蛋白相互作用酵母雙雜交PPT課件

1、蛋白相互作用與酵母雙雜交蛋白相互作用與酵母雙雜交 Protein-protein Interaction 另 外還可能在酵母細(xì)胞攝取外源性環(huán)形質(zhì)粒DNA 中 發(fā)揮協(xié)助作用。在每次使用前務(wù)必進(jìn)行熱變性,使 可能結(jié)合的雙鏈DNA 打開,保證鮭魚精carrier DNA 在轉(zhuǎn)化實(shí)驗體系中以單鏈形式存在。 Slide 31 涂布單缺培養(yǎng)基 pGADT7 Amp+ -Leu pGBKT7 Kan+ -Trp Slide 32 挑選發(fā)育良好菌落mating并隨后二缺四缺培養(yǎng)基篩 選 Slide 33 一般情況下，單獨(dú)的 BD 可以與 GAL4 上游活化序列 （GAL UAS）結(jié)合，但不能引起轉(zhuǎn)錄。然而，將

2、一段具 有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建到BD載體上，若其 表達(dá)產(chǎn)生的 BD 單獨(dú)與 UAS 結(jié)合也可以引起下游報告基 因的轉(zhuǎn)錄，那么就稱之為酵母雙雜中的自激活現(xiàn)象。 酵母雙雜交系統(tǒng)的自激活驗證 Slide 34 X X r e p o r te r g e n e Transcription factors GAL4BD 原理： Slide 35 You should demonstrate that your bait protein is not toxic when expressed in yeast. If your bait is toxic to the yeast cells

3、, both solid and liquid cultures will grow more slowly. If expression of your bait protein does have toxic effects, you may wish to switch to a vector (such as pGBT9) that has a lower level of expression. 1. Materials: Y2HGold competent cell SD/Trp agar plates SD/Trp broth 2. Transform 100 ng of the

4、 following vectors: pGBKT7 (empty) pGBKT7 + cloned bait gene 3. Spread 100 l of 1/10 and 1/100 dilutions of your transformation mixtures onto SD/Trp. 4. Grow at 30C for 35 days: Note : If your bait is toxic, you may notice that colonies containing your bait vector are significantly smaller than colo

5、nies containing the empty pGBKT7 vector. 酵母雙雜交的毒性驗證： Slide 36 報告內(nèi)容： 1.蛋白相互作用與研究方法 2.酵母雙雜交原理和方法 3.酵母雙雜交的發(fā)展 4.已有實(shí)驗的進(jìn)展 5.存在問題與下一步計劃 Slide 37 Slide 38 (一一) 酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybrid system) 1993年，由年，由Wang和和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白 質(zhì)和質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗體系。相互作用的實(shí)驗體系。 Wang MM, Reed RR. Molecular cloning o

6、f the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，1993，364(6433):121-126. 文獻(xiàn)出處文獻(xiàn)出處 Slide 39 酵母單雜交系統(tǒng)原理酵母單雜交系統(tǒng)原理 在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特蛋白質(zhì)雜交體，而用特 異的異的DNA序列取代序列取代DNA Gal4結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。 該該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要

7、的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 靶靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與與 其特異其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報告基因的表達(dá)結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報告基因的表達(dá)。 理論上理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋 白質(zhì)。白質(zhì)。 該系統(tǒng)不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和該系統(tǒng)不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DN

8、A復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。 Slide 40 (二二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng) (reverse yeast two-hybrid system ) 1996年，年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng) Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein- protein and DNA-protein interactions. P

9、roc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320. Slide 41 (二二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng) （ reverse yeast two-hybrid system ） 該系統(tǒng)是一項鑒定該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種 反向篩選的報告基因。反向篩選的報告基因。 在這系統(tǒng)中，野生型在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志毒性標(biāo)志作作 為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所

10、謂的陰性陰性篩選。篩選。 在此情況下在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。 利用這種方法能方便地鑒定利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小解離肽或相關(guān)的小 分子物質(zhì)分子物質(zhì)。 Slide 42 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 Slide 43 報告內(nèi)容： 1.蛋白相互作用與研究方法 2.酵母雙雜交原理和方法 3.酵母雙雜交的發(fā)展 4.已有實(shí)驗的進(jìn)展 5.存在問題與下一步計劃 Slide 44 GAL4- BD bait vector GAL4-AD pray vector

