(fā)酵液中含糖量測定?. 法測酶解產(chǎn)物還原糖含量?.菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量計(jì)算.含氮量測定. 殼聚糖含量測定.殼聚糖紅外光譜掃描. 殼聚糖脫乙酰度的測定.殼聚糖粘均分子量計(jì)算.殼聚糖水分測定.殼聚糖灰分測定結(jié)果與討論.不同菌種提取殼聚糖比較.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化?.碳源對(duì)雅致放射毛霉合成殼聚糖的影響.氮源對(duì)雅致放射毛霉合成殼聚糖的影響.無機(jī)鹽對(duì)雅致放

8、射毛霉合成殼聚糖的影響?”.氮源碳源濃度對(duì)殼聚糖產(chǎn)量的影響.響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基的玉米粉玉米漿的濃度?.搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化?”.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響?.初始對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響.溫度對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響?.轉(zhuǎn)速對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響?.裝液量對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響?.接種量對(duì)菌體產(chǎn)殼聚糖的影響.發(fā)酵罐放大試驗(yàn)?.殼聚糖提取工藝的研究?.堿處理工藝條件優(yōu)化.酸提取條件工藝條件優(yōu)化?.高濃度堿脫乙酰提取殼聚糖研究一?.殼聚糖產(chǎn)品分析?”.殼聚糖產(chǎn)品紅外光譜?.?.?”.殼聚糖產(chǎn)品的性質(zhì)“一?”.酶法降解殼聚糖工藝研究.單酶酶解工藝條件研究.復(fù)合酶酶解殼聚糖.酶解產(chǎn)物分析及分離純化?“結(jié)論.展望?

9、” 參考文獻(xiàn)?”攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況.致謝?”上學(xué)位論文甲殼素、聚氨基葡萄糖,其化學(xué)名稱,一一氨基一一脫氧一葡萄糖,分子式。殼聚糖是甲殼素部分脫去乙?；漠a(chǎn)物。甲殼素也稱幾丁質(zhì),甲殼質(zhì),化學(xué)名稱.,.乙酰氨基脫氧?葡萄糖,分子式為,相對(duì)分子質(zhì)量通常在幾十萬到幾百萬,是由氨基葡萄糖或乙?；咸烟墙?jīng)過.,糖苷鍵連接的直鏈狀高分子堿性多糖【。一般而言,甲殼素.乙酰脫去%以后,即.脫乙酰度在%以上就可以稱之為殼聚糖,%以下的為甲殼烈引。日本厚生省規(guī)定脫乙酰度達(dá)到%以上的殼聚糖產(chǎn)量即可適于人體服用,%以上即可入藥使用【。甲殼素和殼聚糖的結(jié)構(gòu)式如圖.。甲殼黍 殼聚糖圖甲殼素和殼聚糖的結(jié)構(gòu)式一一 .

10、低聚殼聚糖,是由甲殼素和殼聚糖經(jīng)水解產(chǎn)生的一類低聚合度聚合度一般可溶于水的氨基糖類化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由乙酰.氨基葡萄糖和.氨基葡萄通過.,.糖苷鍵連接起來的均聚或雜聚低聚糖【。與大分子殼聚糖相比,其分子量小,水溶性良好,易被吸收利用,具有獨(dú)特的優(yōu)越生理活性和功能。.殼聚糖和低聚殼聚糖的性質(zhì)殼聚糖是白色或灰白色略帶有珍珠光澤的片狀或粉末狀固體。約在分解,相對(duì)分子質(zhì)量因原料和制備方法不同而從幾十萬到幾百萬不等【】,不溶于水和堿溶液,能溶于部分有機(jī)酸和稀無機(jī)酸中,如鹽酸、硝酸、醋酸、水楊酸等,但不溶于稀的硫酸、磷酸、草酸等【。在酸性水溶液中,殼聚糖分子中氨基、羥基等極性基團(tuán)與水分子相互作用而水合形

11、成黏稠,透明的殼聚糖膠體溶液。長期浸泡于酸性溶液中,由于其半縮醛結(jié)構(gòu)的存在,使其在酸性溶液中易發(fā)生降解,溶液粘度隨之下降。殼聚糖在其大分子結(jié)構(gòu)中含有豐富的羥基和氨基,這些活性基團(tuán)可以和其它物質(zhì)的分子發(fā)生,化學(xué)反應(yīng),可制備殼聚糖衍生物。殼聚糖是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的大量存在的天然堿前言性多糖【】,具有獨(dú)特的性質(zhì)及生理功能,如增粘性、成膜性、吸附性、抗菌性、生物相容性、保濕性。殼聚糖兼有高等動(dòng)物組織中膠原質(zhì)和高等植物組織中纖維素兩者的生物功能,具有生物可降解性和口服無毒性,被各國藥學(xué)和材料學(xué)等領(lǐng)域研究人員譽(yù)為人體所必需的第六生命要素與殼聚糖大分子相比,低聚殼聚糖具有獨(dú)特優(yōu)越的生理生化特性,如水溶性、

12、吸濕性、保濕型。殼聚糖是含氮多糖類天然生物活性物質(zhì),在其大分子鏈結(jié)構(gòu)中含有大量的和.基團(tuán)。當(dāng)殼聚糖降解時(shí),大量的一和一強(qiáng)極性基團(tuán)的增多,不僅使低聚殼聚糖的水溶性大為改善,也使其具有良好的吸濕保濕功能。分子量一定的低聚殼聚糖具有優(yōu)于甘油和透明質(zhì)酸的吸濕保濕功能,且在一定的分子量范圍內(nèi),隨均分子量的降低,保濕增濕性能逐漸增強(qiáng),隨著低聚糖分子量的增加,吸濕率不斷減:。.殼聚糖的來源最早發(fā)現(xiàn)甲殼素的是法國科學(xué)家.。年他從蘑菇中提取到一種類似纖維素的物質(zhì)并命名為。年法國人.宅昆蟲表面堅(jiān)硬角皮部分也發(fā)現(xiàn)類似物質(zhì),用希臘語改為。年,法國人.發(fā)現(xiàn)中含有氮,從而證明不是纖維素。年法國人.將甲殼素置于氫氧化鈉溶液

