線栓法大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO)制備方法.pdf

1、線栓法大鼠腦缺血再灌注模型制備獻(xiàn)了解方的過程中可能的經(jīng)相信不少神經(jīng)內(nèi)科的研究生都作過或?qū)⒁鞔笫缶€栓模型，都有一個(gè)從查文的感覺）。為了縮短各位將的成功率，我們?cè)敢鈱⒆杂懈畹恼J(rèn)識(shí)，并以其法到跟師兄、師姐學(xué)習(xí)再到自己體會(huì)摸索直至熟練的過程，在模型制作 歷了從模型不成功的郁悶到熟練后成功的喜悅（我們是有這樣要作或剛開始作mcao模型的戰(zhàn)友的摸索過程，提高模型制作 己的經(jīng)驗(yàn)與大家分享，相信各位戰(zhàn)友看過后將對(duì)制作大鼠線栓模型 為樂趣，同時(shí)歡迎各位熟練的戰(zhàn)友與我們交流經(jīng)驗(yàn)。第一部分線栓模型制備理論及經(jīng)驗(yàn)1.插線法局灶性腦缺血模型簡(jiǎn)介八十年代koizumi和longa創(chuàng)用了不開顱的大鼠 mca可逆性腦梗塞

2、模型，此后，應(yīng)用 插線法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的方法不斷改進(jìn)和完善，已漸趨成熟，目前該法已逐漸取代開顱法而成為最流行的方法。該模型先阻斷頸外動(dòng)脈（eca）及其分支，且阻斷翼腭動(dòng)脈（ppa）,以切斷顱外來源的側(cè)副循環(huán)血流。從 eca插入尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈（ica）至ij 大腦前動(dòng)脈（aca ,機(jī)械性阻斷大腦中動(dòng)脈（ mca發(fā)出處的血供來建立大腦中動(dòng)脈缺血 模 型。此模型可在無麻醉狀態(tài)下拔出尼龍線，恢復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。1994年huang等55首次將線栓技術(shù)應(yīng)用于小鼠局部永久性腦缺血模型。1997年hara等56將線栓技術(shù)改進(jìn)后應(yīng)用于小鼠局部暫時(shí)性腦缺血模型。此后不斷有學(xué)者借助于顯微技術(shù)

3、和多功能生理監(jiān)測(cè)手段建立小鼠局部線栓腦缺血模型57,58 o國內(nèi)蔣曉帆等59 ,王芙蓉等60也對(duì)該方法進(jìn)行了研究。線栓法具有不開顱、效果肯定、可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，用于研究神經(jīng)元對(duì)缺血的敏感性、耐受性，藥物療效觀察以及再灌注損害和治療時(shí)間窗較為理想，同時(shí)也具 有對(duì)全身影響小、動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，適于慢性腦損傷的研究?？刂坪靡鬃円蛩?，可避 免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。但線栓造模也并非完美無缺，存在著下列不足：線栓造模過程是 非直視下的手術(shù)，血流是否完全阻斷不能即刻得知。動(dòng)物品系、體重、批次會(huì)影響結(jié)果。動(dòng)物飼養(yǎng)條件好的單位所繁育的動(dòng)物，可以使影響程度降低。操作者的科研訓(xùn)練影響結(jié) 果。 嚴(yán)格

4、的訓(xùn)練和足夠例數(shù)的實(shí)踐可以復(fù)制出穩(wěn)定的結(jié)果。血管破裂出血。操作不小心 極易刺破血管或拔線栓時(shí)引起出血。輕柔、精細(xì)的操作可以減少血管破裂的發(fā)生。2大鼠頸部及顱內(nèi)動(dòng)脈解剖及常用插線位置monofila merit行交通動(dòng)脈小腦上動(dòng)脈乳突泡線栓大腦前動(dòng)脈大腦中動(dòng)脈大腦后動(dòng)脈預(yù)內(nèi)動(dòng)脈刀底動(dòng)脈甲狀腺上動(dòng)脈枕動(dòng)脈頸外劫脈頸總動(dòng)脈舌動(dòng)脈頜外動(dòng)脈用圖，大鼠償?shù)變?nèi)外血管（部分）不成tt附放大模式圖3大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和心得（來自 zhuqing0506 戰(zhàn)友）本人現(xiàn)在正在做線 栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷實(shí)驗(yàn)（mcao模型），這方面的資料我查了一些，這個(gè)實(shí)驗(yàn)我也作了一段時(shí)間，不敢說很專業(yè)了，不過現(xiàn)在基本上我

