畢業(yè)論文《犬傳染性肝炎病毒的診斷和防治》

1、浙江大學(xué)遠程教育學(xué)院 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）題 目 犬傳染性肝炎病毒的診斷和防治專 業(yè) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)習中心 杭州農(nóng)機學(xué)校姓 名 學(xué) 號 710301392029指導(dǎo)教師 （教師） 2012 年 10 月 11 日 l 摘 要 犬傳染性肝炎病毒又名犬腺病毒 i 型或羅巴斯病病毒，屬腺病毒科。該病的傳染源主要是病犬和康復(fù)犬。病犬通過分泌物（唾液、尿液等）向外排毒。病毒經(jīng)鼻咽、口及黏膜進入體內(nèi)。本病發(fā)生無明顯季節(jié)性，常見于 1 歲以內(nèi)的幼犬，大多數(shù)成年犬呈隱形感染。隨著寵物行業(yè)的發(fā)展，伴侶動物數(shù)量的增加，以及動物的活動范圍不斷擴大，相互交叉日益頻繁，該病的診治越來越受到業(yè)內(nèi)外人士的重視。本文主要通過觀

2、察該病的臨床特征、病理變化；對疑似病犬抽血，進行elisa 法的檢測，對該病的診治和預(yù)防做進一步的探討。關(guān)鍵詞：犬傳染性肝炎，診斷，防治，elisa法 l 目 錄前 言1一、犬傳染性肝炎病毒的概述1二、流行特點1三、發(fā)病原因和機理1四、犬傳染性肝炎病毒的臨床癥狀1五、實驗室具體方法的診斷2 （一）實驗動物2 （ 二） 實驗 儀器 和 試劑 2 （三）elisa法檢測和結(jié)果分析2 （四）診斷4六、病理分析治療5 （一）病理分析5 （二）治療5 （三）治療心得6七、鑒別診斷7 （一）與犬瘟熱的鑒別診斷7 （二）犬傳染性肝炎與犬細小病毒病的鑒別診斷8 （三）犬傳染性肝炎與犬冠狀病毒感染的鑒別診斷8

3、（四）犬傳染性肝炎與犬輪狀病毒感染的鑒別診斷8八、總結(jié)體會8九、參考文獻9 l 犬傳染性肝炎病毒的診斷和防治 引言 犬傳染性肝炎病毒infections canine hepatitis virus：簡稱ichv屬腺病毒科、哺乳動物腺病毒屬成員。來自世界各地的毒株抗原性都相同。本病毒為犬病毒i型病毒，與1962年發(fā)現(xiàn)的犬腺病毒ii型病毒toronto a2616l株在補體結(jié)合、血細胞凝集、中和抗原以及致病性方面都不同，但在免疫上能交叉保護，一般以犬腺病毒i型病毒為主。本文主要通過觀察該病的臨床特征、病理變化；對疑似病犬進行elisa法確診檢測，對該病診治和預(yù)防做進一步地研究。一、犬傳染性肝炎病

4、毒的概述 犬傳染性肝炎最早于1947年由rubarth發(fā)現(xiàn)， 是由犬i型腺病毒引起的犬的一種急性高度接觸傳染性敗血性的傳染病，以循環(huán)障礙、肝小葉中心壞死以及肝實質(zhì)和內(nèi)皮細胞出現(xiàn)核內(nèi)包涵體為特征。犬傳染性肝炎病毒呈二十面體立體結(jié)構(gòu)，無囊膜。其基因組為單分子的、線狀雙鏈dna結(jié)構(gòu)，長36-38kb。末端有一個共價相聯(lián)的55 ku終端蛋白tp，末端蛋白與病毒的感染性有關(guān)，存在末端蛋白的病毒dna可使其感染性提高100倍。犬傳染性肝炎病毒通過其纖突球部與敏感細胞膜上的特異性受體結(jié)合后，即開始了感染過程。二、流行特點 本病流行廣泛，各季均可發(fā)生，不分年齡和性別，但以1歲以內(nèi)的幼齡犬多發(fā)，尤其以2、3月齡

