米曲霉的介紹

1、1.菌種特點(diǎn):米曲霉（屬于真菌 菌落生長快，10d直徑達(dá)56cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹?色至淡綠褐色。背面無色。分生孢子頭放射狀， 一直徑150300卩m,也有少數(shù)為疏松柱狀。 分生孢子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)1225卩m,壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常4050卩m。上覆小梗，小梗一般為單層，1215卩m,偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生孢子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，長大后多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，般卩m，粗糙或近于光滑。（半知菌亞門絲孢鋼絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個(gè)常見 種）。菌落生長較快，質(zhì)地疏松。初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，分 布

2、甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。是我國傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的 生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等。會引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變。米曲霉（Aspergillus oryzae）具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，其穩(wěn)定性高 能耐受較高的溫度，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。米曲霉也是美國食品與藥物 管理局和美國飼料公司協(xié)會1989年公布的40余種安全微生物菌種之一。米曲霉米曲霉是一類產(chǎn)的，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈降解為糊精及各種低分子糖類，如、等；在蛋白酶的作用下，將不 易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為、及

3、各種，而且可以使輔料中、等難吸收的物質(zhì)，提高 營養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于、生產(chǎn)曲酸、等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了 1000多年。米曲霉是理想的生產(chǎn)不能表達(dá)的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。米曲霉基因組的破譯，也為研究由曲霉屬真菌引起的曲霉病提供了線索。曲霉 （Aspergillus oryzae） 具有豐富的蛋白酶系 , 能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白 酶, 其穩(wěn)定性高 ,能耐受較高的溫度 ,廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。影響米曲霉系的因素影響米曲霉酶系形成、作用的因素主要有：1曲料：曲料

4、米曲霉的菌絲由多細(xì)胞組成，具有產(chǎn)酶功能，菌絲體在曲料上生長好壞 直接關(guān)系到其酶系的形成和酶活性的強(qiáng)弱。 醬油制曲過程的實(shí)質(zhì)就是要?jiǎng)?chuàng)造米曲霉生長的最 適宜條件， 保證米曲霉充分發(fā)育繁殖， 分泌出釀造醬油所需的各種酶類。 所以制曲原料的選 擇、處理和配比要嚴(yán)格把關(guān)。 曲料要以蛋白質(zhì)含量較高、 碳水化合物適量為原則進(jìn)行選擇配 比。曲料的處理要注意以下幾點(diǎn)： 1。粉碎要適度。顆粒太粗，會減少米曲霉生長繁殖的總 面積，降低酶活力；顆粒太細(xì)，潤水后容易結(jié)塊，蒸料時(shí)會產(chǎn)生夾心，導(dǎo)致制曲通風(fēng)不暢， 不利于米曲霉的生長。 2。蒸煮要適度。控制蛋白質(zhì)的適度變性，蛋白質(zhì)的變性過程對米曲 霉生長極其重要。 .2溫度醬

5、油發(fā)酵的過程就是各種酶促反應(yīng)的過程， 溫度越高， 酶促反應(yīng)越快， 發(fā)酵周期越短。 然而，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)， 它具有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性， 一般在低溫時(shí)就開始受到破壞， 并隨著溫度的升高，酶受到的破壞程度變大。3 PH 值：PH 對酶的影響主要有： （ 1）影響酶的穩(wěn)定性； （2）影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底 物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。在一定的條件下，各種酶都有其特定的最適 PH 值。偏離這個(gè)值，酶的活性 都會降低，甚至?xí)鹈傅鞍踪|(zhì)的變性而失去活性。4食鹽：食鹽對酶促反應(yīng)的影響在醬油發(fā)酵過程中，添加適量的食鹽能夠有效地抑制一些有害 微生物的生長和繁殖， 對醬培起著防腐作用。 食鹽對蛋白酶活性的影響：

