碩士論文人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法的研究（可編輯）

1、 北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院碩士學位論文人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法的研究姓名:李鐸申請學位級別:碩士專業(yè):免疫學指導教師:張宇光201105北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文中文摘要間充質(zhì)干細胞來源于胚胎早期發(fā)育中胚層,是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞,在體外可以分化誘導為骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織細胞。具有向受損組織歸巢并且修復、重建受損或病變的組織器官的特點,此外應用間充質(zhì)干細胞做為細胞治療的手段時由于其具備低免疫原性的特點,可降低免疫排斥反應,提高移植成活率,使其成為當前成體干細胞研究的熱點。人臍帶結締組織是間充質(zhì)干細胞的豐富來源,相對于骨髓來源的間充質(zhì)干細胞破壞侵入性分離過

2、程而言,臍帶間充質(zhì)干細胞更加易于獲得,并對母子均無損傷,使其成為細胞治療中的理想細胞而逐漸替代骨髓來源間充質(zhì)干細胞。因此如何快速,高效地從臍帶中分離、儲存間充質(zhì)干細胞而滿足基礎與臨床研究的需要成為尤為重要的問題。本研究工作主要包括兩部分內(nèi)容。第一部分是應用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞,觀察采集臍帶后不同處理時間、以及臍帶凍存復蘇后臍帶間充質(zhì)干細胞分離成功率、生長增殖情況等,探討組織塊貼壁分離法用于間充質(zhì)干細胞大規(guī)模生產(chǎn)擴增的可行性。實驗采用培養(yǎng)基對?大小的人臍帶組織塊進行貼壁培養(yǎng),觀察不同處理時段的臍帶組織原代細胞獲得時間、細胞得率等情況。結果表明,小時以內(nèi)處理的組織細胞分離成功率

3、%/,得到原代細胞的平均時間.天,平均得到.個細胞/;?小時組的分離成功率為%/,得到原代細胞的平均時間為為.天,平均可獲得.個細胞/;?小時組的分離成功率降至%/,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均獲得.個細胞/。液氮儲存復蘇組分離成功率為%/,得到原代細胞的平均時間為.天,平均可獲得.個細胞/。結果表明,隨著臍帶組織處理時間延長,分離成功率下降,平均每厘米臍帶組織獲得原代細胞數(shù)量降低,臍帶組織塊凍存復蘇后可以獲得人臍帶間一充質(zhì)干細胞。第二部分是探討表皮生長因子和成纖維樣生長因子能否促進原代間充質(zhì)干細胞的貼壁能力,以及對傳代細胞免疫表型、細胞周期及誘導分化能力的影響。實驗應用膠原酶消化法對人

4、臍帶間充質(zhì)干細胞進行分離,觀察和對原代細胞貼壁生長增殖情況、以及對第代細胞免疫北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文表型、細胞周期及誘導分化能力的影響。結果表明,完全培養(yǎng)基組促貼壁時間平均為.小時,組為.小時,組為.小時,組為.小時。培養(yǎng)至第天時,組、組、組細胞數(shù)量分別為細胞培養(yǎng)組的倍、倍和.倍,均有統(tǒng)計學意義。傳至第代時各組細胞的?類分子、間充質(zhì)干細胞表面常見分子、均表達為陽性;而?類分子及造血干細胞表面分子、白細胞表面共同抗原均表達為陰性。細胞周期分析顯示:細胞培養(yǎng)基組期細胞為.%,組、組組期細胞比例分別為.%、.%、.%,略高于細胞培養(yǎng)基組。組、組、組均可以成功向成骨和成脂方向誘導。綜上所述,組織塊

5、貼壁分離法可以獲得原代貼壁的間充質(zhì)干細胞,但處理時間對組織塊貼壁分離法的成功率有影響。生長因子、可促進人臍帶間充質(zhì)干細胞早期貼壁和細胞增殖,但是否促分化還有待進一步研究。關鍵詞:臍帶、間充質(zhì)干細胞、組織塊貼壁分離法、北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文 舶 .,雒. 伍 班 脅瑪., 陀 孫 夠 啪醐 岫夠 托鋤 部 仕 夠,金.、耽 .瑪 、磯把./ 、析 %., 狙 .士. /血,. .士./ 行 鋤、析 ;.士.士. .士.嘶 ;.士.珥 . . 慨 .士. /砬.士.鯽、, .仃巧., 也 觚. :咖 .撇.,.,.,.彘 錒 臟 . 螄 世.?, , ,帥 疵 鰣. , .北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學