13、中加熱后得到可溶于有機(jī)酸的一種新物質(zhì),年德國人.將這種脫乙酰物質(zhì)命名為殼聚糖.此后各國科學(xué)家對(duì)殼聚糖的開發(fā)及應(yīng)用越來越感興趣,并先后于年和年兩次召開國際會(huì)議探討殼聚糖的提取技術(shù)和應(yīng)用研裂。甲殼素是一種廣泛存在自然界的天然高分子聚合物,廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、腸腔動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、原生動(dòng)物外殼及海藻和真菌類細(xì)胞壁中,是自然界大量存在的唯一的堿性多糖。每年地球上的自然生成量就達(dá)數(shù)十億噸,僅次于纖維素,是地球上第二大可再生資源。蝦蟹等動(dòng)物的外殼中甲殼素高達(dá)%,但殼聚糖含量極少;昆蟲綱、多足綱等昆蟲及其蛹?xì)ぶ幸埠胸S富甲殼素,從%不等;人們還發(fā)現(xiàn)甲殼素、殼聚糖還是絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分,含量

14、從微量到%不等研。且與其它生物來源相比,真菌殼聚糖含雜質(zhì)少,處理簡單,品質(zhì)高,因而真菌有望成為生產(chǎn)甲殼素和殼聚糖的新資涮。.真菌中殼聚糖的生物合成年溉證實(shí)在粗糙脈孢殼菌的細(xì)胞壁中有微絲幾丁質(zhì),隨后有關(guān)真菌甲殼素、殼聚糖的合成機(jī)理受到人們的廣泛研究。甲殼素處于絲狀真菌細(xì)胞壁最內(nèi)層,臨近質(zhì)膜,呈放射狀,是真菌菌絲尖端延長部位的主要組分,因此甲殼素的生成與真菌菌絲體的生長關(guān)系密切,不同生長階段的真菌甲殼素和殼聚糖含量不同,通常對(duì)數(shù)生長期含量較高【,。等【發(fā)現(xiàn)甲殼素/殼聚糖在大毛霉.不同的發(fā)育階段下。具有不同的合成速率。在酵母細(xì)胞階段中,其合成速率較慢,而在菌絲體階段其合成速率是前者的倍。陳世年【】用

15、熱重分析法和紅外光譜法研究米根霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖的組成,米根霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多天津科技人學(xué)碩上學(xué)位論文糖由甲殼素與殼聚糖組成。甲殼素和殼聚糖通過糖苷鍵共價(jià)連接,一起作為細(xì)胞壁的支持物,即結(jié)構(gòu)性多糖。自然界中的甲殼素和殼聚糖還常和其他多聚物相結(jié)合而存在,如殼聚糖糖上的自由氨基通過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)、碳水化合物結(jié)合,也可以結(jié)合離子【。殼聚糖在真菌體內(nèi)的生物合成,與其他多糖一樣,均為相當(dāng)復(fù)雜的生物化學(xué)過程。在一些絲狀真菌的細(xì)胞中,存在著甲殼素合成酶和甲殼素脫乙酰酶。等【】發(fā)現(xiàn)等發(fā)現(xiàn)合成魯氏毛霉 細(xì)胞壁的甲殼素和殼聚糖前體是.脲苷一二磷酸.乙酰氨基葡萄糖。該前體物質(zhì)經(jīng)甲殼素合成酶需催化把轉(zhuǎn)移到正在延長的甲殼

16、素鏈上,作為甲殼素的一個(gè)亞單位,新生態(tài)甲殼素再經(jīng)甲殼素脫乙酰酶催化脫去乙?；玫綒ぞ厶?。甲殼素脫乙酰酶對(duì)結(jié)晶狀態(tài)的甲殼素如外加的甲殼素來說其酶活性很低,對(duì)新生態(tài)的甲殼素的活性高,一旦新生態(tài)甲殼素結(jié)晶化形成微絲,甲殼素脫乙酰酶就不起作用。因此,絲狀真菌中形成的殼聚糖是由上述兩種酶協(xié)同作用的結(jié)果。酶的活性高低決定著殼聚糖合成量的多少,而兩種酶的活性與絲狀真菌的營養(yǎng)成分和添加劑有關(guān)。正因?yàn)槿绱?自然界中不僅存在大量甲殼素,也存在一些殼聚糖。利用這一原理,可以將一些絲狀真菌在合適的條件下發(fā)酵使其繁殖,直接生產(chǎn)出殼聚糖含量高的菌體。殼聚糖合成和途徑如圖。氨基轉(zhuǎn)移酶己糖激酶谷氨酰胺?回?匹圈 谷氨酸磷酸氨

17、基葡萄轉(zhuǎn)移酶磷酸乙酰氨基葡萄變位酶.一氨基葡 一一乙酰氨基 ?乙酰氨基萄糖 葡萄糖 葡萄糖脫乙酰酶甲殼素乏成酶焦磷酸化酶?圈二翹圖.真菌殼聚糖合成途徑嗣.殼聚糖和低聚殼聚糖的應(yīng)用.殼聚糖的應(yīng)用殼聚糖是自然界存在的唯一的天然高分子堿性化合物,具有無毒、可被生物降解、良好吸附性、抗菌性、生物相容性和成膜性等優(yōu)良特性,近年來已在環(huán)保、紡織印染、食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。.在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用前言殼聚糖對(duì)許多物質(zhì)具有螯合吸附作用,其分子中的氨基和與氨基相鄰的羥基與許多金屬離子如醇、等能形成穩(wěn)定的螯合物,用于治理重金屬廢水、凈化自來水及在濕法冶金中分離金屬離子等。應(yīng)用殼聚糖從工業(yè)廢水中回收銅已