6、低質(zhì)量濃度的食鹽 對蛋白酶有激活作用， 反之對蛋白酶產(chǎn)生抑制作用， 所以發(fā)酵狀態(tài)對酶促反應(yīng)的影響采用低 鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，由于醬醅內(nèi)部粘性大、 流動性差，保溫時(shí)底部和周壁的溫度較高，酶的失 活加速，很不利于酶作用的發(fā)揮醬油生產(chǎn)中的米曲霉：醬油釀造過程主要依賴于米曲霉所產(chǎn)生的豐富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶 系,未分解原料中的多種成分 ,從而形成醬油獨(dú)特的色、香、味、體。培養(yǎng)米曲霉菌種挑選原料煮豆 -制曲發(fā)酵壓榨配置醬油 罐裝檢測生產(chǎn)過程中需用到米曲霉的是制曲和發(fā)酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生長 發(fā)育，并大量產(chǎn)生和積蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶、纖 維素酶、

7、半纖維素酶等。 在發(fā)酵過程中味的形成是利用這些酶的作用。 如蛋白酶及肽酶將蛋 白質(zhì)水解為氨基酸， 產(chǎn)生鮮味； 谷氨酰胺酶把萬分中無味的谷氨酰胺變成具有鮮味的俗谷氨 酸；淀粉酶將淀份水解成糖，產(chǎn)生甜味； 果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等能將細(xì)胞壁完全 破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更徹底。制成的醬曲移入發(fā)酵池或發(fā)酵罐，再加鹽水發(fā)酵。 發(fā)酵是一個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程 ,通過溫度和時(shí)間 ,讓米曲霉分泌多種酶 ,其中是蛋白酶和淀粉酶、 蛋 白酶分解蛋白質(zhì)為氨基酸 ,淀粉酶把淀粉分解成葡萄糖。2.米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用米曲霉發(fā)酵產(chǎn)各種酶制劑 發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶及應(yīng)用 米曲霉在食品釀造方面的應(yīng)用歷史悠久,近些年在飼料加工方面

8、的研究也日趨深入,這些方面的研究主要集中在米曲霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶方面上。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,米曲霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶可以水解鱈魚粉制備蛋白胨。蛋白胨廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、衛(wèi)生、臨床細(xì)菌檢驗(yàn)及科研 等方面?？梢姷鞍酌冈诋a(chǎn)品深加工領(lǐng)域也將會創(chuàng)造更大效益。發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶及應(yīng)用淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括a -淀粉酶、3 -淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。淀粉酶是一種誘導(dǎo)酶 ,這類酶的形成只有在底物存在時(shí)才能生成 ,其作用是將淀粉或糖漿 中殘留的淀粉進(jìn)一步徹底降解為單糖即葡萄糖、果糖等。單糖對產(chǎn)品的色、香、味、體都有 重要影響。發(fā)酵產(chǎn)3 -半乳糖苷酶及應(yīng)用3 -半乳糖苷酶可消除乳糖不耐癥，米曲霉所代

9、謝出的3-半乳糖苷酶能夠水解牛乳和乳清中的乳糖 ，成為可以吸收和甜味品質(zhì)好的半乳糖和葡萄糖。同時(shí)又能合成低聚半乳糖，此糖是雙岐桿菌增值因子 ，難以被人體消化 ，能改善便秘 ，具降低血糖 ，促進(jìn)鈣的吸收 ，抗齲齒等作用 6。 發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶及應(yīng)用脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，將脂肪分解成脂肪酸和甘油并廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、 醫(yī)藥、 日化等工業(yè)。不同來源的脂肪酶具有不 同的催化特點(diǎn)和催化活力。王小花 7等人對米曲霉產(chǎn)胞外脂肪酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出麥芽糖為最佳碳源 ，蛋白胨為最佳氮源 ，平高級脂肪醇與環(huán)氧乙烷加成物為最佳的表面活性劑 為米曲霉產(chǎn)脂肪酶方向

10、的研究提供了參考。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及應(yīng)用纖維素酶系一般包括三種水解酶,即內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶(C1)、3 -葡萄糖苷酶(3 G)。纖維素酶在食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品加工、石油開采和資源再利用等方面具有廣泛應(yīng) 用前景。黃曉東 8 等人利用豆渣對米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵得出:提取物的抗氧化性增強(qiáng)。經(jīng)分析驗(yàn)證 ,米曲霉代謝所產(chǎn)生的3-葡萄糖苷酶 (3 G )使豆渣中異黃酮糖苷酶酶解為異黃酮苷元。異黃酮苷元具有很強(qiáng)的抗氧化性。發(fā)酵產(chǎn)果膠酶及應(yīng)用果膠酶是分解果膠的酶的通稱 ,也是一個(gè)多酶復(fù)合物。果膠酶主要是由果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、 果膠酸鹽裂解酶和果膠酯酶組成。 果汁超濾通量、提高葡萄酒得率及過