5、能在15min左右完成手術(shù)，而且手術(shù)過程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。雖然前面有很多前 輩發(fā) 了很多 mcao的很專業(yè)的貼子，不過我覺得比較凌亂，現(xiàn)在我把我的心得體會(huì)和以 前的貼 子的精華部分奉獻(xiàn)給大家，希望這會(huì)對(duì)將要做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的朋友有一絲的幫助。雖然 做實(shí)驗(yàn)總 會(huì)有郁悶的時(shí)候，不過風(fēng)雨之后總會(huì)見到彩虹的，這可以也是我的心得體會(huì)。衷 心祝福大家能把實(shí)驗(yàn)做的成功、完美！ ！ ！ ！ 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備麻醉劑：水合氯醛（應(yīng)較好的控制大鼠體溫）保溫：60w白炙燈高度為 37cm直接照射能使肛溫保持在37 c栓線的制備：1.取熔點(diǎn)為56 c的固體石蠟一塊，在瓷杯中加熱熔化。直徑為 o. 24mm、長(zhǎng)5

6、cm的魚線 一端5mm長(zhǎng)的一段，垂直在熔化的石蠟中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄層石蠟可牢固地粘附在魚線一端的表面，其直徑為 0.26mm。就這樣，普通的魚線即可變成規(guī)相一 致頭端光滑圓鈍的栓線。2.在魚線18mm的位置用涂改液標(biāo)記一個(gè)白色點(diǎn)。ttc的配制：用0.2mol/l磷酸緩沖液（pbs）配成2%ttc溶液（ph7.5 ）,避光保存。體重與栓線直徑：線栓直徑0.24mm 采用的sd大鼠，體重 250-300g 。實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物用10 %水合氯醛（35mg/kg ）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳 突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（ cca）、頸外動(dòng)脈（eca）和頸

7、內(nèi)動(dòng)脈（ica）,在cca遠(yuǎn)心端和近心端及 eca處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉 ica,然后 近心端結(jié)扎 cca、eca。然后在距 cca分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到 ica ,這 時(shí)用繞在cca遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。（不可過緊，否則近線困難，但松了又會(huì)出 血。）用眼科鐐輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當(dāng)插入深度在18 mm 時(shí)（一定要將血管放松至原來狀態(tài)，且保證標(biāo)記點(diǎn)在分叉處，由于標(biāo)記的是白色的所以很容易看的）， 緊緊系牢cca遠(yuǎn)心端的細(xì)線，此時(shí)的關(guān)鍵是動(dòng)作輕柔，不要使 ica有任何的牽拉，否則栓線會(huì)脫出 aca,可能會(huì)造成缺 血失敗。血管外的栓線不要留得過長(zhǎng)，更不要縫在皮外

8、， 大鼠醒來后會(huì)自己拔出。縫合傷口，單籠飼養(yǎng)觀察。如果需要再灌的話，就把拴線抽出即可，因?yàn)槟X底有個(gè)動(dòng)脈環(huán)，結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈大腦不會(huì)缺血的。注意事項(xiàng)：1 .分離時(shí)要層次清楚：正中剪開sd大鼠頸部皮膚，分離皮下結(jié)締組織時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)該組織與頸部?jī)蓚?cè)鼓泡腺體（很多人誤認(rèn)為那是甲狀腺）結(jié)合緊密，因此不必分離過于太細(xì)，直接 在 正中兩側(cè)鼓泡腺體之間分離，這樣能不接觸胸鎖乳突肌而直接暴露頸前頸群且不會(huì)損傷 腺體 造成過多出血。下一步是分開頸前肌群，這時(shí)候要注意用小鉗子作撐開分離動(dòng)作要在 左右肌 肉塊之間而不是一塊肌肉的肌纖維之間，雖然它們看起來很模糊，但這樣能保證不 會(huì)出現(xiàn)較多條索狀細(xì)肌纖維條影響下一步頸內(nèi)動(dòng)脈