18、達(dá)工業(yè)化,目前正研究利用殼聚糖從海水中提取鈾【引。殼聚糖分子中存在游離的氨基,在稀酸溶液中質(zhì)子化,從而使殼聚糖分子鏈帶上正電荷,成為典型的陽離子絮凝劑,而一般的污物帶有負(fù)電,因而殼聚糖可使帶相反電荷的物質(zhì)膠凝而沉淀。殼聚糖對(duì)于活性污泥有很強(qiáng)的絮凝作用,能通過絡(luò)合及吸附作用,對(duì)染料、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、鹵素等進(jìn)行吸附,用于染料廢水、印染廢水、食品工業(yè)廢水的處理, 它能把廢水中的有效成分絮凝沉淀下來,因殼聚糖無毒無害,沉淀物可加以回收提純,重新作為原料或作為飼料用,而絮凝劑經(jīng)再生后可重復(fù)使用。.在紡織印染領(lǐng)域中的應(yīng)用殼聚糖具有廣譜抗菌性,對(duì)多種細(xì)菌的生長都有明顯的抑制作用,已成為抗菌纖維開發(fā)

19、和研究的熱點(diǎn)。在紡織工業(yè)中,殼聚糖主要應(yīng)用于兩方面:一方面是利用殼聚糖的成纖性紡制纖維, 殼聚糖纖維純紡的抑菌率達(dá)%以上,混紡的抑菌率達(dá)%左右,具有抗菌、防霉、去臭、吸濕、保濕、柔軟、染色性好等優(yōu)點(diǎn),另一方面利用其能溶于稀酸的性質(zhì)和其化學(xué)反應(yīng)活性,對(duì)織物進(jìn)行整理,賦予織物優(yōu)良抗菌防霉的性能、改善織物的抗皺性能、抗靜電性能。另外,殼聚糖的醋酸溶液作直接染料和疏化染料的固化劑,不僅可以增進(jìn)織物和花布的耐光和耐磨性,而且可使織物富有滑爽和硬挺的外觀。研究還發(fā)現(xiàn),用殼聚糖處理織物可以提高活性染料和直接染料的上染率,特備對(duì)于活性染料。用作印染助劑,對(duì)酸性染料、直接染料有很好的相容性,不會(huì)釋放游離甲醛,可

20、采用低鹽或無鹽染色工藝,不會(huì)對(duì)人體或環(huán)境產(chǎn)生毒害【】。.在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用殼聚糖是具有海綿狀的特殊結(jié)構(gòu)的溶膠性能,可用于藥劑的壓片助劑、膠囊劑和緩釋劑,可以控制藥物持續(xù)放出,改善藥物的溶解性和吸收性,使分散在殼聚糖中的藥物達(dá)到理想的釋放速度,從而達(dá)到減少給藥次數(shù),減輕毒副作用等效果。殼聚糖制成的納米粒具有靶向、緩解、增加藥物吸收等作用,已成為當(dāng)今研發(fā)的新熱點(diǎn)【。殼 聚糖的制成的人造皮膚和生物敷料。這種修飾材料具有天然皮膚的功能,不但能使傷口免受細(xì)菌的感染,而且還可以滲透空氣和水分,進(jìn)皮膚再生的功效。對(duì)創(chuàng)面無刺激性和任何毒性。殼聚糖和甲殼素混合后可制成高強(qiáng)度的絲狀纖維,用作手術(shù)縫合線。這種手術(shù)線

21、機(jī)械強(qiáng)度好,可長期存放,能用常規(guī)方法消毒。不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng),能被人體內(nèi)組織液降解而吸收,傷口愈合后無須拆除手術(shù)線,免除了患者拆線的痛苦。高分子的殼聚糖及其衍生于胃酸作用形成凝膠,在胃上形成一層保護(hù)膜,可使胃部潰瘍得以控制。殼聚糖可增強(qiáng)動(dòng)物免疫監(jiān)控系紺翻,具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能,抑制血糖升高、降低血脂、降低血清和肝臟中的膽固醇濃度。殼聚糖能調(diào)節(jié)體內(nèi)的值到弱堿性,提高胰島素的利用率,有利于防治糖尿病【。.在食品工業(yè)中的應(yīng)用天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文殼聚糖無毒無味,可生物降解,不會(huì)造成二次污染,是一種食品工業(yè)中優(yōu)良的絮凝劑,可用作各種果汁酒類的液體澄清劑。果汁中含有大量的果膠、纖維素和多聚糖等物質(zhì),

22、存放期間會(huì)使果汁渾濁。殼聚糖能作為果汁、糖蜜、食醋、酒類等的澄清劑。另外,殼聚糖澄清果汁還可降低果汁酶褐變速度和程度,因?yàn)闅ぞ厶悄艹ス卸喾友趸浮＠脷ぞ厶桥c酸性多糖反應(yīng),可生成殼聚糖的酸性多糖絡(luò)鹽,制成有保健功能的仿生肉,成為緊俏的減肥食品。殼聚糖也可用于面包制品、果醬、花生醬、奶油替代品等食品生產(chǎn)中【】。殼聚糖攜帶大量的氨基,是食物纖維素中唯一的陽離子聚合物,可吸附胃腸道中的脂質(zhì),阻礙人體對(duì)脂肪膽固醇的吸收,從而降低血脂含量,具有抗血栓、預(yù)防心腦血管病變的功效,因而可用于保健食品添加劑。殼聚糖作的保鮮膜可阻礙大氣中氧的滲入以及瓜果呼吸產(chǎn)生二氧化碳的逸出,但可使乙烯氣體逸出,從而保持果

23、蔬原色原昧,抑制果蔬呼吸強(qiáng)度,降低果蔬在儲(chǔ)藏過程中營養(yǎng)成分的損失。此外,還能阻止微生物的浸染,減少果蔬腐爛率。用于桃、日本梨、獼猴桃、黃瓜、辣椒、草莓和西紅柿等的鮮。另外,殼聚糖淀粉合成食品包裝膜可食、無毒、耐油、抗張強(qiáng)度高,不溶于冷水和熱水,可用于包裝固體、半固體和液體食品,尤其含油量比較高的加工食品的內(nèi)包裝【】。.低聚殼聚糖的應(yīng)用低聚殼聚糖由殼聚糖水解而來,具有良好的水溶性,在許多方面顯示出比殼聚糖優(yōu)越的性能,如抗腫瘤、抗菌、免疫激活及保濕等特性,使其在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用前景【,。.在食品工業(yè)的應(yīng)用低聚殼聚糖具有爽口的甜味,與高分子殼聚糖相比,隨著聚合度的降低,其甜

