(項(xiàng)目管理)項(xiàng)目名稱重要親源分子對胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控首席科學(xué)家

1、項(xiàng)目名稱：重要親源分子對胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控首席科學(xué)家：孟安明 清華大學(xué)起止年限：2011.1 至 2015.8依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)1.總體目標(biāo)人類和脊椎動物的生命周期起始于受精卵胚胎的早期發(fā)育， 對該過程的深入 了解對于優(yōu)生優(yōu)育、 人類健康和醫(yī)學(xué)、 畜禽生產(chǎn)、 物種保護(hù)等都有重要的潛在價 值。本項(xiàng)目將穩(wěn)定一支高學(xué)術(shù)水平的研究團(tuán)隊， 充分利用斑馬魚、 爪蛙和哺乳動 物細(xì)胞系等研究系統(tǒng)的優(yōu)勢和互補(bǔ)性， 重點(diǎn)研究母源和父源因子， 研究它們在胚 胎卵裂、體軸決定、胚層形成、細(xì)胞分化與遷移等過程中的作用，深入了解它們 發(fā)揮功能的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 從而更全面、 系統(tǒng)地認(rèn)識脊椎動物早期胚胎發(fā)

2、育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 在相關(guān)領(lǐng)域取得一些理論、 方法和技術(shù)突破， 促進(jìn)我國基礎(chǔ) 醫(yī)學(xué)和生殖、代謝、干細(xì)胞相關(guān)疾病等領(lǐng)域的發(fā)展；培養(yǎng)高水平研究人才，形成 能夠持續(xù)進(jìn)行創(chuàng)新性研究的能力；促進(jìn)我國發(fā)育生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展。2.五年預(yù)期目標(biāo)在五年的實(shí)施過程中， 本團(tuán)隊將圍繞設(shè)定的關(guān)鍵科學(xué)問題， 從分析胚層的決 定和分化、卵母細(xì)胞及早期卵裂的周期控制以及干細(xì)胞分化潛能的控制等生物學(xué) 現(xiàn)象入手，實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo)：1）鑒定一批脊椎動物母源因子，明確數(shù)個因子在早期胚胎胚層誘導(dǎo)和分化 中的作用， 認(rèn)知中囊胚轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理； 發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新的信號通路或新的信 號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，加深對早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識。2）鑒定一批

3、脊椎動物父源特異性 RNA ，有可能突破性地發(fā)現(xiàn)父源 RNA 在 胚胎早期發(fā)育中的普遍作用和特異性作用及其機(jī)理。3）了解已知的幾個多能性因子在胚層形成和分化中與母源胚層決定信號之 間的調(diào)控關(guān)系，探索數(shù)個母源或父源因子在干細(xì)胞多能性和定向分化中的作用。4）建立新的母源和父源因子鑒定和功能研究技術(shù)，完善相應(yīng)當(dāng)研究平臺。5）發(fā)表高影響因子文章 510 篇；在國際主流期刊上發(fā)表論文 50 80 篇6）培養(yǎng)可持續(xù)發(fā)展的學(xué)術(shù)梯隊： 博士后、副研究員 10-12 名；博士生 40-50 名；技術(shù)支持人員 8-10 名三、研究方案總體研究方案1學(xué)術(shù)思想本項(xiàng)目的中心學(xué)術(shù)思想是以斑馬魚和爪蛙為模式生物， 輔以哺乳

4、動物胚胎干 細(xì)胞研究系統(tǒng)， 從分子、 細(xì)胞和胚胎整體水平闡述胚胎早期發(fā)育過程中， 預(yù)存于 卵子和精子中的親源分子在胚層發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制， 著力于未知親源分子 的鑒定、發(fā)育功能分析、 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制分析和對細(xì)胞信號通路的新的調(diào)控機(jī) 制的探索。2技術(shù)路線本項(xiàng)目將利用斑馬魚和爪蛙兩種模式動物的優(yōu)勢， 采用反向遺傳分析和正向 遺傳分析的策略， 鑒定與胚層形成相關(guān)的母源和父源因子， 然后利用已有的基因 表達(dá)、功能和機(jī)制研究技術(shù)手段， 探討這些因子在早期發(fā)育中的功能和作用機(jī)制。在利用正向遺傳學(xué)方法研究斑馬魚母源因子對胚層誘導(dǎo)和分化的影響方面， 我們利用 Tol2 轉(zhuǎn)座子插入法捕獲母體基因， 當(dāng)轉(zhuǎn)座

5、子基因組（含 GFP 報告基因） 插入到一個母體基因內(nèi)時， GFP 報告基因的表達(dá)將受該母體基因啟動子的控制， 因而在卵母細(xì)胞中可觀察到 GFP的存在；通過Tail - PCR、inverted PCR、RACE 等方法，可以比較容易地克隆出該母體基因。如果雜合體之間配種得到的 F2 純 合體能夠長大到性成熟， 雌性個體因該母源基因被轉(zhuǎn)座子破壞而不能表達(dá)出有功 能的蛋白，其產(chǎn)出的卵子中就缺乏該母源基因產(chǎn)物， 與野生型或雜合型雄性個體 的精子受精后的胚胎就可能出現(xiàn)胚層誘導(dǎo)和分化等方面的缺陷， 稱之為母源突變 體。我們獲得母源突變體之后， 將檢測突變體胚胎中各個胚層的標(biāo)記基因的表達(dá)、 Wnt 、N

6、odal 、BMP 等關(guān)鍵發(fā)育信號通路的組份的表達(dá)；在突變體中過表達(dá)一 些胚層誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵基因如sqt 、beta-catenin 、 bmp2b 、fgf8 、 sox32等,確定它們與突變的母源基因之間的遺傳互作關(guān)系。為了深入闡明有重要功能 的母源因子的作用機(jī)理， 將利用酵母雙雜交、 免疫共沉淀等技術(shù)途徑鑒定其互作 因子，再在哺乳動物細(xì)胞系中研究其在相關(guān)信號通路中的作用， 獲得的結(jié)果再回 到胚胎中進(jìn)行驗(yàn)證。 另一方面， 對于那些在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的有重要功能的母源基 因，將在爪蛙胚胎上檢驗(yàn)其功能的保守性。在反向遺傳分析方面， 我們將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和卵母細(xì)胞基因下調(diào)技術(shù)鑒定 參與爪蛙胚層形成

7、的母源基因， 利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù) （比如 deep sequencing ） 鑒定斑馬魚父源特異性 RNA 。然后設(shè)計特異性的嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸去 抑制相應(yīng)基因的 mRNA （或小 RNA ）的表達(dá)。在爪蛙上，將反義寡核苷酸注射 到收集的卵母細(xì)胞中，可以有效地剔除儲存在卵母細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA ，體外培養(yǎng) 2 天后 （可以使原來已存在的蛋白降解 ），再將卵母細(xì)胞回移到處理過的雌蛙 輸卵管中，并進(jìn)行自然受精（本項(xiàng)目組成員陶慶華教授實(shí)驗(yàn)室是全世界屈指可數(shù) 熟練掌握該方法的團(tuán)隊）。在斑馬魚上，我們正在建立類似的技術(shù)。抑制父源特 異性 RNA 相對比較簡單（因?yàn)檫M(jìn)入卵子的特定父源 RNA 的量極