9、的尋找與分離，并且能整塊地向一側(cè)牽 開頸前肌群 暴露頸動(dòng)脈鞘。見到頸動(dòng)脈鞘了則要注意細(xì)致分離迷走神經(jīng)，若損傷則可能影 響其呼吸而死亡的。2 .分離血管時(shí)，要盡量將血管剝離的干凈些，這樣在用眼科剪剪口時(shí)就不會(huì)誤剪外膜（誤剪 的話再剪就很容易把口剪大了或者剪斷了，要注意口子越小越好插線），且要剪一個(gè)斜行的 切口（眼科剪與血管約成45度），這樣在血液剛流出時(shí)仍能看上翻的斷口管壁，這樣即容易插入栓線且血管受得了插線時(shí)一定的牽拉。當(dāng)然，切勿牽拉過猛，以免使血管發(fā)生痙 攣，導(dǎo)致栓線不能順利進(jìn)入。3 .注意盡量不要損傷在頸內(nèi)頸外分叉下的交感神經(jīng)節(jié)。4 .如果你用的是中長(zhǎng)效麻醉劑，插線成功后，固定絲線，然后讓

10、其俯臥位，而且稍稍抬高 其頸部，才能確保模型成功。5 .栓線進(jìn)入后頸內(nèi)動(dòng)脈后即可逐漸插入了，有時(shí)候很順利一插到底，但有時(shí)候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因?yàn)樵谘苋腼B穿過顱骨時(shí)有一個(gè)狹窄或者角度。因此，碰上這種明顯阻力時(shí)，一定不能盲目向前使力插，越插栓線前端變形越進(jìn)不去且容易損傷血管。這時(shí)候正確的作法是往外抽出較多栓線，也許會(huì)有一定的動(dòng)脈血流出，不必慌，只要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線角度輕柔的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行最好換根栓線，很可能前 端 也經(jīng)變形角度變了！頸內(nèi)動(dòng)脈的走向?yàn)閮?nèi)上方，可以用眼科鐐夾住魚線插，但進(jìn)去后要注意，別太用力，要不血管就要破了6 .栓線不能在血管里反復(fù)進(jìn)退，否則

11、及容易造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，而且很容易誤解為模 型成功，因?yàn)檫@時(shí)的神經(jīng)功能改變也很明顯，但并不是由于栓塞引起的7 .進(jìn)線時(shí)，使栓線有一定程度的彎曲，且只要保證栓線向屋頂方向彎曲，一般都能將線插 如顱內(nèi)，決不會(huì)進(jìn)入翼腭ao8 .術(shù)后一定要注意保暖。9 .插入線拴要輕柔熟練，速度盡可能快，以避免時(shí)間長(zhǎng)了血管內(nèi)血栓形成。10 .手術(shù)后評(píng)分的主觀因素很大，有用 4分制和11分制的，我個(gè)人認(rèn)為用 4分制比較準(zhǔn)些。其標(biāo)準(zhǔn)是：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，手術(shù)對(duì)側(cè)前指不能完全伸展；2分，向手術(shù)對(duì)側(cè)行走；3分，大鼠成追尾狀運(yùn)動(dòng)。11 .性激素對(duì)腦梗死面積有較大影響，應(yīng)采用單一性別的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。舍去標(biāo)準(zhǔn)：栓線插入

12、深度不足 18 mm,且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠 蛛網(wǎng)膜下腔出血、 mca起始部或其附近的 willis環(huán)動(dòng)脈有凝血塊的大鼠，因?yàn)檫@是出血性腦損傷或永久性腦缺血損傷，而非mcao/reperfusion損傷。3）手術(shù)時(shí)出血較多，癥狀很重的動(dòng)物。死亡原因分析：首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下腔出血，如有出血，表明死 因是插線太深，以后注意插線深度；如無出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的半球水腫，如水腫 嚴(yán)重，則表明死因是腦缺血時(shí)間太重，需要縮短缺血時(shí)間；如既無出血，又無明顯的腦水腫， 那就要注意動(dòng)物狀態(tài)或生活環(huán)境是否太差。附帶的其他說明：1.線拴法存在一定的死亡率

13、。對(duì)于這情況我感覺比較頭疼，也希望高手指點(diǎn)。2 .模型成功率和評(píng)價(jià)指標(biāo)是相關(guān)聯(lián)的矛盾，手術(shù)后可根據(jù)動(dòng)物的表現(xiàn)加以評(píng)分，確定模型是否成功，模型成功與否會(huì)對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)帶來影響。有可能你模型沒成功，結(jié)果判斷為是藥 物的作用效果。所以對(duì)手術(shù)后模型是否成功應(yīng)該進(jìn)行篩選的。另一方面，如果你做了預(yù)防給 藥，藥效的作用也容易被認(rèn)為是模型不成功，這也需要后邊進(jìn)行腦組織染色和組織血檢查進(jìn)行 驗(yàn)證。腦組織檢查時(shí)可剔除模型不成功以及sah的個(gè)例。故實(shí)驗(yàn)在手術(shù)后要進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)腦組織進(jìn)行組織學(xué)檢查或染色。ttc染色是采用的宏觀標(biāo)本染色，確定梗死面積可采用體積法或面積法，但最好用掃描儀將腦組織 切片進(jìn)行掃