11、濾速度 9 等對米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究 件。果膠酶可以降低果汁的粘度、 澄清果汁、 提高 ,其應(yīng)用對食品加工業(yè)做出了很大貢獻(xiàn)。湯鳴強(qiáng) ,得出米曲霉菌株 F-81 發(fā)酵條件及浸提條發(fā)酵產(chǎn)氨基?；讣皯?yīng)用氨基?；甘且活惸軐Ｒ凰釴-乙酰-DL-氨基酸的酰胺鍵的酶，由于這種立體專一性，所以很早就被用來拆分 DL-氨基酸。L-型、D-型氨基O發(fā)酵產(chǎn)植酸酶及應(yīng)用 目前植酸酶在飼料添加劑市場需求很廣?？梢蕴岣咔萑?、禽蛋的氮、磷、鈣利用率。 陳惠 11等人對微生物產(chǎn)植酸酶的條件及熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究，對比了黑曲霉 9701、米曲霉9712、根霉 9702 三種霉菌的固體培養(yǎng)法生產(chǎn)植酸酶的條件。由文獻(xiàn)

12、是對比研究，所以要單向研究米曲霉 ，可參考此法進(jìn)行深入研究。發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶及應(yīng)用 大豆異黃酮以游離甙元和結(jié)合型的糖苷形式存在，前者生理活性很好 ，后者必須轉(zhuǎn)化為甙元的形式才能更好的被吸收。大豆異黃酮有抗腫瘤作用，尤其是對與激素有關(guān)的腫瘤，如乳腺癌和前列腺癌有顯著抑制作用 ，另外對治療和預(yù)防心腦血管疾病有很好的療效。但大多數(shù)大豆異 黃酮都是以結(jié)合型糖苷形式存在，所以用米曲發(fā)酵產(chǎn)分解糖苷的酶的研究具有社會意義和經(jīng)濟(jì)效益。曾瑩 12 等人研究并優(yōu)化了米曲霉高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷酶發(fā)酵條件 ，為這一領(lǐng)域的研 究實(shí)踐做出了貢獻(xiàn)。發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸脫氨酶及應(yīng)用腺苷酸 (AMP) 脫氨酶是一種氨基水解酶 ，它

13、能夠定量脫去腺苷酸嘌呤堿基上的氨基，生成肌苷酸 (IMP) 和 NH3。 IMP 可用于生產(chǎn)藥品和強(qiáng)力味精。 AMP 脫氨酶是構(gòu)成嘌呤核苷酸代謝 循環(huán)的 3 種主要酶類之一 ，它對維持體內(nèi)腺苷酸能荷和機(jī)體免疫力有重要作用。此外，它還是核酸酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸 (鈉鹽是新一代的核苷酸類食品鮮味增強(qiáng)劑)的重要酶類之一。 國內(nèi)雖在 20 世紀(jì) 80 和 90 年代對曲霉 AMP 脫氨酶進(jìn)行了研究 ，但目前尚未工業(yè)化生產(chǎn)。段作 營13等人通過實(shí)驗(yàn)獲得了米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸 (AMP) 脫氨酶的適宜培養(yǎng)基并對組成進(jìn) 行了優(yōu)化 ，確定了麩曲中 AMP 脫氨酶的浸提條件 ，對其進(jìn)行了初步純化 ，為將來工業(yè)

14、化生產(chǎn)提 供依據(jù)。發(fā)酵產(chǎn) SI 核酸酶及應(yīng)用SI核酸酶(SI nuclease)是從米曲霉中分離純化的一種金屬蛋白，分子量為32kDa,是一種耐熱的酶(3765 C )?？捎糜诜治?DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn) 生平末端，打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。Vogt14等人于1973年對米曲霉產(chǎn)的SI核 酸酶進(jìn)行了純化和進(jìn)一步的性質(zhì)研究，至今相關(guān)的資料并不多見。發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合酶及應(yīng)用米曲霉菌絲體可以催化藥物合成3,4-二羥苯L-丙氨酸是一種藥物，它不僅可以選擇性的調(diào)節(jié)因神經(jīng)鞘受損后心肌膜能量代謝所產(chǎn)酶的的水平，而且還可以治療帕金森病。 米曲霉UV-7可產(chǎn)酪氨酸羥化酶