11、 pGBKT7 pGBKT7-53 pGBKT7-lam pGADT7pGADT7-TpGADT7 SD/-Trp/-Leu SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His + X-gal + AbA pGADT7-T 已有實(shí)驗進(jìn)展已有實(shí)驗進(jìn)展展展 Slide 45 GAL4- AD pray vector GAL4-BD bait vector RIGI-1 pGADT7 RIGI-1- pGADT7 RIGI-8 pGADT7 RIGI-8- pGADT7 MAVS pGADT7 pGBKT7pGBKT7-MAVSpGBKT7pGBKT7-MAVS SD/-Trp/-Leu SD/-Trp/

12、-Leu/-Ade/-His + X-gal + AbA TRAF6 pGADT7 Slide 46 GAL4- AD pray vector GAL4-BD bait vector pGADT7 CAS8-3 pGADT7 CAS8-4 pGADT7 pGBKT7pGBKT7-FADDpGBKT7 SD/-Trp/-Leu SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His + X-gal + AbA pGBKT7-FADD 已有實(shí)驗已有實(shí)驗進(jìn)展進(jìn)展 Slide 47 Slide 48 BD+Cg-cas8m BD+AD FADD+Cg-cas8m FADD+AD SD/-Trp/-Leu SD/

13、-Trp/-Leu/-Ade/-His + X-gal + AbA 已有實(shí)驗已有實(shí)驗進(jìn)展進(jìn)展 BD+Cg-cas8m BD+AD FADD+Cg-cas8m FADD+AD 報告內(nèi)容： 1.蛋白相互作用與研究方法 2.酵母雙雜交原理和方法 3.酵母雙雜交的發(fā)展 4.已有實(shí)驗的進(jìn)展 5.存在問題與下一步計劃 Slide 49 存在問題與下一步計劃 RIGI- MAVS 酵母雙雜交顯示無相互作用。進(jìn)行下一步酵母文庫構(gòu)建已篩選與RIGI或 MAVS相互作用的蛋白，后續(xù) pull-down，CO-ip驗證。 通過FADD-Caspase8相互作用的pull-down，CO-ip驗證熟悉整個蛋白互作驗證

14、的整個實(shí)驗流 程 。 Slide 50 Thanks for your attention ！ Protein-protein Interaction 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種 基本功能的主要完成者?；竟δ艿闹饕瓿烧?。 幾乎幾乎所有的重要生命活動，包括所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分 泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。 Slide 52 Bind to Stre

15、ptavidincoated microtitre wells Slide 53 報告內(nèi)容： 1.蛋白相互作用與研究方法 2.酵母雙雜交原理和方法 3.酵母雙雜交的發(fā)展 4.已有實(shí)驗的進(jìn)展 5.存在問題與下一步計劃 Slide 54 酵母雙雜交所用的兩個質(zhì)粒載體 Slide 55 酵母質(zhì)粒雙酶切線性化 10NEB buffer 1ul 100BSA 0.1ul EcoR I 0.2ul 37，3h BamH I 0.2ul pGBKT7 8.5ul Slide 56 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并測序 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 挑陽性克隆進(jìn)行菌落pcr 送測序測序正確提取質(zhì)粒 Slide 57 T

16、ransformation of Competent Yeast Cells: 1. 加入質(zhì)粒DNA 100-500ng 鮭魚精DNA(變性的，10mg/ml) 5ul 加入感受態(tài)細(xì)胞, 輕彈混勻 50ul 加入PEG/LiAc, 輕彈混勻 500ul 2. 30水浴，每10輕彈混勻30min 3. 加入DMSO, 輕彈混勻 20ul 4. 42水浴，每 5min輕彈混勻 15min 5. 離心，棄上清，10000rpm 15s 6. 用0.9% NaCl重懸 1ml 7 取適量菌液涂布在相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上。 測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母 我們采用的是PEG/ LiAc法轉(zhuǎn)化酵母。 PEG是一種高分子聚合物, 在酵母轉(zhuǎn)化中起到 在高濃度醋酸鋰環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞膜,減少醋酸鋰對 細(xì)胞