14、描，選擇合適的軟件統(tǒng)計(jì)梗死面積。3 .大鼠大腦中動(dòng)脈永久性閉塞性腦缺血模型，梗死體積出現(xiàn)的最小時(shí)間點(diǎn)可能為2h,體積隨時(shí)間進(jìn)行性增大，至 12h基本趨于穩(wěn)定4 .整個(gè)試驗(yàn)是很費(fèi)動(dòng)物的，存在 15-30 %的淘汰率（如果你做的好），但注意嚴(yán)格控制自己 淘汰的動(dòng)物（紀(jì)錄具體情況）。5 .除了剛才說的蛛網(wǎng)膜下腔出血外，還有一些老鼠肺出血明顯，整個(gè)肺暗紅，我也想不出原因，不知道是不是醫(yī)學(xué)臨床所說的腦肺綜合癥6 .在頸內(nèi)和頸外之間常常會(huì)有一個(gè)交通支，其位置也不太相同，一定要萬分小心，我曾經(jīng) 因?yàn)椴恢羞@個(gè)交通支而勿將其破壞，導(dǎo)致大鼠出血不止！4也談大鼠mcao模型的實(shí)驗(yàn)體會(huì)（來自bladeflyer 戰(zhàn)

15、友）我的課題是關(guān)于某藥物對(duì)缺血性神經(jīng)疾病的保護(hù)作用研究，因此對(duì)于動(dòng)物腦缺血模型尤其是mcao模型的制作不得不熟練掌握，于是有了大量郁悶的摸索與重復(fù)勞動(dòng)，也有關(guān)于它的提高與體會(huì)，雖然前面有很多前輩對(duì)于mcao的貼子已經(jīng)很專業(yè)了，但我想也許自己也能有此微弱的閃光讓后面的朋友們感到少許光明和溫暖，哪怕只是一個(gè)愿望，呵呵！關(guān)于大腦中動(dòng)脈缺血模型，目前文獻(xiàn)能查到的有三種制作方法，應(yīng)用手術(shù)的方法和頸內(nèi)動(dòng)脈注射et-1的方法都不如線栓法流行，而我自己的實(shí)驗(yàn)也證明線栓法制作mcao是效果穩(wěn)定并可行的。下面談?wù)勎易约旱囊恍w會(huì)，一家之言僅供參考：一）關(guān)于實(shí)驗(yàn)大鼠的選擇：前面我曾查到一篇貼子談到了大鼠種系選擇，而

16、我自己作過wester鼠和sd大鼠，感覺從解剖層次上看品系上差別并不是太大，或者說對(duì)于造模的影響 還不如大鼠體重的選擇。大鼠體重太輕，對(duì)于缺血及手術(shù)刺激的的耐受能力差容易死亡；而 大鼠體重太大，適應(yīng)能力是強(qiáng)了，但造模的效果卻讓人不放心，因?yàn)橐紤]其血管相對(duì)于直 徑相同的栓線和相同的插入深度來說顯得稍粗，造成血管堵塞不完全而造模缺乏一致性的問題。經(jīng)過一些摸索，最后定在大鼠體重在220280mg之間，感覺不錯(cuò)，造模后用ttc染色觀察梗死面積基本相當(dāng)。二）關(guān)于栓線的選擇：我查到的文獻(xiàn)談到插入的栓線時(shí)一般都只會(huì)籠統(tǒng)提一句魚線或者尼龍線，而對(duì)于栓線直徑則有一定出入，還有文獻(xiàn)談到對(duì)于尼龍線頭進(jìn)行灼燒以保證

17、栓線頂 端不刺傷血管的處理。在實(shí)際的摸索中我強(qiáng)烈地感覺到其實(shí)這栓線的選擇是造模成敗的關(guān)鍵，我先用的直徑 0.24mm的尼龍線，并灼燒線頭，發(fā)現(xiàn)這并不是個(gè)好方案，很難掌握灼燒的火候，線頭常常太大不易進(jìn)入并且該直徑相對(duì)于上面提到的大鼠顯得太粗，于是我又試 了不同的魚線，最后我選擇了直徑0.22mm的火牌進(jìn)口魚線，其韌性比較合適插線，線頭沒有特殊處理只是剪線時(shí)注意不要剪得明顯太尖，最后取腦后觀察幾乎未見明顯血管損傷出血。三）關(guān)于操作技功：實(shí)際上造模的困難主要在于操作時(shí)分離與插線過程中的熟練程度不夠， 因此最根本的辦法是多作幾只老鼠，呵呵，所以我認(rèn)為技巧都是相對(duì)的。1 .分離時(shí)要層次清楚：正中剪開sd