6、位論文也 . , 肌仃 .仃 鉚驢, .鋤 眥.: 啪, ,北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文前言干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞,可在體外培養(yǎng)擴增、定向誘導分化為多種細胞系。根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同,干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。成體干細胞存在于骨髓、血液、皮膚、消化道內(nèi)皮組織等組織中,對成體干細胞及其可塑性研究是近二十年來生物醫(yī)學領域中熱點之一,特別是干細胞能參與損傷修復矗。,神經(jīng)再生和抗衰老等研究更是使再生醫(yī)學進入了一個嶄新領域。間充質(zhì)干細胞 ,通常是指來源于發(fā)育早期中胚層的具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細胞,并能在特定條件下分化為軟骨細胞、成骨細胞、肌

7、肉細胞、脂肪細胞等。在成體干細胞中,間充質(zhì)干細胞廣泛存在于全身各種組織中,特別是骨髓、脂肪組織、臍血,甚至外周血也發(fā)現(xiàn)有間充質(zhì)干細胞。由于間充質(zhì)干細胞具有強大的增殖能力、較強的多向分化潛能曲、以及其低免疫原性一。和免疫調(diào)節(jié)功能,成為組織工程中的理想種子細胞憎。,因而在細胞替代治療和組織工程方面顯示出巨大價值而備受關注。胚胎形成過程中,滋養(yǎng)層細胞形成胎膜、臍帶、胎盤。臍帶是連于胎兒臍部與胎盤間的條索狀結構,內(nèi)含來自中胚層的膠樣結蒂組織,結構上含有一條靜脈和兩條動脈,三條血管一端與胎盤相續(xù),另一端與胎兒血管連接,血管周圍富含豐富的膠原結締組織 。間充質(zhì)干細胞隨著胎兒的成熟及其血液循環(huán),大部分定位在

8、臍靜脈內(nèi)皮下層和胎盤。因此,人臍帶結締組織含有豐富的間充質(zhì)干細胞。等將 從臍血管周圍剝除,消化后培養(yǎng)可見成纖維樣細胞;等副單獨消化臍血管后,獲得血管內(nèi)皮與內(nèi)皮下混合細胞體,培養(yǎng)后可見成纖維樣細胞,由此可以判斷,臍帶間充質(zhì)干細胞主要來源于 和臍血管。由于臍帶是胎兒分娩后的廢棄物,避免了敏感的倫理問題;加之其來源廣泛,取材方便,可以無創(chuàng)傷獲取,不會給捐獻者帶來痛苦和感染;臍帶組織富含間充質(zhì)干細胞,體外分離、傳代培養(yǎng)較容易,多次傳代后,仍具有穩(wěn)定核型;因而成為一種新的來源,具有良好的應用前景。大量研究表明由人臍帶分離所得的貼壁后成長梭形,與成纖維細胞形態(tài)相似。人臍帶細胞表面陽性表達、.類分子等”,而

9、、等造血干細胞表面標記及?類分子表達陰性?！啊Ｄ壳?文獻報道人臍帶問充質(zhì)干細胞分離方法主要有酶消化分離法和組織塊貼壁法,酶消化分離法主要應用膠原酶和胰蛋白酶對臍帶組織細胞外基北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文質(zhì)成份中的透明質(zhì)酸和硫酸氨基葡聚糖類似于蛋白多糖構成的膠原纖維網(wǎng)進行消化水解從而獲得目的細胞。膠原酶是一種從微生物的發(fā)酵液中提取出來的酶,對細胞間質(zhì)有較好的消化作用,尤其對膠原纖維成分作用比較突出;胰蛋白酶是廣泛應用的消化劑,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,水解細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)使細胞從組織中離散。近年來,酶消化法多采用膠原酶與胰蛋白酶并用,或添加透明質(zhì)酸酶、梭菌酶等聯(lián)合消化,增加其對臍帶組