8、少），將反義 寡核苷酸注射到單細(xì)胞受精卵中即可。 對于注射了反義寡核苷酸的胚胎， 將首先 從形態(tài)學(xué)上觀察胚胎的胚層變化， 然后檢測常用的胚層標(biāo)記基因的表達(dá)， 確認(rèn)其 可能的作用。 在鑒定到對胚層形成有重要影響的父源或母源基因后， 我們將根據(jù) 其表達(dá)譜、 表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)和突變體表型， 利用體內(nèi)、 體外系統(tǒng)研究其發(fā)揮生物 學(xué)功能的分子機(jī)理?？紤]到 Wnt 和 TGF-beta 信號，以及細(xì)胞全能性相關(guān)因子 在胚胎早期發(fā)育中起著廣泛而重要的作用， 因此鑒定出對胚層形成有重要影響的 親源基因后，將重點(diǎn)研究它們與細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞分化調(diào)控因子的相互作用關(guān) 系。另一方面， TGF-beta 和 Wnt 信

9、號，以及與干細(xì)胞全能性相關(guān)的重要調(diào)控 因子大多數(shù)都在早期胚胎發(fā)育、 特別是胚層形成中發(fā)揮重要作用， 因此我們也計 劃分析 TGF-beta 和 Wnt 信號相關(guān)調(diào)控因子以及干細(xì)胞全能性相關(guān)因子（如 Oct4 ， nanog ， Klf4 等）在胚層形成中的功能和作用機(jī)制。在前期工作中， 我們已經(jīng)通過酵母雙雜交、 染色體免疫沉淀、 基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多受 Wnt 和 TGF-beta 信號通路調(diào)節(jié)的基因， 以及與這兩個信號通路上的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié) 因子相互結(jié)合的蛋白， 在本項(xiàng)目中將重點(diǎn)研究它們在胚胎早期發(fā)育， 特別是胚層 形成中的功能和對相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)理。 在研究它們的生物學(xué)功能方面，

10、將 主要開展以下分析： 1 ）利用原位雜交確定它們在胚胎發(fā)育中的時空表達(dá)譜； 2 ） 將體外合成的野生型 mRNA 或突變型 mRNA 注射到胚胎中，觀察其對胚胎圖 式發(fā)育的影響，并檢測相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)的變化； 3）合成 Morpholino 反義寡 核苷酸，將其注射到胚胎或爪蛙的卵母細(xì)胞中，使相應(yīng)基因功能被減弱或失活， 觀察胚胎發(fā)育異常（檢測形態(tài)和標(biāo)記基因）； 4）將一個基因的 mRNA 或反義 寡核苷酸與相關(guān)信號通路的其它基因的 mRNA 或反義寡核苷酸組合注射，探討 基因互作關(guān)系， 建立相關(guān)發(fā)育途徑的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 在研究新基因?qū)π盘柾返?調(diào)節(jié)機(jī)理方面，將主要利用體外的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，分

11、析內(nèi)容主要包括： 1 ）該基 因過表達(dá)或被抑制時對 Wnt 和 TGF-beta 信號的影響； 2）過表達(dá)或被抑制時對 Wnt 和 TGF-beta 信號通路中的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、修飾或穩(wěn)定性的 影響； 3）亞細(xì)胞定位及其動態(tài)變化； 4）功能域的鑒定； 5）獲得的機(jī)理在體內(nèi) 系統(tǒng)中的驗(yàn)證，希望獲得相應(yīng)的遺傳學(xué)證據(jù)。在研究策略上， 我們將充分發(fā)揮這兩種模式生物的特色和技術(shù)優(yōu)勢， 特別注 意兩種模式動物研究系統(tǒng)之間的結(jié)合、 胚胎體內(nèi)研究與培養(yǎng)細(xì)胞體外研究之間的 結(jié)合、以及不同信號通路之間的交互作用研究， 從而保證研究成果的高質(zhì)量、 高 水平，在分子機(jī)理上認(rèn)識胚層誘導(dǎo)和分化、母源 - 合子轉(zhuǎn)

12、換等發(fā)育過程的調(diào)控規(guī) 律。3創(chuàng)新點(diǎn)和特色本項(xiàng)目關(guān)注的生物學(xué)問題是胚胎發(fā)育中胚層的誘導(dǎo)和分化， 這是所有動物發(fā) 育過程中的重要階段， 是多細(xì)胞生物形成的最原始和最基礎(chǔ)性的事件。 現(xiàn)有的研 究結(jié)果顯示，胚層的發(fā)育是精卵配子中預(yù)存的親源因子和受精卵合子基因之間互 作的結(jié)果， 其中親源因子起到了決定性的起始和調(diào)控作用。 但關(guān)于親源因子在胚 層形成和分化中的功能研究，受技術(shù)限制，一直是早期胚胎發(fā)育研究中的難點(diǎn)。 本項(xiàng)目選用脊椎動物胚層形成研究中最常用的斑馬魚和爪蛙為模式生物， 輔以體 外研究系統(tǒng)，利用分子、細(xì)胞、生化、組學(xué)等多種研究手段，希望能揭示親源因 子在脊椎動物早期胚胎發(fā)育， 特別是胚層誘導(dǎo)和分化

13、中的功能和分子機(jī)制。 因此 本項(xiàng)目完全能夠產(chǎn)生創(chuàng)新性的研究成果。本項(xiàng)目的特色之一是分別從鑒定參與胚層發(fā)育的新基因和從胚層形成相關(guān) 細(xì)胞信號和細(xì)胞全能性因子入手， 以鑒定新基因和新功能為切入點(diǎn)， 在很大程度 上保證了研究的原創(chuàng)性和新穎性，使整個研究從一開始就站在了本領(lǐng)域的最前 沿。本項(xiàng)目的特色之二是選擇了合適的研究系統(tǒng)， 即斑馬魚、 爪蛙和體外細(xì)胞系 統(tǒng)。斑馬魚和爪蛙均具有產(chǎn)卵量大、體外受精、胚胎體外發(fā)育的特性，容易觀察 胚胎早期的發(fā)育過程，也為未受精卵（卵母細(xì)胞）和受精卵中的基因修飾（如 mRNA 的過量表達(dá)或抑制）提供了基本條件，因而已成為研究脊椎動物早期胚 胎發(fā)育的兩個最常用的模式系統(tǒng)。

14、此外，斑馬魚上容易進(jìn)行轉(zhuǎn)基因、 誘變等遺傳 操作以及細(xì)胞譜系標(biāo)記和跟蹤； 爪蛙胚體大， 較容易進(jìn)行顯微手術(shù)操作； 爪蛙的 卵母細(xì)胞可以較長時間體外培養(yǎng)，使剔除母源蛋白和抑制母源 RNA 表達(dá)成為可 能。體外哺乳動物細(xì)胞系在研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理方面具有不可替代的優(yōu)勢， 可 用于闡明基因 / 蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)理和網(wǎng)絡(luò)。本項(xiàng)目將這三個研究系統(tǒng)結(jié)合 起來，可以充分利用其各自的優(yōu)勢， 實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)； 又可以在不同系統(tǒng)中互相印 證，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論的可靠性提供保證。本項(xiàng)目的特色之三是，在人員組成上，既各有專攻，有互為補(bǔ)充。本項(xiàng)目是 在原重大研究計劃項(xiàng)目 “胚胎早期發(fā)育的分子機(jī)理研究” 基礎(chǔ)上的延續(xù)，