24、味、吸濕性、溶解度均增加,可作為食品添加劑,用于食品結(jié)構(gòu)的改善,提高食品的保水性及水分活性的調(diào)節(jié)等。低聚殼聚糖由于具有增強(qiáng)人體免疫能力、降低膽固醇、抗腫瘤和潰瘍等生理活性,可用于保健食品的生產(chǎn)。日本己出現(xiàn)了多種用低聚殼聚糖制成的保健品,如卡尼期泰的主要成分是低聚殼聚糖、有機(jī)鐵和紅花油,具有降低血脂的保健功能。低聚殼聚糖具有抗菌和抑菌的作用,還可將其用于食品保鮮劑,有望成為一種新型的“綠色”食品防腐劑,而得到推廣應(yīng)用】。.在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用低聚殼聚糖在生物醫(yī)藥方面的重要用途之一是利用低聚殼聚糖的抑制腫瘤的作用來制取抗癌藥劑,特別是聚合度的低聚殼聚糖可通過活化人體中的淋巴細(xì)胞,抑制癌細(xì)胞的繁殖和

25、擴(kuò)散來達(dá)到抗癌抑癌作用,在抗癌藥物的研制中有廣泛的前景【,。淋巴細(xì)胞的生理活性與周圍環(huán)境的值有很大關(guān)系,以稍顯堿性為最佳.通常癌細(xì)胞的周圍為酸性,而低聚殼糖上的氨基堿性基團(tuán)可適當(dāng)調(diào)節(jié)體內(nèi)的值,并通過這種調(diào)節(jié)作用改變機(jī)體處于病態(tài)時(shí)的生物化學(xué)平衡,加強(qiáng)淋巴細(xì)胞的生理活性,從而對(duì)癌細(xì)胞的繁殖進(jìn)行抑制【。由低聚殼聚糖制成的軟膏用于涂抹快治療牙周炎,含有低聚殼聚糖的醫(yī)用紗布具有止血、消毒和促進(jìn)傷口愈合作用【蚓.前言.在化妝品方面的應(yīng)用護(hù)膚化妝品最重要的性能之一是調(diào)濕作用,即化妝品的保濕增濕作用,通常護(hù)膚品的有效性就是依據(jù)其調(diào)濕能力而言的。低聚殼聚糖具有優(yōu)良的保濕性、增濕性、生物相容性、成膜性,又具有良好

26、的透氣性能,是一種強(qiáng)的吸濕與保濕劑。在護(hù)膚化妝品中添加一定量的低聚殼聚糖,既可以防止化妝品配方中水分的逸失,又可以對(duì)表皮水分進(jìn)行水合,從而起到保濕增濕作用。與傳統(tǒng)的保濕增濕劑相比,低聚殼聚糖的保濕增濕性效果更佳,在洗面奶及各類膏霜中的使用更顯其優(yōu)越性。而且低聚殼聚糖良好的透氣性又不干擾表皮對(duì)廢物和毒素的排泄,不會(huì)造成皮膚粉刺。目前國外以開發(fā)出含有低聚殼聚糖的高級(jí)洗發(fā)香波、高級(jí)護(hù)膚用品、沐浴液和面膜等日用化妝品【刃引。.殼聚糖的制備方法目前,工業(yè)上制備殼聚糖的方法是從蝦蟹殼中提取甲殼素再用強(qiáng)堿脫乙?；频脷ぞ厶?。另外,從昆蟲外殼中提取殼聚糖、利用微生物法生產(chǎn)殼聚糖也受到廣泛研究。.從蝦殼、蟹殼中

27、提取殼聚糖目前,絕大多數(shù)甲殼素和殼聚糖產(chǎn)品都是來源于海產(chǎn)品加工后的副產(chǎn)蟹殼蝦殼,大約占世界總產(chǎn)量的。殼聚糖傳統(tǒng)工藝為:以蝦、蟹為原料,水洗去蛋白質(zhì)等粘附雜質(zhì)后用%稀鹽酸浸泡溶去碳酸鈣,再泡于%稀氫氧化鈉并加熱除去結(jié)合蛋白,再經(jīng)水洗、干燥得粗品甲殼質(zhì);再用%高錳酸鉀脫色漂白,用%亞硫酸氫鈉溶液還原,并洗凈、瀝干,即得到不溶性甲殼素:不溶甲殼素再經(jīng)%濃氫氧化鈉加熱處理脫去乙?；?而后經(jīng)水洗、干燥、粉碎得殼聚糖產(chǎn)品。這種傳統(tǒng)技術(shù)的缺點(diǎn)在于:首先,蟹殼和蝦殼生產(chǎn)原料多產(chǎn)于沿海而受到地域和季節(jié)限制,收集保存困難,不易形成規(guī)模,原料種類和產(chǎn)地的不同都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,分子量純度不好控制。同時(shí),生產(chǎn)成分

28、受制于原料成本的價(jià)格變化,生產(chǎn)成本較高。其次,原料前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力,制取工藝中需要大量的濃酸濃堿,對(duì)設(shè)備要求嚴(yán)格,成本高,廢水中的有機(jī)物和無機(jī)鹽含量都很高,產(chǎn)生大量廢水,對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重,產(chǎn)品殼聚糖的特性不穩(wěn)定,脫乙酰度不均勻,分子量變化大刪。最近有人提出使用發(fā)酵方法從蝦殼蟹殼中提取殼聚糖和甲殼素【。其主要原理是利用菌絲體發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶消耗蛋白質(zhì),以及發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的酸消耗掉無機(jī)物,從而提取甲殼素和殼聚糖,但目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。.從昆蟲外殼提取殼聚糖昆蟲資源量大、生長繁殖快、殼聚糖含量較高。因此。昆蟲殼聚糖資源的開發(fā)具有較好的市場前景,近年受到廣泛關(guān)注。陳盛等年就提出了蠅蛆生產(chǎn)殼聚糖