15、、 酪氨酸酶和B-酪氨酸酶,這三種酶可以催化 L-酪氨酸合成 3,4-二羥苯L-丙氨酸，這一微生物學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)樯?領(lǐng)域通往藥物域又開辟一條新徑 15 。米曲霉催化甘油生產(chǎn) 1，3-丙二醇1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一種重要的化工原料，是有機(jī)合成的中間體，主要用作聚酯和聚氨酯 的單體 ，以及溶劑、 分析試劑、 抗凍劑和保護(hù)劑等。 苑廣志 16等人采用以甘油為唯一碳源和 以甘油與葡萄糖共同作碳源的方法從米曲霉菌 AS3042 和 UV-48 出發(fā)，篩選到兩株催化甘油 生產(chǎn) 1，3-丙二醇的霉菌。生物催化法生產(chǎn)化工原料具有節(jié)能、環(huán)保、高效等特點(diǎn)，成為人們研究熱點(diǎn) ，也為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。米曲

16、霉發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸的研究與應(yīng)用發(fā)酵產(chǎn)曲酸曲酸是一種具有抗菌作用的有機(jī)酸 ，對水果、 蔬菜有護(hù)色作用 ，還可以消除人體內(nèi)自由基 ，同時(shí) 具有抑制黑色素生成酶活性的能力 ,還可用作攝影、膠片去斑劑等 ,因此在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。董靜17 等人研究了復(fù)合誘變對米曲霉2336產(chǎn)酸量的影響 ,經(jīng)過紫外線、 60Co 誘變篩選出 1 株不產(chǎn)黃曲霉毒素且高產(chǎn)曲酸、能利用玉米 淀粉為碳源的變異株。發(fā)酵產(chǎn)圓弧偶氮酸圓弧偶氮酸是一種神經(jīng)毒。趙珊 18 等人利用反相高效液相色譜法分析米曲霉發(fā)酵液中的圓 弧偶氮酸。該方法為米曲霉代謝產(chǎn)物研究開辟新徑。30 總第 350 期 中國調(diào)味品

17、霉作為牲畜的益生素 益生素是一種含有大量有益菌及其代謝產(chǎn)物和生長促進(jìn)因子的活菌制劑,它能維持腸道微生物平衡、提高機(jī)體健康水平。 1994 年我國批準(zhǔn)了 6種益生菌菌株可以使用 ,其中包括米曲霉 (其 余 5 種為芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和黑曲霉) 。米曲霉及其提取物對牲畜、家禽的消化功能、生產(chǎn)功能都有很大影響。孫安權(quán) 19 等人研究了米曲霉提取物對瘤胃生態(tài) 及奶牛生產(chǎn)性能的影響。瘤胃是反芻動物的一種特殊的消化器官,在消化過程中起到很重要的作用。此項(xiàng)研究表明 ,米曲霉發(fā)酵提取物艾美福 (Amaferm) 通過刺激纖維素分解菌的生長 ,提高 纖維素酶的產(chǎn)量 ,提高飼草中纖維的消化率 ,

18、改善反芻動物瘤胃生理功能 ,穩(wěn)定瘤胃 pH 值 ,從而 達(dá)到降低奶牛代謝疾病 ,提高反芻動物的生產(chǎn)性能及體況,顯著提高奶?？篃釕?yīng)激的能力。Han 等人 (1999)通過對產(chǎn)蛋雞飼喂米曲霉益生素的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:不能排除外源性米曲霉在胃腸道中與內(nèi)源性菌群有協(xié)同互作的作用。 Grimes 等 (1997)進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn) ,以測定米曲霉 和黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物 Fermacto福美多”對產(chǎn)蛋母雞的功效。Fermacto是我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)口 美國培一埃公司生產(chǎn)的益生素飼料添加劑。試驗(yàn)結(jié)果表明 ,向產(chǎn)蛋母雞日糧中添加 %的米曲 霉益生素可以影響營養(yǎng)元素消化、調(diào)節(jié)膽固醇代謝及腸道菌群 ,并減少氨氣的產(chǎn)生。3 研