15、在該項(xiàng) 目的資助下， 孟安明，陳曄光，張建和吳畏實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立起緊密的合作關(guān)系和 通暢的共享技術(shù)平臺。 得益于近兩年回國的陶慶華教授和曹螢教授的加盟， 給這 個團(tuán)隊引入了爪蛙母源基因功能分析技術(shù)和干細(xì)胞全能性因子在爪蛙中的功能 研究體系，加上原有的多年從事早期胚胎發(fā)育研究的高水平發(fā)育生物學(xué)家和長期 從事細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的高水平細(xì)胞生物學(xué)家， 使得這個團(tuán)隊可以全方位地開展 胚層形成研究。這幾個方面的研究人員的協(xié)作將有助于從分子機(jī)理上揭示胚層形 成的規(guī)律， 更有可能取得重大的發(fā)現(xiàn)。 此外，本項(xiàng)目的所有人員都全時在國內(nèi)工 作，主要骨干都有獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室， 這樣一個穩(wěn)定的高水平的研究團(tuán)隊， 為實(shí)現(xiàn)項(xiàng) 目

16、的預(yù)期目標(biāo)提供了充分的保障。4取得重大突破的可行性分析研究早期胚胎發(fā)育中母源因子對胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控機(jī)理是國際上發(fā)育 生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，但也是難點(diǎn)；而父源 RNA 在胚胎早期發(fā)育中的作用是最近 才認(rèn)識（推測）到的，但尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)， 因而是可產(chǎn)生突破性發(fā)現(xiàn)的研究方向。 近幾年來， 本項(xiàng)目的主要參加人員在胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)理方面做了大量、 扎實(shí)的 工作，獲得了一批有重要科學(xué)價值的成果。 在此基礎(chǔ)上， 我們計劃把研究進(jìn)一步 集中在“親源因子對胚層形成的調(diào)控” 這個方向上， 取得重大突破性成果的可能 性是很高的。工作基礎(chǔ)方面， 孟安明，陳曄光，張建、吳畏、趙慶順實(shí)驗(yàn)室完全立足國內(nèi)， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個參與

17、脊椎動物早期胚胎發(fā)育調(diào)控的新基因， 并詳細(xì)闡述了它們調(diào)控 胚胎發(fā)育的分子機(jī)制和它們與 Wnt 、TGF-beta 等信號的關(guān)系， 在世界主流雜志 Cell 、Science 、Dev Cell 、Development 、EMBO J 、Blood ，Genome Res ， PNAS ，J Neurosci ，J Cell Sci、J Biol Chem 、Dev Biol 等發(fā)表多篇研究論文， 并有許多合作發(fā)表的高水平論文。 陶慶華和曹螢也已經(jīng)在國內(nèi)建立了獨(dú)立的實(shí)驗(yàn) 室，全時在國內(nèi)工作，已完成了很有希望的基礎(chǔ)性工作（見工作基礎(chǔ)），并與參 與本項(xiàng)目的其它實(shí)驗(yàn)室開始了合作研究。 本項(xiàng)目將這幾個

18、研究組結(jié)合起來， 集中 精力，從不同角度共同研究早期胚胎發(fā)育中胚層形成的調(diào)控機(jī)理， 可以實(shí)現(xiàn)不同 研究系統(tǒng)的互補(bǔ)和研究結(jié)果的相互驗(yàn)證， 促進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室研究深度的提高， 大大提 高了取得重大突破的可能性。 這樣實(shí)質(zhì)性的合作研究是單個研究體系、 單個實(shí)驗(yàn) 室所難以企及的。5. 課題設(shè)置（一）課題設(shè)置的思路為了實(shí)現(xiàn)預(yù)定研究目標(biāo)，我們將圍繞“胚層的形成和分化受母源信號控制” 這一中心假說， 綜合利用多學(xué)科技術(shù)、 多模式系統(tǒng)的優(yōu)勢， 充分發(fā)揮各研究組的 學(xué)術(shù)專長， 從多角度、多層面、多視野研究胚層決定和分化過程中生物大分子之 間、基本細(xì)胞信號通路之間如何相互作用， 如何控制胚胎細(xì)胞的基本功能， 研究 早期

19、胚胎如何通過這些分子、 細(xì)胞水平的調(diào)控機(jī)制推動個體發(fā)育的正常進(jìn)行。 基 于這樣的思路，同時考慮項(xiàng)目團(tuán)隊成員的研究方向的共性和課題內(nèi)學(xué)術(shù)交流的方 便性，我們設(shè)置四個課題。（二）課題設(shè)置課題一、脊椎動物親源因子的鑒定及功能研究本課題將從兩方面開展研究：1. 斑馬魚母源分子在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1）關(guān)鍵科學(xué)問題脊椎動物細(xì)胞的卵子和精子均包含單倍的染色體，在精、卵融合后啟動生 物個體的發(fā)育過程。 卵子不但比精細(xì)胞個體大， 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為卵細(xì)胞也儲存了用 于最早期發(fā)育的除精子染色體之外的所有必需因子。 本課題要探討的關(guān)鍵科學(xué)問 題是哪些母源因子在胚層誘導(dǎo)和分化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它們的作用機(jī)理是什 么，它

20、們與已知的關(guān)鍵發(fā)育信號通路的關(guān)系是什么。（2）研究目標(biāo)鑒定新的斑馬魚母源分子，研究它們在斑馬魚卵母細(xì)胞周期、胚胎卵裂、 胚層決定和分化中的功能， 在生化水平探討它們的作用機(jī)制， 并研究這些基因與 已知胚胎發(fā)育中關(guān)鍵信號通路的相互作用關(guān)系。 將新發(fā)現(xiàn)的參與早期發(fā)育其他方 面調(diào)控的基因提供給其他三個課題組進(jìn)行研究。（3）研究內(nèi)容母源基因突變體的鑒定：在遺傳篩選方面，利用我們已有的 Tol2 轉(zhuǎn)座子基 因插入突變的技術(shù)，篩選斑馬魚母源突變體并鑒定和克隆一批斑馬魚母源基因， 然后通過轉(zhuǎn)基因 GFP 示蹤、原位雜交、 RT-PCR 等驗(yàn)證其母源表達(dá)的時空特異 性，為功能研究提供重要線索。基于表達(dá)譜克隆新