29、的工藝。渠榮遴提出的生產(chǎn)殼聚糖的基本工藝如下:以家蠅蛆、家蠅蛹、家蠅羽化后的蛹?xì)さ葹樵?經(jīng)清洗、破碎、堿液脫蛋白質(zhì)、脫脂肪,去除口器和臟器,脫色、脫鈣,清洗制得甲殼素,再將該甲殼素置于反應(yīng)器中與氫氧化鈉溶液反應(yīng),脫乙酰,產(chǎn)物經(jīng)過濾或離心分離,再用純水洗天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文凈,烘干制成殼聚糖。此外還有研究從馬尾松毛蟲蛹】,這些研究擴(kuò)大了甲殼素得來源,為在非沿海地區(qū)小規(guī)模或中規(guī)模生產(chǎn)殼聚糖提供了技術(shù)依據(jù),但目前都處于研究階段,而且從來源上看要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)也相當(dāng)困難。.微生物法生產(chǎn)殼聚糖地球上有豐富的微生物資源,大部分種類可以用工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng),這為殼聚糖的集約化生產(chǎn)提供了

30、物質(zhì)基礎(chǔ)。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)殼聚糖與從蝦、蟹殼等原料中提取相比,有以下優(yōu)點(diǎn)【刪:分離工藝簡便從絲狀真菌絲中提取殼聚糖可利用其本身酶的自身催化,只需要稀堿和稀酸簡單處理就可以得到純度相當(dāng)高的制品,大大簡化了提取工藝,污染小。原料來源豐富大部分真菌可以通過工業(yè)發(fā)酵大規(guī)模培養(yǎng),不受地理位置,。季節(jié)等因素影響,而且可以在遠(yuǎn)離海岸的內(nèi)地,山區(qū)等地區(qū)獲得,一年四季均可加工。產(chǎn)品性能優(yōu)良,脫乙酰度高采用微生物培養(yǎng)法制備的殼聚糖其脫乙酰度和分子量與利用甲殼動(dòng)物生產(chǎn)的殼聚糖非常接近,從菌絲體中提取的殼聚糖的脫乙酰度為%。菌絲來源的殼聚糖對(duì)金屬離子如,的吸附能力遠(yuǎn)大于蝦殼來源的殼聚糖,特別適合用于含重金屬離子較多

31、的廢水,微生物培養(yǎng)法制備的殼聚糖制成 的食品保鮮劑的抗菌素菌對(duì)乳酸菌,枯草菌等能力比蝦殼來源的殼聚糖高倍。另外,控制培養(yǎng)條件,適時(shí)收獲,還可以獲得不同分子量的殼聚糖,可作特殊用途。綜合利用,降低成本用菌絲體制備甲殼素/殼聚糖所采用的菌種均為工業(yè)生產(chǎn)用菌,其中許多菌株已用于工業(yè)生產(chǎn),利用它們發(fā)酵時(shí)形成的菌絲體作為生產(chǎn)殼聚糖的原料的作法則完全是變廢為寶;同樣利用農(nóng)業(yè)上廢棄物作為真菌培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)殼聚糖不僅解決了廢棄物得處理,同時(shí)又獲得了有價(jià)值得殼聚糖產(chǎn)品,還可以減少環(huán)境污染,經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分明顯。.毛霉屬發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖毛霉屬真菌利用細(xì)胞中存在的甲殼素合成酶和甲殼素脫乙酰酶的自身催化作用,把細(xì)胞

32、內(nèi)合成的甲殼素轉(zhuǎn)變成殼聚糖,這樣就可以直接從其菌絲體提取殼聚糖【。王一?一?惠杰等削研究了魯氏毛霉 培養(yǎng)制備甲殼素和殼聚糖,培養(yǎng)耐問對(duì)菌絲體內(nèi)殼聚糖及其它主要成分含量的影響及產(chǎn)物的收率。培養(yǎng)菌絲體數(shù)量很快增長,菌絲體干重達(dá)到/培養(yǎng)基。用%氫氧化鈉溶液在條件下除蛋白質(zhì),再用%乙酸、提取殼聚糖,然后在.條件下沉淀。魯氏毛霉甲殼素和殼聚糖產(chǎn)率分別為菌絲體干重的.%和.%。陳忻等采用以經(jīng)篩選的第三代雅致放射毛霉為原料生物發(fā)酵法制備殼聚糖,在培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速為/、.條件下發(fā)酵培養(yǎng)后,菌體經(jīng)稀堿加熱脫蛋白,再用稀酸處理提取殼聚糖,殼聚糖對(duì)其菌絲體產(chǎn)率為.%,殼聚糖的產(chǎn)率為./.王榮等【】選用了總狀毛霉和

33、根霉 兩種真菌作為研究對(duì)象,結(jié)合從蝦殼蟹殼中用酸堿法提取甲殼質(zhì)的方法,得出了一條適合于從絲狀真菌中提取殼聚糖的新途徑,得出總狀毛霉殼聚糖產(chǎn)量比根霉殼聚糖產(chǎn)量高。 一.前言.犁頭霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖日本小林丘【】以毛霉科屬種共個(gè)菌株為研究對(duì)象,測定了殼聚糖的分布,進(jìn)行了殼聚糖生產(chǎn)菌種的篩選。他們用含有葡萄糖、蛋白胨和酵母抽提物以及無機(jī)鹽的培養(yǎng)基,在搖瓶中于對(duì)菌株震蕩培養(yǎng) ,收獲的菌絲用熱的稀堿處理,分離出堿不溶物質(zhì)細(xì)胞壁,再用稀酸處理,從堿不溶物質(zhì)中提取出殼聚糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)犁頭霉屬生產(chǎn)殼聚糖的能力最高。【認(rèn)為藍(lán)色犁頭霉施砌口魯氏毛霉更有發(fā)展前景。犁頭霉可利用較便宜的碳源和源,培養(yǎng)時(shí)菌絲體呈顆粒狀,發(fā)酵

