細(xì)胞色素c的制備與相對分子質(zhì)量的測定

1、細(xì)胞色素c的制備與相對分子質(zhì)量的測定 鐘日龍() 趙煬 （山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山西太原市塢城路92號 郵編：）摘要 氧化型細(xì)胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，還原型細(xì)胞色素C在415nm、520nm和550nm有最大吸收峰。550nm處的磨爾消光系數(shù)為2.77l04moL/m。其中還原型最穩(wěn)定，實驗中所獲得的細(xì)胞色素產(chǎn)品是氧化型和還原型的混合物。經(jīng)氧化劑或還原劑處理，可變?yōu)閱我环N型。測定其中一種的光吸收，根據(jù)磨爾消光系數(shù)，即可計算出細(xì)胞色素C的含量。根據(jù)生物大分子所帶電荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝膠電泳測定細(xì)胞色素C的相對分子質(zhì)量關(guān)鍵詞 細(xì)胞色素C制備 相對分子質(zhì)量

2、 電泳法 測定中國分類號： 文獻(xiàn)識別碼： 文章編號：Preparation of cytochrome c and molecular weight determination Zhong Ri Long () Zhao Yang(College of Life Science, Shanxi University Taiyuan, Shanxi Province No. 92Dock Road, City Zip: )Summary of oxidized cytochrome C in the 408nm, 530nm maximum absorption peak of reduced

3、cytochrome C at 415nm, 520nm and 550nm absorption maximum. Seoul mill at 550nm extinction coefficient 2.77 l04moL / m. Which is also the most stable prototype experiment in the product obtained is oxidized cytochrome and also the prototype of the mixture. By oxidizing or reducing agent treatment, in

4、to one single type. One measurement of light absorption, extinction coefficient based on grinding Seoul, you can calculate the cytochrome C content. According to the charge of biological macromolecules amount and size of the different rare diseases using SDS-poly amine acid gel electrophoresis of cy

5、tochrome C, molecular weight Key words cytochrome C preparation electrophoresis for determination of molecular weight 正文1. 前言細(xì)胞色素C是有效的電子傳遞體，對因組織缺氧引起的一系列癥狀，起到矯正細(xì)胞呼吸與物質(zhì)代謝作用。臨床上細(xì)胞色素C主要用于治療因組織氧化還原過程障礙及因組織缺氧所引起的一系列疾病，如改善腦血管障礙、腦出血、腦外傷、腦動脈硬化、腦栓塞、中風(fēng)后遺癥等引起的氧缺乏等癥狀；治療一氧化碳中毒、催眠劑中毒、新生兒假死、視神經(jīng)癥以及因心臟代謝障礙、心絞痛引起的心肌組織

6、缺氧等。也可應(yīng)用細(xì)胞色素C治療因支氣管哮喘和慢性肺炎所致的肺功能不全。有報道對進(jìn)行性肌肉萎縮癥也有較好療效。其腸溶衣口服片對放療和化療引起的白細(xì)胞降低等也有改善作用。細(xì)胞色素是只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色C (cytochrome c) 是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B 和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，耐熱、酸堿，不易變性。細(xì)胞色素C ，相對分子質(zhì)量約為13000，蛋白質(zhì)部分由104 個左右的氨基酸殘基組成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性溶液中提取。其制品分為氧化型和還原型兩

7、種 ，前者水溶液呈深紅色 ，后者水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱、酸和堿都比較穩(wěn)定 ，但三氯乙酸和乙酸可使之變性 ，引起失活。吸附劑通常在微酸性(pH56)或低鹽溶掖中吸附蛋白質(zhì)。吸附于吸附劑上的蛋白質(zhì)在微堿性或較高改濃度條件下即可洗脫下來。還原型細(xì)胞色素C波長520nm處有最大吸收值，根據(jù)這一特性作出一條標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞色素C濃度和對應(yīng)的光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測得的待測樣品溶液的光密度值就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率求出待測樣品的含量。根據(jù)生物大分子所帶電荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝膠電泳測定細(xì)胞色素C的相對分子質(zhì)量。細(xì)胞色素C在動物心肌和酵母中含量豐富，可作為實驗材料。所以本實驗以新鮮豬

8、心臟為材料。2. 實驗部分21主要實驗器材與試劑 絞肉機；電磁攪拌器；電動攪拌器；離心機；72l型分光光度計；玻璃柱(2.530cm)；下口瓶；燒杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和紗布；玻璃棒；透析袋沸石（80目）濾紙 三恒電泳儀 垂直平板電泳槽 移液器 燒杯 直尺2MH2SO4溶液；1MNH4OH溶液；固體硫酸銨25硫酸銨溶液:100m1蒸餾水中含25克硫酸銨，約相當(dāng)于25時40的飽和度0.2氯化鈉溶液：稱0.2克氯化鈉，用蒸餾水溶解并定容至100ml.BaCl2試劑：稱12克BaCl2,溶于100ml蒸餾水中。20三氯醋酸溶液聯(lián)二亞硫酸鈉(Na2S2O42H2O