21、的母源基因： 通過亞細(xì)胞分 離等技術(shù)從斑馬魚（或者爪蛙）卵母細(xì)胞中提取 RNA ，通過差別表達(dá)及深度測 序等方法發(fā)現(xiàn)新的母源 RNA ，并克隆進(jìn)化上保守的母源基因（如：爪蛙、小鼠 等）。母源因子功能的研究：在 Tol2 轉(zhuǎn)座子純合突變體（ GFP 插入）中，選擇具 有早期形態(tài)發(fā)育異常的突變體，通過 PCR 手段克隆相對應(yīng)的基因。合成嗎啉環(huán) 修飾的反義寡核苷酸注射受精卵， 通過胚胎期形態(tài)觀察和分子標(biāo)記等的檢測， 確 定這些母源基因?qū)π螒B(tài)發(fā)生等的影響是否與相對應(yīng)的純合突變體一致。 類似的嗎 啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸也可用于基于表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)的母源基因的功能分析， 進(jìn)一 步確定這些母源基因與早期發(fā)育相關(guān)信

22、號通路的可能相關(guān)作用。 此外，我們也將 建立新的功能缺失分析的新技術(shù)， 例如： 在卵母細(xì)胞中敲低母源基因的技術(shù)。 我 們將選擇重要的母源基因深入研究其在早期發(fā)育中的分子機(jī)理： 在斑馬魚中利用 生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)方法研究它們與 Wnt 、TGF-beta 等信號通路的遺傳互作。 對于進(jìn)化中保守的母源基因， 我們將采用小鼠條件基因敲除的方法， 研究它們在 哺乳動物中的功能。2. 父源 RNA 的鑒定和功能研究（ 1）關(guān)鍵科學(xué)問題 單倍體的精子和單倍體卵子受精產(chǎn)生的受精卵（合子）開始生命的發(fā)育過 程。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，精子對下一代（受精卵）的主要貢獻(xiàn)僅限于提供父源的 DNA 。然而近年的研究表明，

23、在受精過程中， 精子釋放了數(shù)以百計的各種 mRNA 和小 RNA 進(jìn)入卵子，它們對合子胚胎的發(fā)育究竟起什么作用、如何起作用，目 前幾乎是一無所知。這就是本項(xiàng)研究期望解答的科學(xué)問題。（2）研究目標(biāo)鑒定由斑馬魚精子提供給卵子的 RNA ，研究它們對斑馬魚胚胎卵裂、胚層 形成和分化等的影響及其分子機(jī)理， 探討它們與已知在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用的 Wnt 和 TGF-beta 等信號通路的關(guān)系。（3）研究內(nèi)容父源 RNA 的鑒定：從斑馬魚精子和未受精卵中提取 RNA ，通過深度測序 確定存在的 mRNA 和小 RNA ，找出特異性的父源（精源） mRNA 和小 RNA ， 再通過 RT-PCR 等方法驗(yàn)

24、證其特異性。父源 RNA 的保守性的確定：通過生物學(xué) 信息學(xué)方法比較來自斑馬魚、豬、人等物種的精子小 RNA 和 mRNA 所編碼的 蛋白，找出保守的父源 mRNA 和小 RNA 。功能性父源 RNA 的鑒定：針對保守 性父源 RNA ，合成嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸注射受精卵，通過胚胎期形態(tài)觀 察和少量分子標(biāo)的檢測初步確定哪些父源基因和小 RNA 具有功能。有重要功能 的父源基因?qū)ε咛グl(fā)育的作用：從初步確定有功能的父源基因和小 RNA 中挑選 部分對胚胎發(fā)育有明顯影響者，在受精卵中注射反義寡核苷酸或 mRNA ，檢測 相關(guān)發(fā)育途徑所涉及的基因的表達(dá)和蛋白水平的變化， 確認(rèn)其在胚胎發(fā)育中的功 能

25、和可能涉及的信號通路。重要父源基因的發(fā)育功能的分子機(jī)理研究：已知 Wnt 、Nodal 、BMP 、FGF 等信號通路在胚胎的早期發(fā)育中起重要作用，將通 過生物化學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等方法研究有重要功能的父源基因?qū)@些信號 通路的可能影響及其在發(fā)育中的遺傳互作。 重要父源基因發(fā)育保守性的研究： 挑 選在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的幾個有重要功能的父源基因，在爪蛙上檢驗(yàn)其功能的保守 性。承擔(dān)單位：清華大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所課題負(fù)責(zé)人：孟安明，男， 47 歲，教授，中科院院士，清華大學(xué)生命學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：張建，男， 43 歲，研究員，中科院遺傳發(fā)育研究所經(jīng)費(fèi)比例： 28.33%課題二：母源因子

26、在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1、關(guān)鍵科學(xué)問題非洲爪蛙是研究母源基因在誘導(dǎo)胚層誘導(dǎo)和分化中的功能的最佳模式動物 之一。近二十年的分子發(fā)育生物學(xué)研究表明， 母源轉(zhuǎn)錄因子 VegT 在囊胚中期通 過激活 Sox17 ， Mixer ，GATA4/5/6 等轉(zhuǎn)錄因子直接啟動植物極細(xì)胞的內(nèi)胚層 分化命運(yùn)， 同時激活內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)并分泌 TGF-beta 家族 Nodal 類生長因子， 誘導(dǎo)赤道邊緣帶細(xì)胞發(fā)育成中胚層。 而外胚層則在囊胚期動物極區(qū)域形成， 并在 原腸運(yùn)動中受 BMP 信號和組織者誘導(dǎo)信號的調(diào)控分化成表皮以及神經(jīng)系統(tǒng)。囊 胚期外胚層是如何被決定的？是否存在決定外胚層命運(yùn)的母源位置信息？后生 動物

27、胚胎早期發(fā)育中普遍存在由母源向合子控制的轉(zhuǎn)換。 斑馬魚、非洲爪蛙以及 果蠅胚胎發(fā)育中的這種轉(zhuǎn)換發(fā)生在囊胚中期， 因此又稱為囊胚中期轉(zhuǎn)換。 合子基 因組的轉(zhuǎn)錄活性如何在囊胚中期被激活？這些問題至今尚無定論。2、研究目標(biāo)該課題計劃以非洲爪蛙為主要模式動物，綜合運(yùn)用正 / 反向遺傳學(xué)、生物化 學(xué)、生物信息學(xué)和組學(xué)等技術(shù)， 從分析新母源基因在誘導(dǎo)早期三胚層形成和分化 的作用入手，實(shí)現(xiàn)如下研究目標(biāo)：、分離和鑒定誘導(dǎo)外胚層生成的母源因子； 、分析母源外胚層誘導(dǎo)因子如何啟動外胚層的分化程序；、分析母源外胚層誘導(dǎo)因子與VegT、Nodal、FGF等胚層誘導(dǎo)信號通路間如何相互作用，決定三 個早期胚層之間的組織界

28、限形成；、揭示母源因子控制合子基因組在囊胚中期 轉(zhuǎn)錄開放的分子機(jī)制。3、研究內(nèi)容1）建立非洲爪蛙早期外胚層分化的合子基因調(diào)控程序：我們將通過深度 RNA測序（RNA-Seq ）確定囊胚中期、原腸胚早期預(yù)定外胚層中特異表達(dá)的合子基因。對它們的功能進(jìn)行 Gene Ontology 分類，運(yùn)用定量 RT-PCR 驗(yàn)證它們 表達(dá)時序、 運(yùn)用整體原位雜交方法確認(rèn)它們在外胚層中表達(dá)的組織特異性。 同時 對在外胚層中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、 分泌型蛋白以及關(guān)鍵信號通路的調(diào)控蛋白進(jìn) 行功能分析，包括過量表達(dá)、異位表達(dá)以及嗎啉環(huán)修飾的反義核苷酸介導(dǎo)的敲低。 建立外胚層特異表達(dá)合子基因之間的層級調(diào)控關(guān)系， 以及它們對