34、液粘度低,產(chǎn)量高。犁頭霉對(duì)數(shù)生長期過后,殼聚糖與其他細(xì)胞壁物質(zhì)結(jié)合更加牢固,需要強(qiáng)酸長時(shí)間作用,這往往導(dǎo)致殼聚糖粘度下降,因此應(yīng)在對(duì)數(shù)期前收獲菌絲體。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵藍(lán)色犁頭霉后,菌體生物量達(dá)至/,獲得天然殼聚糖得率為%;發(fā)酵后菌體生物量達(dá)到/,殼聚糖得率為.%。魏光等【刪報(bào)道了一種從藍(lán)色犁頭霉細(xì)胞壁中提取殼聚糖的簡便方法,在下、%間歇處理二次,%抽提,天然殼聚糖產(chǎn)量占茵絲干重的.%,脫乙?；苽涞臍ぞ厶钱a(chǎn)量占菌絲體干重的.%。王偉平等【】研究利用犁頭屬真菌藍(lán)色犁頭霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖,探索了廉價(jià)并能高產(chǎn)殼聚糖的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。通過對(duì)比農(nóng)副產(chǎn)品對(duì)菌絲體產(chǎn)率的影響,最終確定出最佳的培養(yǎng)基組份為:糖

35、蜜%,棉籽殼%,硫酸銨%。得到菌絲干重為./,粗殼聚糖為.,通過檢測得到該產(chǎn)品脫乙酰度為.%,純度為.%。.根霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖陳世年陬用米根霉 發(fā)酵法生產(chǎn)殼聚糖。在下,/下?lián)u瓶培養(yǎng).細(xì)胞干重達(dá)./.最終得殼聚糖產(chǎn)率為.%占生物量干重,重均分子量為.,粘度為,脫乙酰度為%。米根霉是生產(chǎn)【廣乳酸等生化產(chǎn)品的菌種,其細(xì)胞壁含有天然殼聚糖,可以通過發(fā)酵法直接進(jìn)行提取,不需經(jīng)濃堿脫乙酰步驟,提高了資源利用率,減少了發(fā)酵處理過程中的排污量,有利于企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。日本根霉是工業(yè)酒精生產(chǎn)中糖化淀粉的重要菌種.張濤掣】研究了發(fā)酵法培養(yǎng)日本根霉制備殼聚糖的生產(chǎn)工藝條件。通過對(duì)日本根霉發(fā)酵條件的正交優(yōu)化,得到了較佳

36、的發(fā)酵條件,以%淀粉為碳源,%蛋白胨為氮源,得到菌絲體干重為.。經(jīng)間歇處理,在起始.、下培養(yǎng)抽提,得到天然殼聚糖為./,殼聚糖產(chǎn)率占菌絲體干重的百分比為.%。.曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖黑曲霉 是檸檬酸生產(chǎn)中常用的菌種,曹建等刈培養(yǎng)黑曲霉并用電解法制備甲殼素,采用間歇提取法從中提取殼聚糖,利用%蔗糖和%玉米漿為培養(yǎng)液,在下培養(yǎng)黑曲霉時(shí)后,產(chǎn)品得率為.%,并發(fā)現(xiàn)對(duì)黑曲霉的生長有刺激作用。時(shí)龍祥等【】研究了黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的培養(yǎng)基配比和培養(yǎng)條件,并在培養(yǎng)基中加入酒糟,最佳培養(yǎng)基組成為玉米漿%、酒糟%、葡萄糖%、硫酸鎂%,培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速/,發(fā)酵時(shí)間,中性,菌體干天津科技人學(xué)碩上學(xué)位論文重達(dá)

37、./。酈和生等啪利用微波技術(shù)從黑曲霉提取殼聚糖。在菌絲體與堿液體積比為:微波功率為反應(yīng)時(shí)間堿濃度%醇水比:的條件下,所得殼聚糖的脫乙酰度為%,特性粘數(shù)為./。呂曉霞等【】用實(shí)驗(yàn)室合成的纖維素酶和木聚糖酶對(duì)預(yù)處理玉米芯水解得到的水解液為底物進(jìn)行了黑曲霉、綠色木霉和戴爾根霉 培養(yǎng),進(jìn)而從所得到的菌絲體中提取殼聚糖的實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果表明幾種真菌中黑曲霉更適合用來制備殼聚糖;以酶水解液為底物,培養(yǎng)液中還原糖濃度為、黑曲霉菌絲體培養(yǎng)溫度、值.、搖床轉(zhuǎn)/、培養(yǎng)速 后殼聚糖產(chǎn)量最高,為. /培養(yǎng)液,產(chǎn)品得率為.殼聚鞭原糖。.低聚殼聚糖的制備方法目前低聚殼聚糖主要是通過殼聚糖降解獲得。降解方法主要有酸水解法、氧

38、化降解法和生物酶降解法。.酸水解法酸解法是讓殼聚糖在高酸濃度和高溫等強(qiáng)烈條件下進(jìn)行水解,是使糖苷鍵水解的一種最普通和最有效的方法。酸在降解過程中起催化作用,它是利用殼聚糖分子中存在眾多的游離氨基與溶液中氫離子結(jié)合,引起殼聚糖分子間與分子內(nèi)部的氫鍵斷裂,舒展分子結(jié)構(gòu),而長鏈部分易發(fā)生糖苷鍵斷裂,形成許多聚合度不等的分子片段,嚴(yán)重水解則變成單糖。鹽酸降解法開發(fā)應(yīng)用較早,】等早在年將制備的殼聚糖溶解于濃度為./的鹽酸溶液中,在條件下反應(yīng),得到了聚合度在的氨基葡萄糖。等對(duì)濃鹽酸降解甲殼素制備低聚殼聚糖進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著鹽酸濃度增大、溫度升高,降解速率也越快。等唧】研究表明,溫和條件酸水

39、解可得一系列不同聚合度殼聚糖,濃酸水解可得殼聚糖單體。其他一些無機(jī)酸如乙酸、亞硝酸、磷酸等弱酸,也水解殼聚糖為低聚殼聚糖【,但由于產(chǎn)品分子量分布較寬,降解時(shí)間長以及存在副反應(yīng)等也受到限制。酸水解由于反應(yīng)劇烈不易控制,產(chǎn)物低聚殼聚糖的分子量分布寬難以控制,產(chǎn)物中單糖較多,殼寡糖含量相對(duì)偏低;產(chǎn)物分離提存成本高,后處理麻煩,需大量離子交換樹脂,工藝煩瑣;水解產(chǎn)物在較高的溫度下發(fā)生炭化,脫色較困難,能耗大;消耗大量鹽酸,對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。.氧化降解法氧化降解法是近年來國內(nèi)外研究比較多的一種降解殼聚糖的方法。有很強(qiáng)的氧化性,可以氧化殼聚糖主鏈的糖苷鍵使其分子量降低.利用在水溶液中電離形成的各種游離基團(tuán)?