5、最易感。本病發(fā)病率高。病死率25一40不等。病愈犬可取得終身免疫，但仍帶毒并從尿中排毒可達6-9個月之久。病犬和康復(fù)犬是本病的主要傳染源，病毒隨病犬的嘔吐物、唾液、糞便、尿液等分泌物和排泄物排出體外，污染食品、飲水、用具和周圍環(huán)境，健康犬經(jīng)過經(jīng)消化道而感染，也有經(jīng)過胎盤感染的。三、發(fā)病原因和機理 本病的發(fā)病原因主要有兩方面：一方面因為病毒毒力過強，超過了機體的正常抵御能力另一方面是因為機體自身免疫力低下，存在免疫缺陷或免疫抑制。犬傳染性肝炎病毒通過其纖突球部與敏感細胞膜上的特異性受體結(jié)合后， 即開始了感染過程病毒通過扁桃體和小腸上皮經(jīng)由淋巴和血液廣泛散播。肝臟是受損害的首要部位。病毒可侵入眼而

6、引起虹膜睫狀體炎和角膜水腫。四、犬傳染性肝炎的臨床癥狀 幼犬和成犬的臨床表現(xiàn)各不相同。 一般幼犬以最急性和急性表現(xiàn)居多， 往往突然發(fā)病，精神沉郁，嘔吐、腹瀉，嘔吐物為黃色粘液，大便帶血，并伴有劇烈腹痛，體溫41左右，臨死前下降，8 小時左右死亡。 成年犬則以急性和慢性表現(xiàn)居多，病程稍長，表現(xiàn)食欲減退，直至廢絕，愛飲水。眼鼻周圍白色的分泌物增多，流涕、精神萎靡，心跳、呼吸加快，體溫在40以上，高達415。步態(tài)不穩(wěn)，拱背縮腰，觸診肝部有疼痛、呻吟。時有l(wèi)嘔吐腹瀉癥狀，便中帶血，可視粘膜蒼白。病程l2周。有的病犬，可見有貧血、黃疸、咽炎、扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大，角膜混濁，由中心向四周擴散，常在l-2天

7、內(nèi)為淺藍色膜所覆蓋，輕者23天后可不治而愈，重者可造成角膜穿孔，并伴有水腫、眼睛半閉，流有大量漿液性分泌物，即所謂的“藍眼”病變。肝性藍眼50以上病例一般于高熱期過后1星期左右， 患犬單眼或雙眼出現(xiàn)角膜渾濁現(xiàn)象，常呈白色或藍白色角膜翳，多數(shù)覆蓋全眼。有的病犬狂躁不安，邊叫邊跑，一般持續(xù)23天。部分成年犬，發(fā)病時僅表現(xiàn)輕度發(fā)熱，食欲不振，或貧血，流涕，便秘與腹瀉交替，沒有其他明顯癥狀。五、實驗室具體方法的診斷（一）實驗動物： 疑似 ichv 感染犬（杭州市畜牧獸醫(yī)局動物疫病實驗室開展實驗）（二）實驗儀器和試劑： 離心機（日本selecta.s.a公司 medifiger-bl） ； 酶聯(lián)檢測儀（

8、芬蘭 labsystem 354）； 微量加樣器（美國thermo，容量50ul-200ul） ； 37恒溫恒濕箱（美國 shellab 164l）； 犬傳染性肝炎病毒診斷試劑盒（上海豐翔科技生物有限公司提供） 試劑盒組成 96 孔配置 保存 說明書 1份 封板膜 2 片（96） 密封袋 1個 酶標包被板 196 2-8保存 陰性對照 0.5ml1 瓶 2-8保存 陽性對照 0.5ml1 瓶 2-8保存 酶標試劑 6 ml1 瓶 2-8保存 樣品稀釋液 6 ml1 瓶 2-8保存 顯色劑 a 液 6 ml1 瓶 2-8保存 顯色劑 b 液 6 ml1 瓶 2-8保存 終止液 6ml1 瓶 2-

9、8保存 濃縮洗滌液 （20ml30 倍）1 瓶 2-8保存（三）elisa法檢測和結(jié)果分析 1、 血清樣本的采集 犬的采血部位位于前肢內(nèi)側(cè)皮下頭靜脈（該血管位于前肢腳爪上方背側(cè) 正前位）或后肢外側(cè)小隱靜脈該靜脈血管從后肢外踝后側(cè)走向外上側(cè)。l 助手固定犬后，在采血部位剪毛，消毒。用左手拇指和食指握緊剪毛區(qū)上 部，使下肢靜脈充盈，用消毒 7 號針頭迅速穿刺入靜脈，讓靜脈血自然流 下。 將新鮮血液置于離心管內(nèi)。放入離心機中，離心2000 rpm10min，吸取 血清備用。 2、 elisa 法檢測原理和步驟 實驗原理：用純化的傳染性犬肝炎病毒ichv抗體包被微孔板，制成固 相抗體，可與樣品中傳染性