29、外胚層分化命運(yùn) 的影響。在此基礎(chǔ)上， 我們將進(jìn)一步分析外胚層特異表達(dá)基因與中胚層 （Nodal ， FGF）、內(nèi)胚層（VegT、Nodal ）誘導(dǎo)信號之間的調(diào)控關(guān)系，以及外胚層和中胚 層組織界限形成的機(jī)制。 2）分離和鑒定決定外胚層形成的母源因子：運(yùn)用計算 機(jī)輔助全基因組序列分析， 決定外胚層特異表達(dá)基因在基因組上的分布特征， 分 析這些外胚層特異表達(dá)基因的上游調(diào)控序列， 尋找控制外胚層特異基因表達(dá)的保 守調(diào)控元件，并運(yùn)用已知的外胚層特異表達(dá)基因（如Foxi1e/ Xema, FoxH3,XFDL156, xLim-5, SRF, Ectodermin 等）的上游調(diào)控序列進(jìn)行驗(yàn)證，尋找位于 其

30、中的保守調(diào)控元件。 構(gòu)建由這些保守元件驅(qū)動的 Luciferase 和 GFP 報告基因， 分析這些保守元件是否能控制報告基因在外胚層中的特異表達(dá)。 同時對這些保守 元件進(jìn)行突變和缺失分析， 建立相關(guān)系列報告基因的轉(zhuǎn)基因胚胎， 分析這些保守 調(diào)控元件的必要性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建外胚層特異的保守啟動子/增強(qiáng)子驅(qū)動的酵母單雜交報告系統(tǒng)，對 Unigene 母源 cDNA 文庫進(jìn)行篩選，分離與這些調(diào)控序 列結(jié)合的母源因子。體外合成這些母源因子的 mRNA ，設(shè)計并合成特異的反義 寡核苷酸，分別對它們進(jìn)行過量表達(dá)和敲低功能分析。 運(yùn)用 ChIP-on-chip 技術(shù)， 分析這些母源轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控的合子靶

31、基因， 揭示這些母源因子控制囊胚期外 胚層形成的機(jī)制。我們的前期研究工作已經(jīng)獲得三個新的母源基因?qū)ν馀邔拥恼T 導(dǎo)具有調(diào)控作用，它們分別屬于 Tbx 、 Zinc-finger 和 bHLHZip 家族轉(zhuǎn)錄因子。 進(jìn)一步的研究將揭示它們的功能作用機(jī)制。 3）母源因子在調(diào)控囊胚中期合子基 因組轉(zhuǎn)錄活性轉(zhuǎn)換中的功能： 囊胚中期轉(zhuǎn)換存在于多數(shù)后生動物早期發(fā)育中， 期 間，合子基因組轉(zhuǎn)錄大規(guī)模開放， 包括受母源位置信息控制的胚層特異基因的區(qū) 域性表達(dá)。與之相伴發(fā)生的是母源基因的大規(guī)模降解、 細(xì)胞周期特征的改變和胚 胎細(xì)胞遷移活性的獲得。 這些現(xiàn)象是受獨(dú)立控制還是相互關(guān)聯(lián)， 是脊椎動物早期 發(fā)育研究的重大

32、問題之一。 我們在進(jìn)行母源基因敲低功能分析過程中獲得幾個候 選母源轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白甲基化修飾酶， 它們的缺失顯著地降低合子基因組在囊 胚期的轉(zhuǎn)錄活性， 并對細(xì)胞周期行為有一定影響。 我們計劃綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和蛋 白質(zhì)化學(xué)研究手段， 對這些母源基因在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的功能作深入分析， 檢驗(yàn) 以下三種假說： 其一，大量儲備的母源轉(zhuǎn)錄抑制因子或者表觀遺傳修飾因子抑制 合子基因組的過早開放；其二，母源 RNA Pol II 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物組分的表達(dá)量過低 或者不能有效裝配；其三，快速的細(xì)胞分裂不利于轉(zhuǎn)錄的起始或者 / 和延伸。承擔(dān)單位：清華大學(xué)，中國科學(xué)院動物研究所課題負(fù)責(zé)人：陶慶華，男， 39 歲，教授，清

33、華大學(xué)生命科學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：趙亞輝，男， 35 歲，副研究員，中科院動物研究所 經(jīng)費(fèi)比例： 18.67%課題三：發(fā)育關(guān)鍵信號通路的新介導(dǎo)因子對胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控作用1、關(guān)鍵科學(xué)問題Wnt和TGF-beta是兩條重要的信號通路，在胚胎發(fā)育和成體組織動態(tài)平衡 維持中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。其精確調(diào)控的喪失在發(fā)育階段會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異 常，在成體中會導(dǎo)致癌癥，如結(jié)腸癌、乳腺癌，以及其他疾病的發(fā)生。在早期胚 胎中， Wnt 信號通路參與了胚層背腹軸向分化調(diào)控、 細(xì)胞極性建立和胚胎原腸運(yùn) 動等多個發(fā)育過程。 TGF-beta 超家族成員在胚胎早期發(fā)育過程中也參與胚層的 誘導(dǎo)形成以及體軸的確定等過程。并且

34、，Wnt和TGF-beta信號通路在不同的層面有著廣泛的 cross-talk ，往往協(xié)同調(diào)控胚胎發(fā)育事件。例如， Wnt 信號通路中 的Axin能通過Arkadia促進(jìn)Smad7的降解，從而上調(diào)TGF-beta信號；Smad4和Wnt通路中的beta-catenin 以及LEF1的相互作用在Spemanns organizer的形 成中起著重要的作用；Smad4和Wnt信號調(diào)控分子APC的突變在結(jié)腸癌發(fā)生中 都有 作用；Smad7和beta-catenin 以及LEF1/TCF4之間的相互作用對于 TGF-beta誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的作用；Wnt通路中的Dvl1和Axin都與TGF-be

35、ta 信號分子 Smad3 有相互作用。本課題的關(guān)鍵科學(xué)問題是在胚胎發(fā)育， 特別是胚層誘導(dǎo)形成和分化過程中， TGF-beta與Wnt信號是如何發(fā)揮作用的。 我們將主要利用爪蛙胚胎和小鼠/人胚胎干細(xì)胞，研究Wnt和TGF-beta信號的新 的調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制， 同時，特別關(guān)注這兩條信號通路在胚層誘導(dǎo)形成和分化 調(diào)控中的協(xié)同作用。2、研究目標(biāo)該課題計劃以爪蛙和胚胎干細(xì)胞為研究體系， 必要時也會利用斑馬魚和小鼠 研究系統(tǒng)，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)、分子、生化等研究技術(shù)，從鑒定新的 TGF-beta 以及 Wnt 信號的調(diào)控因子和靶基因入手，探索這兩條信號通路在胚層形成以及分化 調(diào)控中的機(jī)制，實(shí)現(xiàn)如下研究目標(biāo)

