微生物的生長(zhǎng)和控制第一節(jié)測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法

1、第七章 微生物的生長(zhǎng) 及其控制 生長(zhǎng)和繁殖是保證 微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提。 生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體 體積擴(kuò)大的生物學(xué)過(guò)程。 生長(zhǎng)（growth）： 生物個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段，通過(guò)特定方式產(chǎn)生新的 生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過(guò)程。 繁殖（reproduction）： 生長(zhǎng)是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過(guò)程， 繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變過(guò)程。 在高等生物里這兩個(gè)過(guò)程可以明顯分開(kāi)， 但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小， 這兩個(gè)過(guò)程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過(guò)程。 生長(zhǎng)和繁殖 群體生長(zhǎng) = 個(gè)體生長(zhǎng) + 個(gè)體繁殖 個(gè)體生長(zhǎng) 個(gè)體繁殖 群體生長(zhǎng) 在一定時(shí)間和條件下細(xì)

2、胞數(shù)量的增加（微生物群體生長(zhǎng)） 微生物生長(zhǎng): 在微生物學(xué)中提到的“生長(zhǎng)”，一般均指群體生長(zhǎng)，這一點(diǎn)與 研究大生物時(shí)有所不同。 第一節(jié) 測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法 單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化 微生物生長(zhǎng)： 微生物生長(zhǎng)的測(cè)定： 個(gè)體計(jì)數(shù) 群體重量測(cè)定 群體生理指標(biāo)測(cè)定 評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響； 評(píng)價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果； 客觀地反映微生物生長(zhǎng)的規(guī)律； 一、測(cè)生長(zhǎng)量 測(cè)定生長(zhǎng)量的方法很多，適用于一切微生物。 （一）測(cè)生長(zhǎng)量直接法 （二）測(cè)生長(zhǎng)量間接法 （一）測(cè)生長(zhǎng)量直接法 測(cè)體積法：粗放型，在刻度離心管中測(cè)沉降量 稱干重法：精確型，

3、離心法和過(guò)濾法獲得菌體細(xì)胞， 微生物的干重一般為其濕重的10102020。 測(cè)定多細(xì)胞及絲狀真菌生長(zhǎng)情況的有效方法 1.1.測(cè)體積：在刻度離心 管中離心，測(cè)定沉淀多 少來(lái)確定微生物的生長(zhǎng) 情況。 2.2.測(cè)干重： 將細(xì)胞培養(yǎng)液離心 或過(guò)濾后，洗滌除去培養(yǎng)基成分 后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?100105干燥箱烘干或低溫低 壓干燥（6080）至恒重后， 稱重。 若是固體培養(yǎng)物，可先加熱 溶解瓊脂， 然后過(guò)濾出菌體， 洗滌、干燥后再稱重。該法適合 于單細(xì)胞和多細(xì)胞微生物的生長(zhǎng) 測(cè)定。 （二）測(cè)生長(zhǎng)量間接法 1.1.比濁法 用分光光度法對(duì)無(wú)色的微生物懸浮液進(jìn)行 測(cè)定，一般選用450450650650nm

4、nm波段。 實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與 光密度成正比的線性范圍內(nèi)， 否則不準(zhǔn)確。 在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度 （optical density, 即O.D.）表示菌量。 若要連續(xù)跟蹤某一培養(yǎng)物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，可用帶有 側(cè)臂的三角燒瓶作原位測(cè)定，即不必取樣。 2.2.生理指標(biāo)法 樣品中微生物數(shù)量多或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯， 因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等 設(shè)備來(lái)測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。 微生物的生理指標(biāo)，如氮、碳、DNA、ATP等物質(zhì) 的含量，呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等與其群 體的規(guī)模成正相關(guān)。 常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測(cè) 一種特定的微生物，每一個(gè)細(xì)胞中的A

5、TP濃度幾 乎是一個(gè)常數(shù)，所以測(cè)定這種微生物的ATP含量，即 可知其細(xì)胞數(shù)。 已知細(xì)胞數(shù)的微生物樣品 測(cè)定ATP含量 測(cè)定未知細(xì)胞數(shù)的 微生物樣品的ATP含量 換算出每個(gè)細(xì)胞所含的ATP量 即可算出未知樣中細(xì)胞數(shù) 二、計(jì)繁殖數(shù) 測(cè)定繁殖，一定要一一計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目。 單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌 放線菌和霉菌等絲狀生長(zhǎng)的微生物 計(jì)算其孢子數(shù) 計(jì)算細(xì)胞個(gè)體的數(shù)目 link1 （一）計(jì)繁殖數(shù)直接法 （二）計(jì)繁殖數(shù)間接法 （一）計(jì)繁殖數(shù)直接法 1. 計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法 指采用計(jì)數(shù)板（細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板）， 在光學(xué)顯微鏡下直接觀察微生物細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的 方法。 （計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量） 采用

6、血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞個(gè)數(shù) 缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察； 2. 染色后活菌計(jì)數(shù)法 采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色，然后用光學(xué)顯 微鏡計(jì)數(shù)的方法?？煞謩e對(duì)活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。 例：美藍(lán) 酵母 活細(xì)胞無(wú)色 死細(xì)胞藍(lán)色 Eg. 細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察 活細(xì)胞橙色熒光 死細(xì)胞綠色熒光 將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測(cè)細(xì)胞 細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比 例直接推算待測(cè)微生物細(xì)胞濃度。 4. 過(guò)濾計(jì)數(shù)法 當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、 海水或飲用水等樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后

7、將濾膜干燥、 染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上 （或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。 3. 比例計(jì)數(shù)法 （二）計(jì)繁殖數(shù)間接法 是一種活菌計(jì)數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在液體培 養(yǎng)基中會(huì)使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的 原理而設(shè)計(jì)。 最常用的是菌落計(jì)數(shù)法（colony-counting methods）。 1. 平板菌落計(jì)數(shù)法 可用澆注平板（pour plate）或涂布平板 （spread plate）等方法進(jìn)行。此法適用于各種 好氧菌或厭氧菌。 采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確， 否則難以得到正確的結(jié)果。 樣品充分混勻； 每支移液管及涂布棒只能接觸 一個(gè)稀釋度的菌液； 同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平 均值； 每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適， 便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)； 一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中 一般用 菌落形成單位（colony forming units， CFU）來(lái)表示， 而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。 根據(jù)每皿上形成的CFU數(shù)乘上稀釋度可推算出菌 樣的含菌數(shù)。此方法最為常用，但操作較繁瑣且要求 操作者技術(shù)熟練缺點(diǎn)。 國(guó)外出現(xiàn)了微型、快速、商品化的用于菌 落計(jì)數(shù)的小型紙片或密封瓊脂板。原理是利 用加在培養(yǎng)基中的活菌指示劑TTC（2，3，5 氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小是 就染成易于辨認(rèn)的玫瑰色。 2. 膜