10、犬肝炎病毒ichv相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的 抗原和其他成分后再與 hrp 標記的傳染性犬肝炎病毒ichv抗體結(jié)合，形成 抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 tmb 顯色。tmb 在 hrp 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（od 值），與 cutoff 值相比較，從而判定標本中傳 染性犬肝炎病毒ichv的存在與否。 步驟： 1 編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照 2 孔、陽性對照 2 孔、空白對照 1 孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 。 2 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、

11、陽性對照 50l。然后在 待測樣品孔先加樣品稀釋液 50l，然后再加待測樣品 10l。加樣將樣品 加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3 溫育：用封板膜封板后置 37溫育 30 分鐘。 4 配液：將 30 倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用。 5 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。 6 加酶：每孔加入酶標試劑 50l，空白孔除外。 7 溫育：操作同 3。 8 洗滌：操作同 5。 9 顯色：每孔先加入顯色劑 a 50l，再加入顯色劑 b 50l，輕輕震蕩混 勻，37避光顯色 15 分鐘。 10 終止：每孔加終

12、止液 50l，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色） 。 。 11 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（od 值） 測 定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。l 3、 結(jié)果分析 od值結(jié)果圖 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a 0.0012 b 1.0894 c 1.1323 d 0.1276 e 0.0685 f 0.4428 g 0.4937 h 試驗有效性：陽性對照孔平均值1.00；陰性對照平均值0.10，其中 b1、c1 孔位陽性對照孔，平均值為 1.1108gt1.00；d1、e1 孔為陰性對照 孔，平均值為 0.098lt0.10；說明該實驗有效。

13、 臨界值（cut off）計算：臨界值陰性對照孔平均值0.15，根據(jù)公式， 求的：臨界值0.0980.150.25 陰性判定： 樣品 od 值lt 臨界值（cut off）者為傳染性犬肝炎病毒ichv 陰性 陽性判定：樣品 od 值 臨界值（cut off）者為傳染性犬肝炎病毒ichv 陽性 根據(jù)f1、g1檢測值求平均為0.48gt0.25因此檢測結(jié)果呈陽性。（四）診斷 1、犬傳染性肝炎病毒的一般診斷 根據(jù)特征性臨床癥狀如體溫呈高熱，胃寒不食，非常饑渴，愛飲水，眼鼻流水樣液體，嘔吐時會突出帶血的胃液，糞便呈現(xiàn)果醬樣血便、劍狀軟骨部位腹痛、可視粘膜蒼白，牙齒周圍出血或有血腫等，再結(jié)合流行病學(xué)和病

14、理變化的特點，可以作出初步診斷。 2、犬傳染性肝炎病毒試劑盒診斷 根據(jù)臨床癥狀及一般檢查作出初診后，疑為ichv感染的病犬，用elisa法做進一步診斷。對于未接種過ichv疫苗的犬，如elisa法檢測呈陽性，基本可以判定為ichv感染犬。如接種過ichv疫苗的犬，還需采集病犬的血液，做病毒分離鑒定試驗，如為陽性結(jié)果，方可最終判定。l 六、病例分析與治療 （一） 病例分析 品種：德國牧養(yǎng)犬 年齡：2 歲 體重：35 公斤 性別：雄性；未免疫 主訴：前幾日長途驅(qū)車，送其至狗場配種，歸來時，氣溫突然下降，導(dǎo)致就診前 2 天出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象并伴有少量血便，怕冷，精神沉郁，食欲欠佳、飲欲增加，并伴有輕度嘔吐

15、現(xiàn)象； 臨檢：體溫39.7 ，齒齦有散在出血點；眼、鼻有稍許漿液性分泌物，右眼角膜渾濁且伴有淡藍色薄膜覆蓋，觸壓腹壁緊張且肝區(qū)有疼痛感。根據(jù)以上發(fā)病情況及臨床癥狀，將此犬所患疫病初步診斷為犬傳染性肝炎。采血，用elisa法檢測結(jié)果呈陽性，確診為犬傳染性肝炎。 經(jīng)診斷確定該犬患病為：犬傳染性肝炎，對該犬進行隔離治療。 （二）治療：抗病毒，配合特異性療法和對癥治療，防治繼法感染。20108.14 1、犬五聯(lián)血清 5 ml im 抑制病毒繁殖和擴散。 2、25葡萄糖 300 ml、維生素 b1：500 mg、維生素 b2：10 mg、維生素 b6：10 mg、維生素 b12：50 mg、維生素 k1

