高產果膠酶菌株的篩選食品科學與工程畢業(yè)論文

1、目 錄前言- 2 -1 材料與方法- 3 -1.1材料- 3 -1.2試劑- 3 -1.3儀器設備- 3 -1.4試驗方法- 3 -1.4.1技術路線- 4 -1.4.2菌種分離- 4 -1.4.3菌株培養(yǎng)條件的研究- 5 -2結果與分析- 6 -2.1初篩結果- 6 -2.2復篩結果- 6 -2.3菌種形態(tài)觀察- 7 -2.4單因素試驗結果- 7 -2.4.1碳源對菌株產酶能力的影響- 7 -2.4.2氮源對菌株產酶能力的影響- 7 -2.4.3表面活性劑對菌株產酶活性的影響- 8 -2.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值對菌株產果膠酶的影響- 8 -2.4.5發(fā)酵溫度對菌株產果膠酶的影響- 8 -

2、2.5正交試驗結果- 9 -3 結論- 10 -參考文獻- 11 -致謝- 13 -高產果膠酶菌株的篩選摘要：本試驗采用平板分離法，從腐爛的水果（蘋果、梨、棗、甜瓜、籽瓜）中進行高產果膠酶菌株的篩選。同時，通過單因素試驗和正交試驗對菌株的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。試驗結果表明：菌種的最適碳源為葡萄糖，濃度為1.5%；最適氮源為蛋白胨，濃度為0.6%；最佳表面活性劑為吐溫-60，濃度為0.01%；最適ph值為3.8；最適發(fā)酵溫度為43。在此條件下菌株的產酶能力可以達到10758 u/.ml。關鍵詞：果膠酶，篩選，培養(yǎng)條件優(yōu)化前言果膠酶（pectinases）是指能分解果膠質的多種酶的總稱，不同來源的果

3、膠酶其特點也不同，微生物來源的果膠酶主要有聚半乳糖醛酸酶(pg)，聚半乳糖醛酸裂解酶(pgl)、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(pmgl）和果膠酯酶(pe)1。pg在果膠酶系中發(fā)現(xiàn)較早，它可以水解d-半乳糖醛酸-1,4糖苷鍵，產物為單半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸；pgl通過切斷果膠分子-1,4糖苷鍵，生成具有不飽和鍵的半乳糖醛酸酯；pmgl可以切斷果膠分子-1,4糖苷鍵，產物為28個糖醛酸單位的不飽和的甲基半乳糖酸低聚物；pe能夠使果膠中的甲酯水解，生成果膠酸和甲醇2。產果膠酶的菌種一般可以從腐爛的果蔬以及果園泥土中的微生物中利用果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中篩選出來。野生菌株的酶活力往往很低，必須對其進行

4、誘變及發(fā)酵條件的優(yōu)化等以改善菌株的產酶性能。果膠酶的工業(yè)化生產均采用微生物發(fā)酵方法進行。產生果膠酶的微生物如表1所示3。表1 常用產果膠酶菌種微生物產果膠酶菌屬霉菌aspergillus、penicillium、rhizopus、fusarium細菌erwinia、pseudomonas、bacillus、clostridium酵母trichosporm、kluyveromyces、saccharomyces、aureobasidium商品酶制劑的生產菌主要是一些真菌。包括aspergillus niger，rhizopus oryzae，rhizomucor meihei等。reddy(19

5、97)概括了曲霉屬中產果膠酶的一些菌種，主要有a.flavus，a.niger，a.terreus，a.sydowii等。其中黑曲霉是國際公認的安全菌株，它的代謝產物可以直接應用于食品4。果膠酶在工業(yè)中的應用十分廣泛，主要集中在果汁果酒的澄清、果蔬汁的提取5、對水果和蔬菜進行浸解、液化以生產單細胞果汁和菜汁、果實脫皮、木材防腐、棉織物精煉加工等方面6。國內對果膠酶的研究始于20世紀60年代。八十年代以來我國學者對果膠酶菌種選育進行了廣泛的研究。田英華等選育了一株高產果膠酶的黑曲霉突變株 hya4，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下酶活力達1285 u/g7。全桂靜等利用平板菌落法，從腐爛的南果梨樣品中分離篩選