18、大鼠頸部皮膚，分離皮下結(jié)締組織時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)該組織與頸部?jī)蓚?cè)鼓泡腺體（很多人誤認(rèn)為那是甲狀腺）結(jié)合緊密，因此不必分離過于太細(xì)，直接在 正中兩側(cè)鼓泡腺體之間分離，這樣能不接觸胸鎖乳突肌而直接暴露頸前頸群且不會(huì)損傷腺體 造成過多出血。下一步是分開頸前肌群，這時(shí)候要注意用小鉗子作撐開分離動(dòng)作要在左右肌 肉塊之間而不是一塊肌肉的肌纖維之間，雖然它們看起來很模糊，但這樣能保證不會(huì)出現(xiàn)較多 條索狀細(xì)肌纖維條影響下一步頸內(nèi)動(dòng)脈的尋找與分離，并且能整塊地向一側(cè)牽開頸前肌群 暴露頸動(dòng)脈鞘。見到頸動(dòng)脈鞘了則要注意細(xì)致分離迷走神經(jīng)，若損傷則可能影響其呼吸而死 亡的。2 .插線血管的選擇：目前存在兩種插線法，一種是結(jié)扎頸外

19、動(dòng)脈從頸總動(dòng)脈插線，另一種 是結(jié)扎近端頸總動(dòng)脈而從牽拉后的頸外動(dòng)脈插線，我試過后者，頸外動(dòng)脈常常極細(xì)牽拉后容 易拉斷又不好插線，因此我推薦前者，簡(jiǎn)單易行損傷??！那么，就須要在結(jié)扎頸外動(dòng)脈時(shí)盡 量靠近頸內(nèi)外動(dòng)脈血管分叉處，這樣不僅能保證栓線不進(jìn)入頸外動(dòng)脈殘端，并且可以讓使線 節(jié)成為一個(gè)分叉標(biāo)志用于衡量進(jìn)線深度時(shí)用。3 .血管的剪口大?。涸陬i內(nèi)動(dòng)脈血管上剪口是個(gè)細(xì)致活，剪口大小常常成為影響實(shí)驗(yàn)速度 的一個(gè)重要因素，剪口太大時(shí)不僅血管容易斷而且由于血管內(nèi)血液流出太多使剪口處血管壁 粘合在一起，根本找不到插入的開口；而過分小心使剪口太小剛血是看到出來了點(diǎn)但入口也 找不到。我的經(jīng)驗(yàn)是剪一個(gè)斜行的切口（眼

20、科剪與血管約成45度），這樣在血液剛流出時(shí)仍能看上翻的斷口管壁，這樣即容易插入栓線且血管受得了插線時(shí)一定的牽拉。4 .插線時(shí)動(dòng)作輕柔：栓線進(jìn)入后頸內(nèi)動(dòng)脈后即可逐漸插入了，有時(shí)候很順利一插到底，但 有時(shí)候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因?yàn)樵谘苋腼B穿過顱骨時(shí)有一個(gè)狹窄或者角度。因 此，碰上這種明顯阻力時(shí)，一定不能盲目向前使力插，越插栓線前端變形越進(jìn)不去且容易損 傷血管。這時(shí)候正確的作法是往外抽出較多栓線，也許會(huì)有一定的動(dòng)脈血流出，不必慌，只 要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線角度輕柔的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行最好換根 栓線，很可能前端也經(jīng)變形角度變了！四）.最后談?wù)勥M(jìn)線深度。查閱文獻(xiàn)描述關(guān)于插

21、入深度都寫的18.5+/1.5mm ,其實(shí)這深度是要根據(jù)大鼠體重略作調(diào)整的！插線太深絕對(duì)是mcao后大鼠死亡率高的主要原因，很多是死于深插線后血管受刺激蛛網(wǎng)膜下腔出血。因此必須在造模前先將栓線作標(biāo)志，我上在 17mm和20mm處各用記號(hào)筆點(diǎn)上一個(gè)小白點(diǎn)，然后根據(jù)進(jìn)線時(shí)手感控制深度的，一般在 18mm左右，千萬不能到了深度但沒感覺到阻力就仍往里使勁送線，這樣往往要遭遇慘重的 后果的，呵呵！談到mcao死亡率高，我曾解剖過好些個(gè)死鼠，除了剛才說的蛛網(wǎng)膜下腔出血外，還有一 些老鼠肺出血明顯，整個(gè)肺暗紅，我也想不出原因，不知道是不是醫(yī)學(xué)臨床所說的腦肺綜合 癥？后來作得熟練了（單只造模時(shí)間在10分鐘左右