19、究結(jié)果以米曲霉 A-29 菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)酶菌株的篩選。研究結(jié)果表明，米曲霉A-29在豆米粉%、(NH4)%、水40%、%、麩皮%的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)酸性蛋白酶活力最高， 發(fā)酵溫度為30C,最適發(fā)酵時(shí)間為 72h。酸性蛋白酶是一種適合在酸性條件下水解蛋白質(zhì)為小肽和氨基酸的酶類。酸性蛋白酶的條件：(1 )、pH值適應(yīng)性 酸性蛋白酶作用的最適穩(wěn)定pH范圍在之間，最適，低于，高于將影響水解速度。曲霉屬一般在以下。(2) 、溫度適應(yīng)性酸性蛋白酶一般在 50 C以下可保持穩(wěn)定，曲霉屬所產(chǎn)的酶在 50C仍穩(wěn) 定，但在55 C處理10分鐘就失活。(3) 、金屬離子對酶活力地影響酸性蛋白酶可被 M

20、n2+、Ca2+、Mg2+離子激活，被 Cu2+、 Hg2+、Al2+離子抑制，液體酸性蛋白酶，長時(shí)間存放碳鋼罐中將失活較多。4. 材料及儀器材料和試劑培養(yǎng)基：1. 麥芽汁斜面培養(yǎng)基：取已制備好的麥芽汁，調(diào)糖度為8%加2%瓊脂，PH自然，融化后分裝試管，121 C，高溫蒸汽滅菌20分鐘，制成斜面培養(yǎng)基。2. 優(yōu)化出的酸性蛋白酶最佳正交培養(yǎng)基：豆米粉 %、(NH4) %、水40%、 %、麩皮%。 菌種：米曲霉 A-29, 保存菌株的培養(yǎng)基為麥芽汁斜面培養(yǎng)基。發(fā)酵方法1. 菌株的轉(zhuǎn)接將米曲霉A-29在無菌操作條件下使用接種環(huán)接入斜面培養(yǎng)基中，并置于恒溫培養(yǎng)箱中29 C培養(yǎng)96h，使之全部孢子化后取

21、出備用。2. 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)在500ml三角瓶中裝入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，玻璃棒攪勻后，121 C下滅菌20分鐘，冷卻后在超凈工作臺上將轉(zhuǎn)忠后的菌株孢子接入裝有固態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)培養(yǎng)基接23環(huán)孢子，混勻。然后置于恒溫培養(yǎng)箱中29 C培養(yǎng)72h.分析方法1. 酶的提取稱取發(fā)酵后的培養(yǎng)物，用80ml緩沖液在研缽中搗碎充分溶解，然后將混合液經(jīng)濾紙過濾，取濾液5ml加蒸餾水定容至100ml，既得稀釋800倍的待測酶液。2. 酸性蛋白酶酶活的測定a. 先將酪素液放入 40C恒溫水浴中預(yù)熱 5分鐘b. 測定：在試樣管中，取經(jīng) 40C預(yù)熱2分鐘的稀釋酶液，加入預(yù)熱的 10g/l酪素溶液，于40C 保溫10分

22、鐘，立即加入I的三氯乙酸溶液以終止反應(yīng)。在空白對照管中，取經(jīng)40C預(yù)熱2分鐘的稀釋酶液，先加入I的三氯乙酸溶液，于40C保溫10分鐘，再加入預(yù)熱的10g/l 酪素溶液。將上述的試樣管和空白對照管取出靜止10分鐘后過濾，取濾液，加入 I碳酸鈉溶液，再加福林試劑，40C水浴中顯色20分鐘取出，冷卻后在 680nm處測定吸光度。酸性蛋白酶酶活的計(jì)算酸性蛋白酶酶活的定義：1g固體發(fā)酵產(chǎn)物，在乳酸緩沖液中，于40C的條件下，一分鐘分解酪蛋白產(chǎn)生一微克的酪氨酸稱為一個(gè)酶活單位，以U/g表示。計(jì)算公式：X=AX KX v/t X n=2/5 X AX KX nX:樣品酶活力 A :樣品平行實(shí)驗(yàn)平均吸光度K