36、：、鑒定 TGF-beta信號的新的調(diào)控因子和 調(diào)控機(jī)制，分析他們在胚層形成和分化中的功能；、鑒定Wnt信號的新的調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制，分析他們在胚層形成和分化中的功能；、鑒定受TGF-beta 和/或 Wnt 信號調(diào)控的直接靶基因， 分析這些靶基因在胚層形成以及分化中的功 能；分析TGF-beta和Wnt信號在胚層形成和分化中的協(xié)調(diào)和交互作用。另 外，我們還將同其他三個課題合作， 利用他們發(fā)現(xiàn)的新基因等共同楊本項(xiàng)目的核 心科學(xué)問題。3、研究內(nèi)容：為了發(fā)現(xiàn)新的、 有重要功能的調(diào)控基因， 在整體上理解胚胎發(fā)育中胚層形成 和分化調(diào)控的內(nèi)在機(jī)理，我們將主要進(jìn)行以下幾方面的研究。1）新的調(diào)控TGF-be

37、ta與Wnt通路的分子機(jī)制：經(jīng)過近 20 30年的研究，TGF-beta和Wnt 通路的主要成員大都被發(fā)現(xiàn)， 已經(jīng)建立起了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的框架。 但是，新的 試驗(yàn)方法和技術(shù)的出現(xiàn)，讓我們有了新的工具來研究他們的調(diào)控。我們將利用RNAi文庫，從基因組水平來篩選TGF-beta和Wnt通路的調(diào)控分子。TGF-beta 的受體TGFbetaRI和TGFbetaR2，Smad蛋白是TGF-beta通路中的主要成員， 各種各樣的翻譯后修飾是調(diào)控他們功能的重要方式， 其中研究最多的是磷酸化和 去磷酸化。 我們克隆了人類基因組所有被注釋的激酶和去磷酸化酶， 利用這些資 源我們將研究磷酸化和去磷酸化對 TGF

38、-beta和Wnt信號通路的調(diào)控。組學(xué)水平 的研究，能讓我們更全面的了解TGF-beta和Wnt信號通路的調(diào)控。2） TGF-beta 與Wnt信號相關(guān)因子在早期胚胎發(fā)育中的作用和分子機(jī)制：TGF-beta信號，特別是其中的 Nodal 信號在胚胎發(fā)育過程中起了重要作用， 很多信號通路中的關(guān)鍵 分子，比如受體和 Smads ，在胚胎發(fā)育過程中的功能研究已經(jīng)取得了重要成果。 近些年的研究表明，還有很多參與 TGF-beta 信號調(diào)控的分子沒有被發(fā)現(xiàn)。我們 在前期研究中發(fā)現(xiàn)了多個 TGF-beta/Nodal 信號的介導(dǎo)因子（如斑馬魚 Smad3a 、 Smad3b ）或調(diào)控因子（如 Dapper

39、2 、 BAMBI ）相互作用的因子。還發(fā)現(xiàn)了一些在缺失 Nodal 信號的斑馬魚突變體中表達(dá)下降的基因，這些因子 / 基因在胚胎 發(fā)育中的功能或?qū)?TGF-beta 信號通路的調(diào)控作用并不清楚。我們將研究這些因 子/ 基因在斑馬魚和爪蛙胚胎早期發(fā)育中的功能，并利用體外系統(tǒng)闡明它們在 TGF-beta 信號通路中的作用及其機(jī)理。同樣，多個 Wnt 信號的調(diào)控因子已被發(fā) 現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用， 但其受體激活機(jī)制等關(guān)鍵調(diào)控步驟 仍很不清楚。而且人們對 Wnt 信號在上述每一個發(fā)育過程中到底如何調(diào)控細(xì)胞分 化幾乎一無所知。 針對這一問題， 目前我們已經(jīng)鑒定到多個調(diào)控 Wnt 信號的

40、爪蛙 基因，都可能以新的調(diào)控機(jī)制參與 Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控。 接下來我們將深入研究 這幾個基因的調(diào)控機(jī)制和生理功能。3）探討TGF-beta與Wnt通路之間的交互作 用和整合如何影響早期胚胎發(fā)育：信號通路除了能各自調(diào)節(jié)自身下游靶基因以 外，還能相互協(xié)調(diào)整合、 共同參與對某些下游靶基因的調(diào)節(jié)。 我們將鑒定同時受 TGF-beta 與 Wnt 信 號 調(diào) 控的 下游 基 因 。 針 對 這 一 問 題 ， 我 們將 借 助 ChIP-on-chip 、Chip-seq 等技術(shù)，尋找斑馬魚和爪蛙早期發(fā)育中的 TGF-beta 和Wnt通路中的靶基因。我們已經(jīng)建立了干細(xì)胞的研究平臺，TGF-beta

41、和Wnt通路在干細(xì)胞的自我更新和復(fù)制中起著重要的作用， 我們也將在小鼠胚胎干細(xì)胞 中鑒定TGF-beta和Wnt的靶基因。新的靶基因的發(fā)現(xiàn)能讓我們更好地了解 TGF-beta和Wnt通路的功能。此外，我們在過去的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些因子 對TGF-beta與Wnt通路有復(fù)雜的調(diào)控作用，例如BAMBI蛋白既能參與上調(diào) Wnt 通路同時又是一個重要的 TGF-beta 通路的抑制因子。對于這類的蛋白因子，研 究它在早期胚胎發(fā)育的不同時期發(fā)揮的功能，將是我們今后工作的另一個重點(diǎn)。 我們還將著手建立一套基于TGF-beta與Wnt通路報告基因的雙熒光篩選系統(tǒng)， 以期發(fā)現(xiàn)更多的類似 BAMBI 這樣同時

42、作用于兩條通路的調(diào)控因子。此外，近年 發(fā)現(xiàn)胰島素樣（IGF）信號通路對胚層的分化也有影響，我們將探討一些IGF結(jié)合蛋白（IGFBP）對胚層分化的影響及其與 TGF-beta和Wnt信號通路之間的互 作關(guān)系。承擔(dān)單位：清華大學(xué)，中國海洋大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：吳畏，男， 41 歲，教授，清華大學(xué)生命科學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：陳曄光，男， 45 歲，教授，清華大學(xué)生命科學(xué)院 李筠，女， 42 歲，教授，中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院經(jīng)費(fèi)比例： 29.67%課題四：多能性因子在胚層誘導(dǎo)和分化中的作用1、關(guān)鍵科學(xué)問題：多能性因子，主要包括 Oct4 、Klf4 、Sox2 、c-Myc 、nanog 等轉(zhuǎn)錄因子， 不僅具

43、有維持哺乳動物胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新的能力， 而且能夠?qū)?分化的成體細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能性的干細(xì)胞。另一方面， RA 信號可以將胚胎干細(xì) 胞誘導(dǎo)分化成源自不同胚層的細(xì)胞。 盡管這些多能性因子或信號在再生醫(yī)學(xué)研究 領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用， 然而，目前對它們在決定干細(xì)胞的命運(yùn)中如何發(fā)揮作用的 機(jī)制的了解還十分有限。 它們作為轉(zhuǎn)錄因子是如何拮抗多種促分化信號？如何與 表觀遺傳控制機(jī)制協(xié)同維持胚胎干細(xì)胞的分化潛能？這些多能性因子、 RA 信號 中的不同信號傳遞因子在多種脊椎動物的卵母細(xì)胞和未分化胚胎細(xì)胞中都有高 表達(dá)，為我們探索這些多能性因子在正常發(fā)育過程中調(diào)控早期胚胎細(xì)胞的分化命 運(yùn)的機(jī)理提供了理