16、：20 mg、鏈霉素鈉 0.5g ivgtt 補充能量和營養(yǎng)防止寄發(fā)感染。 3、25葡萄糖 50 ml、林格氏液 50ml、氨基酸 40 ml iv am 4、25葡萄糖 50 ml、林格氏液 50ml、氨基酸 40 ml iv pm 糾正水及電解質(zhì)紊亂，強腎。 5、復(fù)方氨林巴比妥 2 ml sc退熱、鎮(zhèn)痛。 6、維生素 b1 片、維生素 b2 片、維生素 b6 片、維生素 b12 片及維生素 c 片各 2 片次 bid po，口服補充維生素增加免疫力。 7、10 慶大霉素注射液 2ml 02 利多卡因注射液 2ml 0 . 2 地塞米松注射液 2ml sig：混合后，tid 滴眼，治療角膜混

17、濁。2010.8.15 第 2 天觀察，鼻鏡干燥，眼鼻流水樣液體，多次排便，嘔吐 2 次，愛喝水，精神不佳，食欲不振，體溫 39.2。 增加硫辛酸 30 mg 靜滴，防止氧化應(yīng)激。增加復(fù)合維生素 b 2 ml 皮下注射，提高肝細胞功能。2010.8.16 第 3 天情況與第 2 天類似，繼續(xù)用相同的處方。l2010.8.17 第 4 天觀察：排便 1 次，未見嘔吐，精神有所好轉(zhuǎn)，體溫 38.9. 因為精神有所好轉(zhuǎn)，排便正常，不再嘔吐，不再發(fā)燒，停止靜滴和靜注葡萄糖，停用注射退燒藥，改用維生素 b1：500 mg、維生素 b2：80 mg、維生素 b12：30 mg、復(fù)合維生素 b ：2 ml、

18、醋酸潑尼松龍 2 ml 皮下注射，提高機體免疫力和肝細胞功能，增加醋酸潑尼松龍，消炎。2010.8.18 第 5 天觀察：精神明顯好轉(zhuǎn)，未見排便，未見嘔吐，體溫 38.5。 停止注射血清，其他同前一天。 在治療第 4-5 天有少量進食，病情明顯好轉(zhuǎn)。飲水量正常，喂了一些流食，如骨頭湯，雞蛋湯。繼續(xù)采取上述特異療法、對癥療法及口服維生素 1 周等綜合療法治療 1 周，病犬基本痊愈。 （三）治療心得 1、診斷關(guān)鍵是觀察病犬眼部的變化，角膜是否混濁，但不是唯一標準。 犬傳染性肝炎又名“藍眼病” ，可見觀察其眼部的變化，是診斷該病的關(guān)鍵所在。初期，一般有水樣鼻液和眼淚，1-2 天后，角膜會渾濁，其特點

19、是中心向四周擴散，之后 1-2 天，會有淺藍色膜所覆蓋。該犬體溫在 40以下，可見高熱期過后，出現(xiàn)藍眼癥狀機率比較大。但對于一些急性感染犬，并不一定會出現(xiàn)“藍眼”癥狀，可以觸診肝區(qū)是否有疼痛表現(xiàn)；觀察面部、頸下和腹部是否出現(xiàn)皮下水腫癥狀；觀察是否進食少，飲水多；或做進一步實驗室診斷來鑒別。 2、elisa 法鑒定時必須控制室內(nèi)溫度。 在用 elisa 法進行鑒定的過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)吸光度值過低的情況，嚴重影響了檢測的結(jié)果。原因是酶的活化溫度不夠，導(dǎo)致催化效應(yīng)不顯著，顯色反應(yīng)不完全。因此試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，必須在室溫 25-30平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條

20、應(yīng)裝入密封袋中保存。若濃洗滌液有結(jié)晶析出， 也是溫度不夠所致，稀釋時可在水浴中加溫助溶， 洗滌時不影響結(jié)果。 3、治療關(guān)鍵是抗病毒，防止繼發(fā)感染。 用犬傳染性肝炎高免血清， 抑制病毒的繁殖和擴散。為防止繼發(fā)感染可用廣譜抗生素進行治療。本病例中，采用了鏈霉素鈉靜滴，防止繼法感染。治療過程中，初期病犬基本不進食，須靜注葡萄糖補充能量。由于該病侵害肝細胞肝臟不能正常合成蛋白質(zhì)，導(dǎo)致血液中蛋白質(zhì)含量下降，血漿膠體滲透壓降低，容易引起水腫，因此要節(jié)制飲水，靜注腎用氨基酸，強腎排尿。肝臟的損傷同時也抑制了肝糖元的正常合成，致使血糖下降出現(xiàn)低血糖癥，治療中用葡萄糖、維生素 b類配合輸液具有很好保肝，提高血漿