40、、?及,其中高活性的和新生態(tài)的具有極強(qiáng)的氧化性能,它們攻擊殼聚糖上那些帶有活潑的.,糖苷鍵,致使其解聚。降解法一般先將殼聚糖溶解于鹽酸或醋酸溶液中,再加入一定體積的進(jìn)行均相降解反應(yīng),覃彩芹等【人在研究中發(fā)現(xiàn),在弱酸體系中既可使分子結(jié)構(gòu)舒展從而增多活前言性氧化基團(tuán)的攻擊位點(diǎn),又可避免殼聚糖分子因部分與大量的結(jié)合生成缺電子體系,阻礙了氧化降解的發(fā)生。而且殼聚糖脫乙酰度越高,越容易降解。氧化法降解速度相對(duì)較快,成本低,產(chǎn)品分子量低且分布窄,無殘毒、易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化【。但降解過程的后期常常伴有褐變反應(yīng),這表明殼降解過程中發(fā)生了羰氨反應(yīng),同大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)一樣,羰氨反應(yīng)速率受溫度影響較大。當(dāng)反應(yīng)溫度超過后,降

41、解產(chǎn)物的顏色很容易發(fā)生褐變,增加了后續(xù)產(chǎn)品提純負(fù)擔(dān)。其他氧化降解法如亞硝酸鹽法,過醋酸法制備低聚殼聚糖的也有報(bào)道,但此類方法降解產(chǎn)物分子量較高,但氧化劑的使用增加了降解產(chǎn)物分離純化的難度。.酶降解法酶降解法反應(yīng)條件溫和,降解過程容易控制及降解產(chǎn)物均一性好,無副反應(yīng),制備的低聚殼聚糖生物活性高,產(chǎn)物不用除鹽,環(huán)境污染少,是一種非常有應(yīng)用前景的降解方法,近年來國內(nèi)外常有相關(guān)報(bào)道。按所用酶的不同,分為專一性酶降解和非專一酶降解。.專一性酶水解對(duì)于專一酶,由于具有特異性,可選擇性地切斷特定鏈,從而制得特定的低聚糖。水解殼聚糖的專一性酶有甲殼素酶和殼聚糖酶。甲殼素酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、放線菌等多種微生

42、物以及植物組織和動(dòng)物的消化系統(tǒng)中,該酶系一般被誘導(dǎo)為多酶復(fù)合體,即甲殼素外切酶、內(nèi)切酶和.乙酰氨基葡萄糖苷酶,可水解殼聚糖產(chǎn)生二聚體畔。殼聚糖酶主要存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中,在一定條件下殼聚糖酶能以內(nèi)切方式催化殼聚糖分子中氨基葡萄糖苷鍵,生成聚合度為.的低聚合產(chǎn)物,很少產(chǎn)生單糖砧,吲。刀在研究中發(fā)現(xiàn),殼聚糖酶在降解殼聚糖時(shí),需要有一定的乙?；鶇f(xié)助催化降解。在乙酰度不高的情況下,隨著殼聚糖的乙酰度降低,酶的活性增高,低聚殼聚糖的收率增大;而且降解時(shí)間是控制產(chǎn)物聚合度的關(guān)鍵因素。戴大章等唧人對(duì)殼聚糖酶降解殼聚糖的過程中溫度、值、底物濃度和金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究,認(rèn)為利用來源于黑曲霉的殼聚

43、糖酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行酶法降解時(shí),最適溫度,最適.,最適底物濃度為./。由此可見,殼聚糖酶是以殼聚糖為降解底物制備低聚殼聚糖的有效方法。雖然目前已從微生物體內(nèi)開發(fā)出多種殼聚糖酶,但是殼聚糖酶很難大量獲得,因此價(jià)格昂貴還沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),目.前僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。.非專一性酶水解目前發(fā)現(xiàn)水解殼聚糖的非專一性酶有多種,如:溶菌酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、鞣酸酶等。這些非專一性酶都是工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑,易于獲得且價(jià)格低廉,對(duì)殼聚糖的降解效果比較顯著,有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力。殼聚糖和纖維素都是以糖苷鍵連接的多糖化合物,在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性。天津科技大

44、學(xué)碩士學(xué)位論文掣研究表明,纖維素酶來自可水解殼聚糖產(chǎn)生殼聚六糖和殼聚八糖。周孫英掣的實(shí)驗(yàn)證明纖維素酶能很容易地降解殼聚糖,在內(nèi)殼聚糖溶液粘度下降了%。由于纖維素酶相對(duì)廉價(jià)易得,具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力?？僧a(chǎn)生.%甲殼等【.】研究用牛胃蛋白酶.、/處理甲殼素,二糖、%一乙酰葡糖胺和.%甲殼三糖,非晶體形和磷酸處理過的底物效果較好。用果膠酶對(duì)不同乙?；鹊臍ぞ厶沁M(jìn)行降解,結(jié)果乙?；却笥?的殼聚糖降解速度較快,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)果膠酶只降解具有基團(tuán)的糖菅鍵。等【深入研究了木瓜蛋白酶對(duì)殼聚糖的降解作用,認(rèn)為相對(duì)分子量在范圍內(nèi)的殼聚糖很容易被降解為低聚殼聚糖,在室溫下木瓜蛋白酶傾向于優(yōu)先降解較長的分子鏈,且只選

45、擇作用在兩端分別連接和的的.,糖苷鍵。多數(shù)單一水解酶對(duì)殼聚糖降解程度有限,若將非專一性水解酶按比例配合,利用酶之間水解作用的協(xié)同和互補(bǔ)效應(yīng),可進(jìn)一步提高對(duì)殼聚糖的水解程度。周孫英等【】對(duì)種非專一性酶降解殼聚糖的效果作了比較,種酶對(duì)殼聚糖的水解速度依次是胃蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、溶菌酶。多數(shù)單一水解酶對(duì)殼聚糖降解程度有限,若將非專一性酶按比例配合,利用酶之間水解作用的協(xié)同或互補(bǔ)效應(yīng),可進(jìn)一步提高對(duì)殼聚糖的水解程度。何新益等以由胃蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶降解殼聚糖,復(fù)合酶組成為木瓜蛋白酶:胃蛋白酶:果膠酶:時(shí),對(duì)殼聚糖具有最高的水解活力,可使殼聚糖的水解產(chǎn)物分子量低于。由