22、），插線深度控制好了，死亡率一般能控制在20%以下，也就沒有注意肺出血了，不知道師兄師姐們有什么認(rèn)識(shí)嗎？ 5我的做mcao模型的一些體會(huì)（來自 intelligentwang 戰(zhàn)友）關(guān)于做mcao模型，我是走了很多彎路的，經(jīng)歷的打擊也是無數(shù)，翻翻前輩們寫的相 關(guān)帖子，已經(jīng)很專業(yè)了，我下面要說的只是一家之言，有些可能還比較幼稚甚至謬誤，僅供 剛剛接觸此實(shí)驗(yàn)的師弟、師妹們參考，希望對(duì)你們有所幫助，不要再重蹈我的覆轍了，也非 常歡迎師兄，師姐們不吝賜教！ ！ 首先：關(guān)于大鼠品系的問題在剛開始練手時(shí)，sd,wister,f344,（雌性、雄性）我都做過，綜合來看：sd的頸部局解最棘手，它的結(jié)締組織、肌

23、肉間隙等較模糊而且聯(lián)系的比較緊密，不容易分離，很費(fèi)時(shí)；wister相對(duì)最容易，尤其是分離頸總動(dòng)脈鞘時(shí)，簡(jiǎn)直勢(shì)如破竹，熟練的話，25分鐘就可以搞定（從手術(shù)開始到縫皮）；f344介于兩者之間，不過感覺有時(shí)也很不好分。同一品系中雌性和雄性在局解上還是有一定區(qū)別的，雄性血運(yùn)更豐富，更容易出血，而雌性只要不剪破甲 狀腺就幾乎很少出血。但是，直到我做了不少大鼠之后，一個(gè)師姐告訴我：做mcao用sd! （ 55555555 ）所以，如果要做mcao的師弟師妹們就不要拿什么大鼠就練什么大鼠了，最好一開始就鎖定sd雄性大鼠，直到練熟為止，因?yàn)椴煌废档拇笫缶纸饪倳?huì)有差異，而且個(gè)別部位手感差異還比 較大，所以從開

24、始練時(shí)就應(yīng)該練以后實(shí)驗(yàn)用的大鼠。第二：關(guān)于麻醉的問題麻醉大鼠具體用藥因各課題組的習(xí)慣不同可能有很多選擇，我一直用的是水合氯醛”（10%）-0.75ml/250g,效果還可以，最大的好處是大鼠蘇醒較快，麻醉時(shí)間基本上是2 2.5小時(shí)，正好做完手術(shù)不久。在這個(gè)方面，最大的體會(huì)是用量一定寧少勿多，先按照規(guī)定劑量注射，如果10數(shù)分鐘過去大鼠依然活潑如?；蛘吒緹o法固定于鼠板上時(shí)，可以補(bǔ)加1/2規(guī)定劑量偏少一些，然后再稍等數(shù)分鐘，做手術(shù)的過程中就盡量不要追加了，實(shí)在不行就隨時(shí) 準(zhǔn)備一個(gè)乙醛棉球，另其短暫麻醉。最好不要多次0.1ml追加，手術(shù)是治病的，麻醉是管命的”相信所有做過動(dòng)物試驗(yàn)的人都有深刻體會(huì)！

25、第三：關(guān)于大鼠存活的問題！這是最讓人頭痛的，每個(gè)新手上路時(shí)幾乎都曾面對(duì)過大鼠接近100 %死亡率的崩潰感受！我是繞了很大一個(gè)圈子才發(fā)現(xiàn)真正核心所在的（以我自己的感受）：那就是進(jìn)線深度問題！通常文獻(xiàn)上不管體重多少的大鼠總是千篇一律的說：18.5+/-0.5mm，所以我就信了，而且往往意猶未盡唯恐大鼠不死似的再稍稍往里進(jìn)那么一點(diǎn)點(diǎn)，結(jié)果可想而知：全死翹翹了！但 我一直不知癥結(jié)何在：無菌操作，肝素肌注，速尿灌胃都用上了，可總沒有明顯改觀，直到有天我嘗試縮短進(jìn)線深度才依稀發(fā)現(xiàn)希望的曙光！我的做法是220g大鼠進(jìn)16-18mm （從分叉處算起），從手感上就是感覺到線剛一突破顱孔再稍稍進(jìn)一點(diǎn)就行了，然后嚴(yán)