6、得到果膠酶高產菌株as2，果膠酶活性達到6 635u/g干曲8。albert等人利用不同真菌之間的協(xié)同效應將aspergillus niger和fusarium moniliforme進行混合培養(yǎng)，產生的果膠酶的活性可以達到1，041.6units/g dry weight)，是單獨培養(yǎng)aspergillus niger的1.7倍9。試驗采用平板分離法，從腐爛的水果（蘋果、梨、棗、甜瓜、籽瓜）中進行高產果膠酶菌株的篩選。同時，通過單因素試驗和正交試驗對菌株的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，旨在為降低企業(yè)生產成本，實現(xiàn)果膠酶的國產化提供一定的技術支撐。1 材料與方法1.1材料蘋果、梨、棗、甜瓜、籽瓜：市售。

7、1.2試劑果膠（美國sigma公司），硝酸銨，硫酸鈉，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵，磷酸氫二鉀，硝酸鈉，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，可溶性淀粉，硫代硫酸鈉，碘，碘化鉀，可溶性淀粉，硫酸銨，馬鈴薯，蔗糖，葡萄糖等。1.3儀器設備微量移液器（finnpipette，上海雷勃分析儀器有限公司），搖床（sha-c，金壇市恒豐儀器廠），高壓滅菌鍋（yx-280b型，上海綠宇精密儀器制造有限公司），電磁爐，水浴鍋，燒杯，試管，培養(yǎng)皿，接種針，碘量瓶，酸式滴定管等。1.4試驗方法1.4.1技術路線采樣富集培養(yǎng)初篩復篩培養(yǎng)條件優(yōu)化1.4.2菌種分離 培養(yǎng)基配方富集培養(yǎng)基：果膠2%，硝酸銨0.2%，硫酸鈉0.

8、05%。選擇培養(yǎng)基：果膠0.1%，蔗糖2.0%，硫酸鎂0.05%，氯化鉀0.05%，硫酸鐵0.001%，磷酸氫二鉀0.1%，硝酸鈉0.3%。菌種保藏培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：橘皮粉4 g，硫酸銨2g，三水磷酸氫二鉀 0.3g，氯化鉀0.6 g，七水硫酸鎂0.55g。 篩選參考張浩森（2008）方法10，進行產果膠酶菌株的篩選：（1）增殖培養(yǎng)：取采集的果園土及果蔬的腐爛部分少量，放入500ml裝有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，于30、180 rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，得增殖培養(yǎng)液。（2）菌株的初篩：取增殖培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法涂布于選擇培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)3天，加質量分數為1%十六

9、烷基三甲基溴化銨(多糖沉淀劑)，靜止10min，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的為產果膠酶的菌株。（3）菌株的復篩：挑取dp/dc較大的幾個菌落，劃線接種于選擇培養(yǎng)基上于37條件下培養(yǎng)3d，測定粗酶液酶活。酶活測定參考孫越（1997）、陳靜（1999）方法11,12，進行酶活測定：（1）酶液制備：將發(fā)酵液于4，8000r/min離心10min后取上清液作為粗酶液。（2）1%果膠溶液配制：取果膠粉1g，加熱溶解，煮沸，冷卻后過濾，調節(jié)ph值至3.5，定容至100ml。（3）酶活測定：取兩個100ml三角瓶，一個為酶液瓶(a瓶)，一個為空白瓶(b瓶)，并分別在a瓶、b瓶中各加入10ml的1%果膠