23、:吸光常數(shù) v :反應(yīng)體積（本實(shí)驗(yàn) v=4）t=反應(yīng)時(shí)間（本實(shí)驗(yàn)t=10 ） n：稀釋倍數(shù)注：平行誤差不超過3%并且本實(shí)驗(yàn)中如果沒有特殊說明，菌體的重量都是指發(fā)酵后的菌體濕重。結(jié)果與討論通過查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，麩皮、豆餅粉以及微量的無機(jī)鹽是米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶培養(yǎng)基所必需的，因此選取 3個(gè)配方，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，以考查米曲霉A-29菌株的生長性能以及產(chǎn)酸性蛋白酶能力。 麩皮48%豆餅粉，磷酸二氫鉀%硫酸銨2%固體：水=10:9 麩皮73%豆餅粉，磷酸二氫鉀%硫酸銨2%固體：水=10:9 麩皮78%豆餅粉%磷酸二氫鉀%硫酸銨2%固體：水=10:9研究結(jié)果表明，米曲霉 A-29菌株在號培養(yǎng)基上生長緩慢

24、，且菌株的孢子化程度不高，產(chǎn)酶水平較低；號培養(yǎng)基菌株生長情況與號相似但菌株總量較大，酶活力水平提高不大；號培養(yǎng)基的菌株生長情況良好，菌株孢子化程度較好，酶酶活力水平很高。因此以號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。a.米曲霉A-29固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，選取豆餅粉（A）、（ NH4 ） 2SO4 （ B）、KH2PO4 （ C）、水（D）等4個(gè)因素，按表所示的因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如下：培養(yǎng)基配比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果/%序號ABCD酸性蛋白酶活104025036046054060507508060940由表可見，實(shí)驗(yàn)組 5的酸性蛋白酶酶活有最大值g,實(shí)驗(yàn)組8的酸性蛋白酶酶活有

25、最小值g,實(shí)驗(yàn)組4的蛋白酶酶活達(dá)到 u/g ,其他組合酸性蛋白酶酶活均幾乎在1300014000 u/g之間。ABCDX1X2X3R經(jīng)比較極差R,可見RARBRCR即實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的因素中，豆餅粉對米曲霉產(chǎn)蛋白酶水平的影響大，水的影響最小。得到酸性蛋白酶生產(chǎn)最佳因素組合為序號5，即最適培養(yǎng)及配比(為：豆餅粉、(NH4 )、水40、麩皮。豆餅粉對米曲霉 A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響經(jīng)數(shù)據(jù)分析，酸性蛋白酶的酶活水平隨著培養(yǎng)基中豆餅粉的增加呈“鐘”型分布，當(dāng)豆餅粉量過低或過高時(shí)都不利于酸性蛋白酶的生產(chǎn)。(NH4 ) 2SO4對米曲霉A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響(NH4 ) 2SO4可作為發(fā)酵中的無機(jī)氮源，經(jīng)

26、分析發(fā)現(xiàn)，濃度在2時(shí)，最適酸性蛋白酶的生產(chǎn)。其原因可能是由于濃度過高會使培養(yǎng)基的pH太低，而濃度過低則不能保證菌株正常的氮源需求所致。KH2PO4對米曲霉 A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，磷酸鹽對蛋白酶的生產(chǎn)很重要，它具有穩(wěn)定蛋白酶的功能。分析表可知，磷酸鹽在時(shí)，即水平3時(shí)最適合酸性蛋白酶的生產(chǎn)。這一結(jié)果也再次證明磷酸鹽具有 穩(wěn)定蛋白酶的功能。水量對米曲霉 A-29產(chǎn)酸性蛋白酶的影響固體發(fā)酵的特點(diǎn)在于，它是在培養(yǎng)基呈固態(tài)，雖然含水豐富，但沒有或幾乎沒有自由流動水的狀態(tài)下進(jìn)行的一種或多種微生物發(fā)酵過程。隨著培養(yǎng)基中水量的增加，米曲霉的產(chǎn)酶水平是呈逐漸降低的趨勢，可見該發(fā)酵過程過量水