26、格控制進(jìn) 線深度。在控制進(jìn)線深度的前提下，再注意無菌操作，把做手術(shù)的器械泡在新潔耳滅溶液中消毒，盡量減少其他因素的干擾。6線栓法大鼠腦缺血再灌注模型（ mcao ）制備技巧（來自ysf2k戰(zhàn)本人從事腦缺血的基礎(chǔ)研究已有15年的歷史，從93年開始研究栓線法大鼠 mcao模型，當(dāng)時(shí)國內(nèi)幾乎還沒人做這方面的工作，遇到困難無人可求。僅燒制栓線這一工作就耗了 近6個(gè)月的時(shí)間，功夫不負(fù)有心人，我終于發(fā)明了一種制備栓線的設(shè)備，可以隨心所欲控制 光滑末端的大小，非常好用，模型的成功率、更死灶的穩(wěn)定性得到極大改善。95年在成都召開的第四屆全國腦血管病會(huì)議上作了大會(huì)發(fā)言，受到同行的極大關(guān)注，同行試用我制 備的栓線

27、后，都給與很高的評(píng)價(jià)。當(dāng)時(shí)沒有一點(diǎn)商業(yè)頭腦，既沒想到開發(fā)銷售這種設(shè)備，也 沒想到將栓線商品化，僅是免費(fèi)贈(zèng)予同行好友，朋友們用得多了不好意思，非要給我點(diǎn)功夫 費(fèi)，推辭不下，也就接了，這反而刺激了我的商業(yè)意識(shí)。目前全國有20多家科研院所曾經(jīng)或正在使用我制備的栓線，如中科院上海神經(jīng)所、協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物所、山東大學(xué)等。所用 材料為市售尼龍線，但不管用什么線，沒有一定技巧和設(shè)備是很難控制栓線的球端大小的。請(qǐng)?bào)w諒我先不作詳細(xì)說明，因?yàn)槲視簳r(shí)還要靠賣雞蛋的錢換來油鹽醬醋，請(qǐng)各位就不要想買我的雞或問雞是如何生蛋的，你只要知道市場(chǎng)上現(xiàn)在有雞蛋可買就行了（email: ）。我會(huì)告訴大家這種

28、 雞蛋”是如何的有營(yíng)養(yǎng)，請(qǐng)看附件圖片 1,如 此光滑的末端，不僅大大減輕了插線對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，降低了刺穿血管的可能性，而且可 以更嚴(yán)密的阻斷從大腦前動(dòng)脈供應(yīng)的來自對(duì)側(cè)的血流，更為可貴的是，因?yàn)榍蚨酥睆綖?.32mm ,插線時(shí)可以非常方便的插到位（附件圖片2）。用240-280g的大鼠，栓塞1h即可造成穩(wěn)定的腦梗死。0.24mm直徑的栓線（光鏡放大 40倍）如何避免栓線插入翼腭 a大鼠仰臥時(shí)，ica從cca分出后下行（向背側(cè)）約 5mm又分為兩支a,即走向乳突泡(mastoidbulla）的翼腭 a和進(jìn)入顱內(nèi)的ica的延伸部分。因?yàn)橐黼?a的走向幾乎和分支前的ica走 向相同，而ica的延伸部

29、分則是改向頭側(cè)走行，所以插線時(shí)會(huì)很自然的進(jìn)入翼腭a,需反復(fù)拔插幾次，碰巧后才能進(jìn)入顱內(nèi)，非常痛苦。最初我干脆將翼腭a也分離，然后夾閉或結(jié)扎翼腭a的起始部，結(jié)果是手術(shù)很難操作，效果也不理想。后來又改用另一方法，即在栓 線將要插入翼腭 a前，用鐐子將ica輕輕往頭側(cè)推一下，使 ica和其延長(zhǎng)的分支成一直線， 同時(shí)順勢(shì)插線，可很容易的進(jìn)入顱內(nèi)。隨著經(jīng)驗(yàn)值的增加，發(fā)現(xiàn)完全可以通過改進(jìn)栓線形狀 達(dá)到目的，即使栓線有一定程度的彎曲，插線時(shí)只要保證栓線向操作者方向彎曲，閉著眼睛 也能將線插如顱內(nèi)，決不會(huì)進(jìn)入翼腭ao如各位試用后感覺不錯(cuò)，請(qǐng)給與鼓勵(lì)，最后我會(huì)告訴大家如何在10分鐘內(nèi)完成模型。如何提高腦缺血的成