10、織的分離作用,以期獲得更多的間充質(zhì)干細胞。馴、圳等研究單獨采用膠原酶、膠原酶消化臍帶組織,而袁源九、四等應用透明質(zhì)酸酶、胰酶及膠原酶等酶復合物消化臍帶組織,但從文獻報道中來看,由膠原酶法分離所得細胞大多維持在個細胞/,并且所獲得的是細胞混雜群體,不是單純的。組織塊貼壁法是將臍帶切割為細小組織塊直接貼附于培養(yǎng)基上,利用間充質(zhì)干細胞具有遷移能力這一重要特性而獲得直接貼壁的。比副等將臍帶分為.大小組織塊貼于含%、幾谷氨酰胺及非必須氨基酸的低糖培養(yǎng)基中,天獲得貼壁的人臍帶間充質(zhì)干細胞。徐燕比馴等將?甜組織塊貼附于含有血小板衍生生長因子等多種因子的/培養(yǎng)基中,天可獲得原代,并且細胞數(shù)量高達.。個細胞/。

11、眥瞄創(chuàng)等人將.一大小的組織塊培養(yǎng)至含%的培養(yǎng)基中獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞。由于組織塊法對臍帶間充質(zhì)干細胞損傷小,可以直接獲得形態(tài)較為均一的問充質(zhì)干細胞,能很好地保持細胞活力,且細胞得率達。個細胞/,應該對于大規(guī)模生產(chǎn)更為有利。如何短時間獲取大量功能狀態(tài)良好的臍帶間充質(zhì)干細胞,維持的原始狀態(tài),及控制分化方向是當前研究的熱點。表皮生長因子和成纖維樣生長因子均是體內(nèi)的一種活性物質(zhì),籍由刺激生長因子受體的磷酸化,完成信號轉(zhuǎn)導,從而發(fā)揮作用,促進細胞生長瞄副心訓等人在對人臍血間充質(zhì)干細胞的研究中添加了和等因子后,明顯促進無血清培養(yǎng)中的細胞增殖,徐燕刮等在/培養(yǎng)體系中添加、及血小板衍生因子等多種因子后,能明

12、顯提高臍帶間充質(zhì)干細胞數(shù)量。還有研究表明,選用早期貼壁細胞進行培養(yǎng),有利于間充質(zhì)干細胞的生長增殖。本實驗在現(xiàn)有酶消化法大規(guī)模分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)工藝基礎上,探討在培養(yǎng)體系中添加細胞因子,是否能促進原代的早期貼壁,促進間充質(zhì)干細胞生長,并維持其干性;另一方面考證組織塊貼壁法用于日后人臍帶間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)的可行性,特別是與臍帶新鮮程度的關系,以期為人臍帶間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供思路。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文實驗材料.材料.主要試劑名稱 來源佰:粉末 美國公司低糖培養(yǎng)基干粉 美國公司美國公司胰蛋白酶干粉 美國公司美國公司胰島素凍干粉 美國公司干粉 美國公司地塞米松干粉 美國公司

13、吲哚美辛溶液純度% 天津一方科技有限公司凍干粉 美國公司凍干粉 美國公司膠原酶 美國公司茜素紅 上海研生生物試劑有限公司油紅上海恒遠生物試劑有限公司臺盼藍染液 上海易利生物有限公司.%溶液 廣州威佳科技有限公司無水乙醇及 天津英博生物化學試劑公司“ 美國叻公司鼠抗人一 美國 公司鼠抗人一 美國 公司鼠抗人? 美國公司鼠抗人?美國公司鼠抗人一 美國 公司鼠抗人一 美國 公司鼠抗人同型對照 美國 公司北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.主要耗材名稱 來源與產(chǎn)地細胞培養(yǎng)瓶 美國公司培養(yǎng)板 美國 公司手術刀片 上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司手術刀片 上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司手術刀片 上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限