21、晶體滲透壓的作用。后期用復(fù)合維生素 b，對恢復(fù)肝細胞功能有較好輔助作用。輸液時一定要注意速度的控制，防止嘔吐等l不良輸液反應(yīng)。 4、急慢性的轉(zhuǎn)化處理。 對于急性病例，治療重點是保護肝臟功能，促進肝臟細胞的再生過程；當急性肝病轉(zhuǎn)為慢性時，治療的重點則變?yōu)榫S持肝臟的代謝能力，控制和預(yù)防并發(fā)癥，防止病情繼續(xù)惡化。 5、病例的啟示 根據(jù)以往的接診經(jīng)驗，犬傳染性肝炎多見于 l 歲以內(nèi)的幼犬，而成犬一般感染表現(xiàn)不明顯。但通過此次病例，對成犬傳染性肝炎的發(fā)病，應(yīng)引起足夠的重視，以免因誤診導(dǎo)致疫情在更大的范圍內(nèi)傳播。至于該病例是否是因犬傳染性肝炎病毒發(fā)生變異、毒力增強所致，需進一步研究。七、鑒別診斷 在臨床上

22、，犬傳染性肝炎與犬瘟熱、犬細小病毒病、犬冠狀病毒感染、犬輪狀病毒感染等傳染病具有共同的臨床癥狀表現(xiàn)：精神沉郁，食欲不振或廢絕，嘔吐，腹瀉并帶有粘液和血液，脫水，消瘦等癥狀，且常發(fā)生混合感染，給診斷工作帶來困難。因此，我們只有必須根據(jù)它們的各自特殊典型癥狀，才?蘢鞒鱟既返募鷲鋃稀?（一）犬傳染性肝炎與犬瘟熱的鑒別診斷 犬傳染性肝炎和犬瘟熱極易相混淆，兩者開始都有類似感冒癥狀和腹瀉，但也有區(qū)別。犬瘟熱體溫呈雙向熱型，病初體溫升高到 40左右，眼鼻有卡他性或弄醒分泌物，羞明，流淚，打噴嚏，咳嗽，呼吸困難，鼻鏡干燥龜裂，食欲廢絕，嘔吐。糞便中帶有粘液或血液，有異臭味，有的犬腹下、四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)濕疣性皮炎

23、，足墊高度角質(zhì)化。神經(jīng)癥狀：強制運動，全身強直性振發(fā)性痙攣，下頜、膀胱和直腸麻痹、感覺喪失，伴有癲癇狀驚厥和昏迷。而傳染性肝炎中則沒有上述的典型癥狀，傳染性肝炎最急性表現(xiàn)為體溫呈高熱，體溫曲線呈“馬鞍”型變化，胃寒不食，非常饑渴，愛飲水，眼鼻流水樣液體，嘔吐時會突出帶血的胃液，糞便呈現(xiàn)果醬樣血便，若慢性時下痢和便秘交替。劍狀軟骨部位腹痛?？梢曊衬どn白，乳齒周圍出血或有血腫。扁桃體急性炎癥、腫大。心博動增強，呼吸加快，有蛋白尿?；謴?fù)期的病犬，會出現(xiàn)一過性角膜混濁。 與犬瘟熱相比，傳染性肝炎無呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀，據(jù)此做鑒別診斷。 （二）犬傳染性肝炎與犬細小病毒病的鑒別診斷 犬細小病毒病主要有腸炎型和心肌炎型兩種。腸炎型主要為出血性腹瀉，先嘔吐，后腹瀉。糞便呈番茄醬色，帶有血液和膠凍狀粘液。繼法感染時，體溫升到 40-41，之后 1-2 天內(nèi)迅速脫水，體質(zhì)極度衰弱。心肌炎型，經(jīng)常會出現(xiàn)心肌衰竭，呻吟，干咳，可視粘膜發(fā)紺，呼吸非常困難。 與細小相比，兩者都有出血性腹瀉癥狀，但是細小病毒感染不見牙齦出血點l斑，不見腹部龐大，據(jù)此作出鑒別診斷。 （三）犬傳染性肝炎與犬冠狀病毒感染的鑒別診斷 犬冠狀病毒感染，會出現(xiàn)精神沉郁，食欲廢絕，嗜睡，衰弱，持續(xù)數(shù)日嘔吐后開始腹瀉。糞便由糊狀變至水樣，呈橙色到綠色，腸粘膜脫落，偶有血液。迅速脫水，消瘦，常在 1-2 天