30、功率做了幾個(gè)大鼠mcao模型，第二天一看，個(gè)個(gè)活蹦亂跳，毫無腦缺血癥狀，當(dāng)場(chǎng)暈。主要原因是栓線插入深度不夠，即栓線的前端未進(jìn)入大腦前動(dòng)脈（aca）,拴線的粗細(xì)倒是次要的，0.20-0.26mm 均可。因此，保證栓線進(jìn)入 aca并阻斷對(duì)側(cè)來的血流，而又不刺破血管是重中之重。秘訣1:許多文獻(xiàn)報(bào)道插入深度為18.5+-0.5mm （270g左右大鼠），如果按這一標(biāo)準(zhǔn)去做，而不考慮大鼠的個(gè)體差異，后果是缺血的程度參差不齊，很多大鼠會(huì)出現(xiàn)癥狀較輕，甚至無 癥狀。我的建議是當(dāng)插線近18mm （做上標(biāo)記）時(shí)，注意手的感覺，輕緩?fù)七M(jìn)，直至感覺到阻力為止（當(dāng)遇到阻力后，再插線會(huì)見到線彎曲）。可能有人會(huì)說，把血管

31、插破了也未感覺 到阻力或線遇阻后的彎曲。一個(gè)原因是線太硬，另一主要原因是當(dāng)栓線從血管切口插入后為 防止血液從此處流出，需要結(jié)扎一條細(xì)線，這條線結(jié)扎的松緊程度很關(guān)鍵，應(yīng)在不流血的情 況下盡可能的松，這樣你會(huì)發(fā)現(xiàn)進(jìn)線時(shí)很輕松，一旦遇到阻力，就會(huì)感覺到。后者至關(guān)重要， 請(qǐng)?bào)w會(huì)。秘訣2:栓線一旦進(jìn)入 aca,就要把上面提到的那根細(xì)線適度扎緊（ 適度”很重要，會(huì)影響 到再灌流時(shí)大鼠的生死存亡），此時(shí)的關(guān)鍵是動(dòng)作輕柔，不要使 ica有任何的牽拉，否則栓 線會(huì)月出aca,可能會(huì)造成缺血失敗。血管外的栓線不要留得過長(zhǎng)，更不要縫在皮外，大鼠 醒來后會(huì)自己拔出。第二部分線拴模型制作過程1、實(shí)驗(yàn)器材（從左到右）：第

32、一行：干棉球、酒精棉球、10%水合氯醛+注射器、碘伏+棉簽第二行：三種不同粗細(xì)的魚線（魚線最好在2.0、2.5mm處各用記號(hào)筆作好標(biāo)記，便于觀察進(jìn)入距離）、彎盤內(nèi)為手術(shù)器材第三行：記號(hào)筆、自制拉鉤（皮筋+曲別針+大頭針）2麻醉：可用飲料瓶自制捕鼠器（適用于不敢手抓大鼠的），用于打麻藥，根據(jù)大鼠的重量選擇 不同粗細(xì)的飲料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回頭）。效果圖3麻倒后綁在手術(shù)臺(tái)上（皮筋是最好的選擇）4剪去頸前的鼠毛，碘氟消毒。5沿經(jīng)部正中切開皮膚。說明：切開皮膚前最好將結(jié)扎動(dòng)脈的線事先剪好（后面會(huì)用到）。6鈍性分離皮下組織（大鼠腹側(cè)可見事先剪好的結(jié)扎線）7分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，見到頸動(dòng)脈鞘后可上拉鉤。8分離動(dòng)脈鞘9分離出頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈，注意中間那根線不要系緊，用 來插魚線時(shí)防止出血的。10夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，用眼科剪將動(dòng)脈剪一小口。11插入魚線，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈后按圖中注釋方法插(成功率在90%以上)。說明：(1)這一步魚線選擇是關(guān)鍵，根據(jù)大鼠重量(作的多了后根據(jù)動(dòng)脈粗細(xì)就可選擇了)選魚線。我們的經(jīng)驗(yàn)是：250g以下的選0.26mm的線，250-300g的選0.26mm蘸臘的或0.28的都