10、溶液，a瓶加5ml重蒸餾水和5ml酶液后調整ph值至3.5，b瓶中加10ml重蒸餾水，40水浴，準確計時1h，立即加熱煮沸使酶失活，冷卻至室溫。取上述a瓶、b瓶中溶液各5ml，分別加入另外兩個三角瓶a1、b1瓶中，然后各加1ml濃度為1mol/l的碳酸鈉溶液搖勻，再各加5ml濃度為0.05mol/l碘-碘化鉀溶液于兩個三角瓶中，搖勻，加塞，放置20min，再分別吸取2ml濃度為1mol/l硫酸加入上述兩個三角瓶，用0.05mol/l硫代硫酸鈉滴定至淡黃色時停止滴定，加入1ml濃度為0.5%的淀粉指示劑，此時溶液呈蘭色，繼續(xù)滴定至蘭色消失為止，記下消耗的硫代硫酸鈉體積：a1瓶為aml，b1瓶為b

11、ml。（4）數據處理：在上述條件下，將每小時酶促催化果膠分解成1mg游離的半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活性單位，具體計算公式如下；活性單位數/毫升酶液=(b-a)m0.5120/(515)式中：b空白消耗硫代硫酸鈉溶液體積(ml) a試樣消耗硫代硫酸鈉溶液體積(ml) m硫代硫酸鈉摩爾濃度 0.511摩爾硫代硫酸鈉相當于0.51g游離半乳糖醛酸 20反應液體積(ml) 5吸取反應液體積(ml) 1反應時間(h)1.4.3菌株培養(yǎng)條件的研究 單因素試驗（1）葡萄糖對菌株產果膠酶的影響分別以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%葡萄糖添加量作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進行產酶

12、試驗, 同時測定酶活，以確定發(fā)酵碳源最適添加量。（2）蛋白胨對菌株產果膠酶的影響分別以0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%蛋白胨添加量作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進行產酶試驗, 同時測定酶活，以確定發(fā)酵氮源最適添加量。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基中表面活性劑對菌株產果膠酶的影響分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%tween-60表面活性劑，進行產酶試驗，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基中添加表面活性劑最適添加量。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值對菌株產果膠酶的影響調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始ph值分別為3.5、4、4.5、5、5.5，進行產酶試驗。測定各個ph值下的菌株產酶能力。（5）

13、發(fā)酵溫度對菌株產果膠酶的影響分別在30、35、40、45、50對產酶菌株進行產酶試驗，測定各個溫度下的菌株產酶能力。正交試驗 根據單因素試驗結果，對碳源葡萄糖（a），氮源蛋白胨（b），表面活性劑吐溫-60（c），發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph（d）和發(fā)酵溫度（e）五個因素進行l(wèi)16（45）正交試驗，因素水平編碼值如表2。以果膠酶活力為評價指標，確定菌株最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件，并進行驗證試驗。表2 因素水平編碼表碼值因 素a(%)b(%)c(%)de()44.44734.24524.04313.84 數

14、據處理 試驗數據采用spss16.0進行處理2結果與分析2.1初篩結果初篩結果透明圈大小及dp/ dc值見圖1及表3。 圖1 初篩結果表3 菌株透明圈dp/ dc值菌株dp(cm)dc(cm)dp/ dca6a8a5a2a22.2復篩結果對dp/dc值最大的三株菌株進行液體培養(yǎng)，測定其果膠酶活力。測定結果如表4。表4 復篩酶活力比較菌株酶活（u/ml）a17692.1a29632.5a36543.52.3菌種形態(tài)觀察 通過革蘭氏染色在顯微鏡下觀察到該菌株為革蘭氏陰性短桿菌。2.4單因素試驗結果

15、2.4.1碳源對菌株產酶能力的影響待添加的隱藏文字內容2圖2葡萄糖添加量對菌株產酶能力的影響由圖2可知，隨著葡萄糖含量的逐漸增加，菌株的產酶能力先急劇增強再緩慢下降，當碳源葡萄糖的濃度為1.5%時，菌株的產酶能力最高，達到7013 u/ml，因此可得，菌株的最佳碳源葡萄糖濃度為1.5%。2.4.2氮源對菌株產酶能力的影響圖3蛋白胨添加量對菌株產酶能力的影響由圖3可知，隨著蛋白胨添加量的逐漸增加，菌株的產酶能力表現(xiàn)為先上升后下降的變化，當氮源蛋白胨的濃度為0.6%時，菌株的產酶能力最高，達到8791 u/ml，因此可得，菌株的最佳氮源蛋白胨的濃度為0.6%。2.4.3表面活性劑對菌株產酶活性的影