9、)凝膠貯液 分離膠緩沖液 10%SDS 濃縮膠緩沖溶液 樣品緩沖液 電移緩沖液 低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 染色液 脫色液 10%過硫酸銨 待測維生素 C 樣品2.2 試驗方法2.2.1 實驗原理向心肌中加入三氯乙酸溶液，進(jìn)行勻漿，大部分的蛋白質(zhì)都沉淀下來，細(xì)胞色素C則留在三氯乙酸溶液中。將硫酸銨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸銨與抽提液中的肌紅蛋白、血紅蛋白等一起沉淀下來，細(xì)胞色素C仍留于溶液中。再用乙酸乙酯酸化此溶液，細(xì)胞色素C就沉淀出來，然后透析并鑒定之。鑒定及測定細(xì)胞色素C用消光法。在550毫微米波長下，細(xì)胞色素C的克分子消光值為：氧化型細(xì)胞色素C：K1=0.9104/克分子/厘米還原型細(xì)

10、胞色素C：K2=2.77104/克分子/厘米其含義為濃度是1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型細(xì)胞色素C溶液，通過1厘米的光程，其消光值為0.9104。樣品較純時，從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型或者從還原型轉(zhuǎn)變成氧化型，消光值相同。若樣品不純，含有其他色素，則測得的變化不可靠?！?】本實驗細(xì)胞色素C的產(chǎn)率50mg/公斤，蛋白質(zhì)的含量0.5mg/mL，則實驗成功。2.2.2 試驗流程 材料處理-提取-中和-吸附與洗脫-三氯醋酸沉淀-透析-鑒定-測定2.3實驗操作 2.3.1細(xì)胞色素C的制備 材料處理取新鮮豬心，用水洗去積血，除去脂肪和韌帶，將豬心切成小塊，放入組織搗碎機，加入2倍體積的蒸餾水，絞碎。 提

11、取 用1M H2S04調(diào)pH至3.8(此時溶液呈暗紫色)，在室溫下攪拌提取2小時，在即將提取完畢，停止攪拌之前，以2M 氨水調(diào)pH至6.0，停止攪拌。用八層普通紗布壓擠過濾，收集濾液。按同樣程序處理濾渣，合并兩次提取液。 中和 用2mol/L 氨水將提取液調(diào)至pH 7.5(此時，等電點接近7.5的一些雜蛋白溶解度小，從溶液中沉淀下來)，冰浴中靜置3040分鐘中后過濾，收集濾液。 吸附與洗脫 人造沸石的預(yù)處理：稱取人造沸石（每升提取液約需80目沸石10克)，放入燒杯中，加水?dāng)嚢?，除?2秒鐘內(nèi)不下沉的過細(xì)顆粒。 裝柱：選擇一個底部帶有濾膜的干凈的玻璃柱(2.530 cm)，柱下端連接一乳膠管，用

12、夾子夾住，柱中加入蒸餾水至2/3體積，保持柱垂直，然后將已處理好的人造沸石帶水裝填入柱，注意一次裝完，避免柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡。 上樣：柱裝好后，打開夾子放水(柱內(nèi)沸石面上應(yīng)保留一薄層水)將準(zhǔn)備好的提取通過人造沸石柱進(jìn)行吸附。柱下端流出液的速度為1.0ml/分鐘。隨著細(xì)胞色素C的被吸附，柱內(nèi)人造沸石逐漸由白色變?yōu)榧t色，流出液應(yīng)為黃色或微紅色。 洗脫：吸附完畢，將紅色人造沸石從柱內(nèi)取出，放入燒杯中，先用自來水，后用蒸餾水?dāng)嚢柘礈熘了?，再?.2NaCl溶液分三次洗滌沸石，再用蒸餾水洗至水清，按第一次裝柱方法將人造沸石重新裝入柱內(nèi)，用25硫酸銨溶液洗脫，流速大約2ml/分鐘，收集含有細(xì)胞色素C的紅色洗脫

13、液，當(dāng)洗脫液紅色開始消失時，即洗脫完畢。人造沸石可再生使用。 人造沸石再生：將使用過的沸石，先用自來水洗去硫酸銨，再用0.25M氫氧化鈉和lM氯化鈉混合液洗滌至沸石成白色，前后用蒸餾水反復(fù)洗至pH78，即可重新使用。 鹽析為了進(jìn)一步提純細(xì)胞色素C，在上面收集的洗脫液中，加入固體硫酸銨(按每l00m1洗脫液加入20克固體硫酸銨的比例)邊加邊攪拌，放置30分鐘后，雜蛋白便從溶液中沉淀析出，而細(xì)胞色素C仍留在溶液中，用濾紙(或離心)除去雜蛋白，即得紅色透亮細(xì)胞色素C溶液。 (6) 三氯醋酸沉淀 在攪拌情況下向所得透亮溶液中加入20三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1細(xì)胞色素C溶液)，細(xì)胞色素C立