14、公司一次性移液管 美國公司.主要儀器及設備儀器 來源及產(chǎn)地普通冰箱 德國一冰箱 美國微量加樣器德國美國細胞培養(yǎng)箱.振蕩混勻器 美國恒溫水浴 上海方瑞儀器廠蘇州珀西瓦爾有限公司大容量冷凍恒溫振蕩器美國超純水器日本倒置顯微鏡高速離心機 美國美國?流式細胞儀北京昌平長城空氣凈化設備工程公司超凈臺細胞計數(shù)板 上海安信光學儀器制造有限公司上海比朗儀器有限公司磁力攪拌器臺式儀 廣州深華儀器設備有限公司臺式高速離心機 美國,美國一渦旋混合器移液器 德國北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.主要試劑的配制. :. . . .電子天枰分別稱取 、。、 、:,溶解于超純水中,至完全溶解,調(diào)至.,定容至保存?zhèn)溆谩８邏赫羝麥缇?/p>

15、至少分鐘。.【液:電子天枰分別稱取.、 .,、?.、.、攝 .溶于超純水中,至完全溶解,調(diào)節(jié)值至.,定容至,高壓滅菌至少分鐘,保存?zhèn)溆谩?/培養(yǎng)基:將一袋/培養(yǎng)基干粉.全部倒入大燒杯中,用少量超純水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗凈,加入超純水水溫。一。,磁力攪拌器攪拌溶解,加入. 后微攪拌溶解,加超純水定容至。用/溶液或/溶液調(diào)至.。用.岬濾膜正壓過濾除菌,溶液在一下避光保存。.%膠原酶溶液:?【和稱取型膠原酶.于離心管中,加入雙抗混合好的溶液,使膠原酶充分溶解。印離心,秒,將溶液輕輕轉(zhuǎn)入到含.的.【和雙抗混合溶液中。反復洗滌離心管以保證完全轉(zhuǎn)移,注意低溫操作,避免操作過程中產(chǎn)生氣泡。. 孔徑濾膜過濾除菌

16、,分裝于.保存?zhèn)溆谩?%胰酶.溶液:電子天枰稱取.胰酶至燒杯中,加入液于低溫水浴中溶解胰酶粉末,玻璃棒攪拌研磨。將充分溶解的胰酶溶液轉(zhuǎn)移至含有“的容量瓶中,定容至。轉(zhuǎn)移過程中避免產(chǎn)生氣泡,否則損失酶的活性。用. 的濾膜過濾,分裝入滅菌的離心管中。.。保存。不可反復凍存,每次解凍后。保存,并在短期內(nèi)用完。.%茜素紅染液:稱取.茜素紅粉加 溶解后,調(diào)節(jié)值到.,靜置后過濾,北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文常溫條件下儲存。.%油紅染液:稱取油紅粉.于燒杯中,先加少量丙二醇,水浴,玻璃攪棒攪拌研磨,邊攪拌邊加入剩余的“丙二醇。水浴加熱到.。,使之充分溶解。將溶解后的溶液用液濾紙過濾,封口,。長期儲存。.低糖的

17、配制:取一袋低糖干粉.,放入容器中,并用超純水充分清洗包裝袋內(nèi)面次,加入少量的超純水使其溶解,定容至,磁力攪拌器攪拌混勻。必要時用/的和/調(diào)節(jié)值。用. 濾膜過濾除菌,分裝于無菌血清瓶中,。冰箱保存。配好的培養(yǎng)基使用前加入/青霉素和/的鏈霉素。./胰島素溶液配制:稱取胰島素凍干粉溶于“溶液.,濃度咖。過濾后分為份,每份.含.胰島素,分裝在管里,.。保存。.砌/非水溶性地塞米松溶液的配制:稱取.地塞米松分子量.溶于無水乙醇,濃度為兒。過濾后分裝在管里,.。保存。.溶液配制:/稱取.凍干粉溶于.生理鹽水。.溶液配制:/稱取.凍干粉溶于.生理鹽水。. .姍/溶液的配制:,溶于中,濃度為.兒,過濾后分為