44、想的研究模型。2、研究目標(biāo)：綜合運(yùn)用非洲爪蛙、斑馬魚、胚胎干細(xì)胞的模型系統(tǒng)研究多能性因子，主 要是 Oct4 和 Klf4 同源因子在胚層分化中的功能、它們對胚層分化的遺傳和表 觀遺傳調(diào)節(jié)。揭示多能性因子與促胚層分化信號（主要是 TGF-beta 、Wnt 、RA 信號通路） 之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系； 從多層面較為透徹地了解多能性因子如何經(jīng)由 塑造染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄感受性來決定早期胚胎細(xì)胞的分化狀態(tài)。3、研究內(nèi)容：1）Klf4 家族多能性因子在胚層分化中的功能和作用機(jī)制： Klf4 、Klf2 、Klf5 同屬 Kruppel-like factor 家族轉(zhuǎn)錄因子，它們在胚胎干細(xì)胞中都有表達(dá)，但是 它們

45、在脊椎動物胚胎早期發(fā)育中的確切功能還未見報到。 因此，我們將運(yùn)用非洲 爪蛙早期胚胎模型， 深入分析、 比較三者在胚層分化過程中功能的異同。 我們已 經(jīng)利用定量 RT-PCR 和整體原位雜交的方法完成檢測 Klf4 、Klf2 、Klf5 的時空 表達(dá)。已經(jīng)獲得這些基因的過量表達(dá)載體和特異的嗎啉反義寡核苷酸用于敲低實(shí) 驗(yàn)，分析 Klf2 、Klf4 或 Klf5 對胚層分化的影響。并將通過交叉拯救實(shí)驗(yàn)，區(qū)分 三者在胚層分化中的功能異同。 運(yùn)用熒光素酶報告基因、 蛋白質(zhì) -DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫共沉淀等手段，揭示不同 Klf 因子產(chǎn)生相似或不同功能的原因。與此 同時，我們還將通過報告基因、

46、EMSA 、Co-IP/GST-pulldown 、染色質(zhì)免疫共 沉淀等離體（ in vitro ）、在體（ in vivo ）的蛋白 -DNA 結(jié)合等實(shí)驗(yàn)，分析 Klf 家族轉(zhuǎn)錄因子對母源 VegT 、beta-catenin 以及合子 Nodal 信號通路活性的調(diào) 控，揭示 Klf 家族轉(zhuǎn)錄因子與已知促胚層分化信號通路間的相互作用機(jī)制。在斑 馬魚系統(tǒng)中檢驗(yàn) Klf 家族多能性因子的發(fā)育功能和機(jī)理的進(jìn)化保守性。 2）Klf 和 Oct4 同源因子 Oct25 之間的協(xié)同作用對胚層分化的影響：我們在前期實(shí)驗(yàn) 中已經(jīng)觀察到 Klf4 和 Oct25 在胚層分化過程中具有協(xié)同作用，將進(jìn)一步利用基

47、因表達(dá)芯片，在單獨(dú)過量表達(dá)或者敲低 Klf4 和 Oct25 的實(shí)驗(yàn)條件下，鑒別受 Klf4 與Oct25共同調(diào)節(jié)的靶基因。再用離體（EMSA）或在體（ChIP）驗(yàn)證Klf4和 Oct25 可以同時結(jié)合這些共同靶基因的調(diào)控序列。運(yùn)用熒光素酶報告基因的手 段驗(yàn)證兩個蛋白對目的基因的調(diào)節(jié)效應(yīng)。 并在干細(xì)胞中對 Klf4 和 Oct25 之間的 相互作用機(jī)制的保守行作進(jìn)一步研究。 3） Klf4 、Oct4 等多能性轉(zhuǎn)錄因子與組蛋 白修飾相關(guān)的表觀遺傳控制因子之間的相互作用。 綜合運(yùn)用過量表達(dá)、基因敲低、 定量 RT-PCR、Western Blotting 、Co-IP/GST-Pulldown

48、、EMSA、ChIP、報 告基因分析等實(shí)驗(yàn)手段， 檢測在胚層分化過程中， Klf4 和 Oct4 同組蛋白表觀遺 傳控制因子之間可能存在的三種作用方式：其一，Klf4和Oct4是否控制表觀遺傳修飾因子編碼基因的表達(dá)；其二，組蛋白修飾酶是否對 Klf4 、 Oct4 等多能性 因子基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用；其三， Klf4、 Oct4 與組蛋白修飾酶是否在共同 的靶基因啟動子區(qū)域協(xié)同作用。 4）確立母源性 RA 在胚層分化中的功能和機(jī)制。 在斑馬魚中利用嗎啉反義寡核苷酸敲降或 mRNA 過表達(dá)的方法檢測 RA、 RA 代 謝酶（包括 RA 降解酶 Cyp26 和合成酶 Aldh1a ）以及 RA

49、信號通路中輔阻遏因 子（N-CoR和SMRT）在胚層分化中的功能。通過研究母源性的輔阻遏因子（N-CoR和SMRT）在無RA的區(qū)域?qū)θ旧w重塑的影響，確立 RA信號通路 母源性信息是否通過控制表觀遺傳的改變而決定胚層的形成和分化。 在爪蛙中驗(yàn) 證相關(guān)因子功能的進(jìn)化保守性。5）揭示母源性 RA 信號是否通過調(diào)控早期多能性因子或其它早期信號如 Wnt 、 TGF-beta 影響胚層的形成和分化。 通過改變受 精卵內(nèi) RA 信號，研究早期多能性因子或其它早期信號如 Wnt 、 TGF-beta 等的 表達(dá)是否受 RA 信號的調(diào)控。 結(jié)合生物信息學(xué)和體外轉(zhuǎn)錄分析， 確立這些調(diào)控作 用的分子生物學(xué)機(jī)制。

50、承擔(dān)單位：南京大學(xué)，復(fù)旦大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：曹螢，男， 43 歲，教授，南京大學(xué)模式動物研究所 主要學(xué)術(shù)骨干：趙慶順，男， 45 歲，教授，南京大學(xué)模式動物研究所 姚紀(jì)花，女， 44 歲，副教授，復(fù)旦大學(xué)遺傳所經(jīng)費(fèi)比例： 23.33%（三）課題之間的聯(lián)系本項(xiàng)目的四個課題各有側(cè)重，如課題 1 和課題 2 的研究側(cè)重于研究母源和 父源分子對胚胎發(fā)育的調(diào)控作用，課題 1 以斑馬魚系統(tǒng)為主，課題 2 以爪蛙系 統(tǒng)為主；課題 3 以 Wnt 和 TGF-beta 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)新的機(jī)理研究為主，側(cè)重于哺乳 動物細(xì)胞系；課題 4 重點(diǎn)研究干細(xì)胞多能性相關(guān)的 Klf 家族因子和 RA 信號通路 因子的發(fā)育功能。 但是