14、即沉淀出來（沉淀出來的細(xì)胞色素C屬可逆變性)，立即于3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集沉淀。加入少許蒸餾水，用玻棒攪拌，使沉淀溶解。 透析 將沉淀的細(xì)胞色素C溶解于少量的蒸餾水后，裝入透析袋，在500m1燒杯中對蒸餾水進(jìn)行透析除鹽(電磁攪拌器攪拌)，15分鐘換水次，換水3至4次后；檢查透析外液SO42-是否已被除凈。檢查方法：取2m1 BaCl2溶液于試管中，滴加2至3滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42-未除凈，反之，說明透析完全，將透析液過濾，即得細(xì)胞色素C制品。 2 鑒定取制品與CBB試劑反應(yīng)，觀察顏色變化。2.3.2細(xì)胞色素c的定量測定樣品測定 取1ml樣品，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，

15、再加少許聯(lián)二亞硫酸鈉，在波長520nm處測定光密度。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算其細(xì)胞色素C的含量。2.3.3相對分子質(zhì)量的測定2.3.3.1 將垂直電泳槽裝好，用15%瓊脂趁熱灌制于電泳槽平板玻璃的底部，以防漏。2.3.3.2 分離膠的選擇和配置方法（1）按照蛋白質(zhì)不同的相對分子質(zhì)量選用不同的分離膠 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的范圍分離膠的濃度5*1052%-5%(2)不同分離膠的配置方法分離膠的濃度20%15%12%10%7.5% 重蒸水1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)/ml質(zhì)量濃度10%SDS/mL凝膠貯備液（Acr/Bis）/ml量濃度為10%過硫酸銨、ul TEMED/ul總體積

16、、ml0.752.50.16.6505102.352.50.15.0505103.352.50.14.0505104.052.50.13.3505104.852.50.12.5505102.3.3.3 分離膠的灌制 根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對分子質(zhì)量選擇合適的分離膠濃度，本實驗選用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）為待測相對分子質(zhì)量的樣品，用12%的分離膠。在15 ml試管中依次加入重蒸水3.35ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml緩沖液2.5ml,10%SDS/mL, 凝膠貯備液4.0ml, 10%過硫酸銨50ul和TEMED5ul,由于加入TEMED后凝膠就開始聚合，實

17、驗應(yīng)立即混勻混合液，然后用滴管吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，留出梳齒的齒高加1cm的空間以便灌注濃縮液。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約30到60分鐘，分離膠則聚合，待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水，盡可能去干凈。2.3.3.4濃縮膠的配置與灌制一般采用5%的濃縮膠，配制方法：重蒸水2。92ml,0.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)1.25ml, 10%SDS0.05ml, 凝膠貯備液（Acr/Bis）0.8ml,10%過硫酸銨25ul, TEMED 5ul, 在試管中混勻，灌注在分離膠上。小心插入梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直靜置

18、于室溫下至濃縮膠完全聚合（約30min ）。2.3.3.5 樣品的制備（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備取出一管預(yù)先分裝好的20ul低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱35分鐘，取出冷至室溫。（2）待測蛋白質(zhì)樣品的制備a, 10ulVEGF(約含5ugVEGF)加10ul 2倍還原緩沖液。b, 10ulVEGF(約含5ugVEGF)加10ul 2倍非還原緩沖液。以上a,b兩管均同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品一樣，放入沸水浴中加熱35min, 取出冷至室溫. 2.3.3.6 電泳（1）待濃縮膠完全聚合后，小心拔出梳齒，用電極緩沖液洗滌加樣孔（梳孔）數(shù)次，然后將電泳槽注滿電極緩沖液。（2）用微量注射器按號向凝膠梳孔內(nèi)

19、加樣（3）接上電泳儀，上電極接電源的負(fù)極，下電極接電源的正極。打開電泳儀電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至2030mA并保持電流強度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端1cm時停止電泳。2.3.3.7染色與脫色小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中，在溴酚藍(lán)條帶的中心插一細(xì)鋼絲作為標(biāo)志。加染色液染色1h，傾出染色液，加入脫色液，數(shù)小時更換一次脫色液，直至北京清晰。2.3.3.8相對分子質(zhì)量的計算用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及鋼絲距分離膠頂端的距離，按下式計算遷移率：相對遷移率=樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mr的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相

20、對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相對分子質(zhì)量。3結(jié)果與分析一 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 取1毫升標(biāo)準(zhǔn)品(81mg/ml)，稀釋至25ml，從中分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分別置于五支試管中，每管補加蒸餾水至4m1，并加少許聯(lián)二亞硫酸鈉作還原劑，然后在520nm處測得各管的光密度，分別為0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 濃度00.1620.3240.4860.6480.81光密度值00.1790.330.520.7087經(jīng)測得樣品吸光光度值為0.308在圖中可讀出樣品的濃度為0.329計算得樣品 m=2.139mg二利用SDS-聚病稀酰的胺凝膠電泳測定細(xì)胞色素C的相對分子質(zhì)量123456樣