46、于專一性酶價(jià)格昂貴難易商業(yè)化,采用非專一性酶或復(fù)合酶利用他們之間的協(xié)同作用來制備低聚殼聚糖將是一條極具潛力的途徑。.本課題的研究背景與意義殼聚糖是自然界中的唯一堿性多糖,安全無毒,且具有生物相容性和可生物降解性等,在食品醫(yī)藥等多種領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)從蝦、蟹殼中提取殼聚糖,必須使用濃酸濃堿,不僅污染環(huán)境,而且原料來源也受到季節(jié)和地域的限制。微生物發(fā)酵法制備殼聚糖避免了傳統(tǒng)工藝的缺點(diǎn),目前已有一些相關(guān)的研究,但成本較高,得率較低。目前國內(nèi)外研究利用雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的報(bào)道很少,且未見對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基和提取條件的的研究報(bào)道。選擇優(yōu)良菌種,利用廉價(jià)的原料發(fā)酵制備殼聚糖,優(yōu)化殼聚糖

47、提取工藝,降低生產(chǎn)成本,具有一定經(jīng)濟(jì)效益。殼聚糖的降解產(chǎn)物低聚殼聚糖水溶性得到了明顯改善,且易被人體吸收利用,具有抑菌、抗腫瘤、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫及活化腸道雙歧桿菌等多種生理功能,應(yīng)用領(lǐng)域大大拓寬,其研究和應(yīng)用已引起人們的廣泛關(guān)注。日本年已有殼低聚糖產(chǎn)品投放市場,年銷售額達(dá)億日元。目前國內(nèi)殼低聚糖幾乎全部為日本產(chǎn)品,售價(jià)為每克元。目前國內(nèi)外大多數(shù)都是用酸進(jìn)行水解制備低聚殼聚糖,但要得到個(gè)糖以上的低聚殼聚糖很不易。酶解法反應(yīng)溫和、易控制、易分離處理和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn),但專一性酶成本較高。以商業(yè)化生產(chǎn)的非專一性酶直接降解殼聚糖制備低聚殼聚糖,能有效地降低成本。由酶法制備低聚殼聚糖,尤其是制備其中具有

48、生物活性的低前言聚合度的寡糖,是當(dāng)前殼聚糖研究的熱點(diǎn)之一。.本課題的研究內(nèi)容本論文主要目的是利用廉價(jià)原料發(fā)酵制備殼聚糖,并對(duì)其進(jìn)行復(fù)合酶酶解制備出特殊用途的低聚殼聚糖。通過對(duì)比研究篩選出高產(chǎn)殼聚糖的菌種;利用廉價(jià)原料發(fā)酵制備殼聚糖的培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的探索和優(yōu)化;對(duì)真菌殼聚糖提取條工藝條件和參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化;比較幾種常用非專一性酶降解殼聚糖的能力,篩選出酶解效果較好的酶;利用復(fù)合酶降解殼聚糖,探索復(fù)合酶酶最佳工藝參數(shù);利用凝膠色譜和薄層層析分析酶解產(chǎn)物,回收低聚殼聚糖和氨基葡萄糖。玉米粉 天津市場纖維素酶 天津利華酶制劑公司/果膠酶 天津利華酶制劑公司/胃蛋白酶 天津諾奧科技發(fā)展有限公司/木瓜蛋白

49、酶 天津諾奧科技發(fā)展有限公司/高溫淀粉酶 天津諾奧科技發(fā)展有限公司葡萄糖 分析純 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心酒石酸鉀鈉 分析純 天津市密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心亞硫酸鈉 分析純天津市化學(xué)試劑一廠鐵氰化鉀 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠。硼酸 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠濃硫酸 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠硫酸銅 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠硫酸鉀 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠磷酸氫二鉀 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠鄰苯二甲酸氫鉀 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠酚酞 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠冰乙酸 分析純 天津市化學(xué)試劑一廠鹽酸 分析純硝酸銨 分析純麥芽糖 分析純氯化鉀 分析純氯化鈣 分析純乙酸乙酯 分析純 天津北方

50、天醫(yī)化學(xué)試劑廠乙酸鈉 分析純 天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠硝酸鈉 分析純 天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠分析純 天津市化學(xué)試劑六廠氫氧化鈉分析純 天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠碳酸鈉分析純 天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠氨水天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠蔗糖 分析純?nèi)樘?分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠糊精 分析純 成都市彭縣麗春化學(xué)廠氨基葡萄鹽酸鹽 分析純 分裝分析純 浙江金殼生物化學(xué)有限公司殼聚糖分析純 上海試劑三廠,.二硝基水楊酸化學(xué)純 中國青島海洋化工集團(tuán)公司薄層層析硅膠化學(xué)純 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司羧甲基纖維素鈉北京五七六零化工廠硫酸鎂 化學(xué)純天津市英博生化試劑有限公司牛肉膏 生化試劑蛋白胨 生化試劑 天津化學(xué)試劑批發(fā)廠. 進(jìn)口分裝生化試劑瓊脂 生化試劑 北京化學(xué)試劑公司指示劑 北京化工廠甲基紅指示劑 上海試劑三廠溴甲酚綠.儀器與設(shè)備儀器名稱 生產(chǎn)廠家循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司電熱恒溫水浴鍋 天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司凱氏定氮儀 天津天波儀器廠天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠電熱鼓風(fēng)干燥箱泰興市龍港玻璃儀器廠烏式粘度計(jì)上?？棛z儀器有限公司消化爐上海精密儀器有限公司精密計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司可見光分光光度計(jì)天津科技人學(xué)碩.:學(xué)位論文系列層析柱. 上海滬西分析儀器有限公司高壓蒸汽