27、的加入將對酸性蛋白酶的產(chǎn)生有一定抑制作 用。這也許主要是因?yàn)殡S著水的加入，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中更容易結(jié)塊，培養(yǎng)基緊密度的增加，將使米曲霉生長時(shí)的透氣性較低，對米曲霉的生長造成了抑制，因而影響產(chǎn)酶能力。b.米曲霉A-29固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化.培養(yǎng)時(shí)間的影響考察米曲霉A-29在29C分別培養(yǎng)2484h米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的情況，其產(chǎn)酶結(jié)果如表所示，可看出29C下進(jìn)行發(fā)酵，隨著時(shí)間的增長，酸性蛋白酶的生產(chǎn)呈現(xiàn)直線增加趨勢，但 在72h達(dá)到最大值，最大值為 g，超過72h后發(fā)酵產(chǎn)物的酶活逐漸下降。這主要是由于米曲霉A-29在產(chǎn)酸性蛋白酶的同時(shí)，酸性蛋白酶也在失去活性，當(dāng)發(fā)酵所產(chǎn)生的酶與同時(shí)被分解失活的

28、酶量差值最大時(shí)，所測酶活將出現(xiàn)最大值，即72h時(shí)。當(dāng)超過72h后，由于菌體的孢子化程度加強(qiáng)，產(chǎn)酸性蛋白酶的能力相應(yīng)降低，但酸性蛋白酶的分解率沒有發(fā)生變化， 因而其酸性蛋白酶酶活逐漸降低。時(shí)間/h1234平均吸光度平均酶活/243648607284.培養(yǎng)溫度的影響由圖可知，30C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酸性蛋白酶酶活最高，27C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酶活與 33C下培養(yǎng)的產(chǎn)物的酶活大致相同。因此，米曲霉 A-29的最佳培養(yǎng)溫度是 30C。27C時(shí)溫度低蛋 白酶的失活速率小，但同時(shí)菌體的生長性能也受到了抑制。 33C時(shí)溫度高，使酸性蛋白酶失 活速率加快，其酶活也不會太高。30 C時(shí)菌體孢子化較慢， 且酸性蛋白失活速

29、率也相對較緩慢，酸性蛋白酶的酶活就很高，因此菌株在30 C時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)酶最高峰。溫度/C1234平均吸光度平均酶活/273033+系列1系列22000018000160001400012000100008000600040002000 0123總結(jié)：通過正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化得到了米曲霉A-29菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基（）為：豆餅粉、（NH4 ）、水40、麩皮。通過培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出：較佳固態(tài)發(fā)酵時(shí)間為：72時(shí)。較佳培養(yǎng)溫度：30 C .1.化學(xué)成分米曲霉基本信息Aspergillus oryzae （）,，絲孢目，從梗孢科，中的一個(gè)常見種。結(jié)構(gòu)介紹米落生長快，10d直徑達(dá)56cm，質(zhì)地疏松，

30、初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G 褐色。背面無色。分生孢子頭放射狀，一直徑150300卩m也有少數(shù)為疏松柱狀。分生孢子梗 2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)1225卩m 壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形,通常4050米曲霉卩m小梗一般為單層，1215卩m偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè) 頂囊上。分生孢子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，老后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，一般卩m粗糙或近于光滑。分生孢子梗長約2mng近頂囊處直徑達(dá)1225 m壁薄而精糙。頂囊近球形或燒瓶形，直徑4050卩m上覆單層小梗。分生幼時(shí)洋梨形或隨圓形，成熟后為球形或近球形，直徑卩m表面粗糙或近于光滑。分生孢子頭直徑150300卩m菌落生長較快，質(zhì)地疏松。初呈白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無色，分布甚廣，主要在、腐敗有機(jī)物和等處。是我國傳統(tǒng)釀造食品醬和的生產(chǎn)。也可生產(chǎn)、和等。會引起糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。在生產(chǎn)上的作用米曲霉是一類產(chǎn)的，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、等。在淀粉酶的作用下， 將原料中的直鏈、支鏈降解為糊精及各種低分子糖類，如、等；在蛋白酶的作用下， 將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為、及各種，而且可以使輔料中、等難吸收的物質(zhì)， 提高營養(yǎng)價(jià)值、保健功