51、，各課題之間又有密切的聯(lián)系和合作。例如， 課題 1 和課 題 2 發(fā)現(xiàn)的有重要功能的親源分子以及課題 4 發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞多能因子將與課題 3 合作，研究它們在 Wnt 、TGF-beta 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用；課題 3 發(fā)現(xiàn)的 Wnt 、 TGF-beta 信號的新調(diào)節(jié)因子或靶基因，可以通過與課題 1 、2 合作研究它們在 斑馬魚和爪蛙胚層形成和分化中的作用， 與課題 3 合作研究其在多能性維持中的 作用。課題 1 發(fā)現(xiàn)的斑馬魚重要親源分子可通過與課題 2 合作，研究其在爪蛙 中的發(fā)育功能保守性，與課題 4 合作研究其在干細(xì)胞多能性相關(guān)信號通路中的潛 在作用。課題 2 發(fā)現(xiàn)的爪蛙重要母源因子可通過

52、與課題 1 合作探討其在斑馬魚 胚胎中的作用。 總之，不同課題間的密切合作將有力地促進(jìn)高水平研究成果的產(chǎn) 出。四、年度計劃年度計劃內(nèi)容和目標(biāo)研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）構(gòu)建三種新型的Tol2基因捕獲1 ）完善基于Tol2轉(zhuǎn)座子的基因捕載體；建立不少于10000條魚的轉(zhuǎn)獲系統(tǒng)，在斑馬魚上大量獲得F0群座子基因捕獲F0群體。體。2 ）鑒定出一批母源、父源特異性和2）利用深度測序法，鑒定斑馬魚母胚層特異性表達(dá)基因。源和父源特異性表達(dá)基因；研究爪蛙3）闡明10個作用母源因子的發(fā)育囊胚期和原腸早期外胚層轉(zhuǎn)錄組特功能。第點(diǎn)。4）鑒定出 TGF-beta、Wnt、IGF3）研究前期工作鑒定的多個母源因信號相關(guān)的多

53、個新調(diào)控因子，初步揭子（如 Tbx、Zinc-finger、bHLHZip、示新分子與相關(guān)信號通路的調(diào)控關(guān)Trithorax、PcG、BTB-POZ、Norrin、系和在細(xì)胞中的大致作用機(jī)理。年Klf4、Klf2、Klf5、aldh1a2 和5）初步明確卵母細(xì)胞中基因組轉(zhuǎn)錄cyp26a1等）等在斑馬魚或爪蛙早抑制物質(zhì)是以蛋白質(zhì)還是RNA發(fā)揮期胚胎發(fā)育中的作用，尤其是在中囊作用。胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化中的作用。6）發(fā)表SCI論文6-10篇。4 ）通過大量表達(dá)、RNA干擾、蛋7 ）培養(yǎng)畢業(yè)博士生8-12名白組學(xué)、Chip-chip 等技術(shù)篩選TGF-beta、Wnt、IGF 等信號通路研究內(nèi)容預(yù)期

54、目標(biāo)相關(guān)因子。5）對卵母細(xì)胞及終末分化紅細(xì)胞核基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)作初步分析。研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）在斑馬魚上基于F0基因捕獲群1）獲得5 10個斑馬魚母源基因體篩選F1個體和建立F2群體；對插入突變體，克隆其中5個突變基F2群體進(jìn)行突變表型篩選，并進(jìn)行因，初步了解其在早期發(fā)育中的功插入點(diǎn)的基因克隆。能。2）在斑馬魚和爪蛙上對鑒定的新的2）在斑馬魚上初步了解母源去甲基母源和父源因子進(jìn)行大規(guī)模的功能化酶、蛋白酶抑制因子等對中囊胚轉(zhuǎn)分析。換、胚層誘導(dǎo)和分化的作用；并初步3）探討分析母源因子及 Klf因子、確認(rèn)3-5個有發(fā)育功能的父源特異第RA信號通路輔阻遏因子 N-CoR、性基因。SMRT等在三個胚

55、層形成和分化中3）在斑馬魚和爪蛙上闡明幾個母源二的交互調(diào)控關(guān)系及其與TGF-beta因子在調(diào)控胚層決定和分化的作用，和Wnt信號通路間的相互作用機(jī)初步揭示它們的作用機(jī)制；闡明 Klf年制；探討組蛋白H3甲基化在外胚層因子調(diào)節(jié)爪蛙胚層形成的分子機(jī)制。命運(yùn)決定過程中的調(diào)控機(jī)制。4）獲得非洲爪蛙終末分化紅細(xì)胞核4）對非洲爪蛙終末分化紅細(xì)胞因子中全基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)的基cDNA文庫進(jìn)行過量表達(dá)功能篩選；因身份，初步揭示期作用機(jī)理，確定5）繼續(xù)篩選受TGF-beta、Wnt以其在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的作用。及IGF信號調(diào)控的直接靶基因；對5）初步闡明部分 TGF-beta、Wnt鑒定到的影響TGF-beta、

56、Wnt以及和IGF通路相關(guān)因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中IGF信號的調(diào)控因子，開始進(jìn)行基因的作用；揭示其在爪蛙、斑馬魚早期功能研究，分析它們調(diào)控信號的機(jī)胚胎發(fā)育中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)制，分析它們在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模6 ）鑒別出受Klf4和Oct25共同調(diào)式，通過基因過量表達(dá)和功能缺失，節(jié)的、與胚層分化狀態(tài)相關(guān)的基因。探索它們可能的功能。7）發(fā)表SCI論文10-15篇。6）利用非洲爪蛙基因表達(dá)芯片鑒定8 ）培養(yǎng)畢業(yè)博士生10-13名。Klf4和Oct25協(xié)同調(diào)節(jié)的基因。研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1 ）繼續(xù)增加F1插入斑馬魚個體以1）獲得5 - 10個斑馬魚母源基因及F2家系，增加F3突變體的篩選插入突變體，

57、 克隆其中5個突變基數(shù)目；克隆突變體中的突變基因，因；闡明3-5個母源突變體的分子機(jī)研究其作用的分子機(jī)理。理。2）繼續(xù)深入研究母源和父源因子調(diào)2）闡明5-10個母源和父源因子的控中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化的發(fā)育功能和機(jī)理。分子機(jī)制。3）深入了解爪蛙外胚層命運(yùn)決定的第3）深入研究終末分化紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑遺傳和表觀遺傳控制機(jī)制、終末成熟制物質(zhì)在卵母細(xì)胞和早期胚胎中調(diào)卵母細(xì)胞中外源報告基因轉(zhuǎn)錄活性三控報告基因轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制?？刂茩C(jī)制、母源轉(zhuǎn)錄因子控制合子基4）繼續(xù)深入研究RA信號通路組份因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。年和鑒定的TGF-beta、Wnt和IGF4）進(jìn)一步明確鑒定的 TGF-beta、信號通路調(diào)控因子和靶基因在信號Wnt和IGF信號通路調(diào)控