16、響圖4不同表面活性劑添加量對菌株產酶的影響圖4表面活性劑添加量對菌株產酶能力的影響由圖4可知，隨著表面活性劑添加量的逐漸增加，菌株的產酶能力變化幅度不大，當表面活性劑的濃度為0.03%時，菌株的產酶能力出現(xiàn)峰值，達到9224 u/ml，因此選擇菌株發(fā)酵的最佳表面活性劑添加量為0.03%。2.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值對菌株產果膠酶的影響圖5 ph值對菌株產酶能力的影響由圖5可知，隨著ph值的逐漸升高，菌株的產酶能力表現(xiàn)為先升高再降低趨勢。當ph值為4.0時，菌株的產酶能力達到最大值為8653 u/ml，隨著ph值的進一步升高，菌株的產酶能力逐漸下降。這主要是因為ph值的改變首先導致培養(yǎng)基的成分

17、發(fā)生變化，不利于菌株的利用，另外是由于ph值升高超出了產物酶的最適ph值范圍，致使測定結果偏低。2.4.5發(fā)酵溫度對菌株產果膠酶的影響 圖6 不同溫度對菌株產酶的影響由圖6可知，隨著溫度的逐漸升高，菌株的產酶能力表現(xiàn)為先升高再降低的變化。當溫度為45時，產酶能力達到最大值為9865 u/ml，隨著溫度的繼續(xù)升高，菌株的產酶能力表現(xiàn)為下降。2.5正交試驗結果由表5可知影響菌株產酶性能的主次因子依次為dce ab，即發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph表面活性劑吐溫-60發(fā)酵溫度碳源葡萄糖氮源蛋白胨。選取最佳組合為：a3b1c4d4e3，即葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐溫-60添加量0.01%，發(fā)酵培養(yǎng)基

18、初始ph值3.8，發(fā)酵溫度43。在此條件下菌株的產酶能力可以達到10758 u/ml。表5 正交試驗結果處理因素試驗結果（u/ml）abcde1111115888.32122223031.631333310040.34144443206.55212345771.76221436354.77234124547.48243216471.39313421399.2103243110552.311331242506.912342136762.813414235013.8144231410463.315432413381.416441326063.2k15541.6757600.4755203.2753

19、585.4506373.325k25786.2754518.2504736.8754255.9003760.350k36320.4255119.0005830.0006915.4507042.900k45305.3003082.2257093.5258106.8755487.1003 結論3.1由腐爛的大棗中篩選出的菌株初步鑒定為革蘭氏陰性短桿菌。3.2由單因素試驗得出菌株的最佳碳源為1.5%葡萄糖，最佳氮源為0.6%蛋白胨，最佳表面活性劑為0.03%吐溫-60，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph4.0，發(fā)酵溫度45。3.3由正交試驗得出菌株的最適發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐溫-60添

20、加量0.01%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值3.8，發(fā)酵溫度43。在此條件下菌株的產酶能力可以達到10758 u/ml。參考文獻1王璋,食品酶學.北京輕工業(yè)出版社,1990,164-1752周人綱,白玉山,kgierschner.果膠裂解酶的分離、提純及特征,微生物學通報,1990,17(2):88-923趙麗莉,微生物果膠酶研究及其在果蔬加工中的應用進展,2007,7(6):951-9534欽傳光,丹娃倫亭娜,丁諾狄安娜.果膠酶高產菌種的篩選j,中國釀造,2000,3(4):14-155趙允麟,趙莉.黑曲霉復合酶的調節(jié)與控制m.工業(yè)微生物,2001.9,31(3):19-226sakai,yozak

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