18、分將裝在管里,.。保存。.咖/抗壞血酸鈉水溶液的配制:北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文稱取.抗壞血酸鈉粉末溶于超純水中,終濃度為./,過濾,滅菌備用。./吲哚美辛溶液配制:取吲哚美辛溶于甲醇溶液。.成脂誘導啟動培養(yǎng)基:取 的溶液、 的地塞米松溶液、. 終濃度為的胰島素溶液、吲哚美辛溶液 、.叫/培養(yǎng)基混勻,總體積 。.成脂誘導維持培養(yǎng)基:將配制好的低糖培養(yǎng)基內(nèi)加入. 胰島素溶液,混勻,總體積。培養(yǎng)基一般現(xiàn)用現(xiàn)配,防止胰島素長期儲存后降解,影響培養(yǎng)基誘導效果。.成骨誘導培養(yǎng)基:吸取.低糖溶液,加入胎牛血清、 一甘油磷酸鈉裝、 .衄/的抗壞血酸鈉水溶液, 終濃度為胰島,總體積 。顛裝、并加入雙抗各素溶液

19、、/倒混勻,。儲存?zhèn)溆谩，F(xiàn)用現(xiàn)配,防止因子長期儲存后降解,影響培養(yǎng)基誘導效果。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文一組織塊貼壁法分離人臍帶問充質(zhì)干細胞的研究組織塊貼壁法是將臍帶切割為細小組織塊直接貼附于培養(yǎng)基上,利用間充質(zhì)干細胞具有遷移能力這一重要特性而獲得直接貼壁的,這種方法對細胞損傷小,可以直接獲得形態(tài)較為均一的間充質(zhì)干細胞。本部分實驗主要考證組織塊貼壁法應用于人臍帶間充質(zhì)干細胞產(chǎn)業(yè)化的可行性。實驗方法.人臍帶間充質(zhì)干細胞組織塊貼壁分離培養(yǎng).實驗分組為了進一步觀察臍帶采集后不同處理時間及儲存條件對組織塊貼壁法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞的影響,實驗分為時內(nèi)處理、?時處理、?時處理和液氮凍存復蘇后四組。

20、觀察原代細胞獲得時間、細胞形態(tài)。.人臍帶組織處理使用醫(yī)用鑷子將臍帶從臍帶采集瓶中取出,放入第一個燒杯中浸泡清洗。由鑷子取出臍帶放入其中一個大號培養(yǎng)皿中,并使用手術刀切除雙側(cè)手術線結扎及淤血部分。用含雙抗對剩余組織在余下的兩個燒杯中進行充分清洗,一般沖洗兩遍,去除血污。將清洗干凈的臍帶置于另一個大號培養(yǎng)皿中,均分為?部分,平均每部分約長?。對每一小部分沿縱向進行分離,使臍帶組織管狀變?yōu)槠瑺睢⑵瑺钅殠ЫM織進行進一步的分離,切割為?甜大小的組織塊。使用吸管將組織塊逐一種植入預先用含%胎牛血清的/培養(yǎng)基包被好的培養(yǎng)瓶內(nèi),密度一塊/瓶為宜。正向置于。,體積分數(shù)為%飽和溫度濕度溫箱內(nèi)。每小時補加培養(yǎng)基,

21、小時后全量換液。每周換液兩次。.人臍帶組織塊凍存將組織切割分離至?姍小塊后,使用吸管逐一吸入含凍存液的凍存管中,將凍存管放入程序降溫盒中,。冷藏分鐘,轉(zhuǎn)入一。冰箱放置小時,后再入一。冰箱過夜,次日液氮保存。進行液氮凍存的臍帶組織均為采集后小時內(nèi)處理。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.人臍帶組織塊復蘇平均凍存三周左右后進行復蘇。取出凍存管,迅速放入盛有。溫水的燒杯中,使其快速溶化。將溶化的組織塊倒入離心管中,用吸管吸取凍存液。用 反復吹打清洗組織塊。離心,/,分鐘。棄去上清液,用吸管將組織塊逐一貼于預先包被的培養(yǎng)瓶中,一塊/瓶為宜。培養(yǎng)方法同.臍帶不同處理時間對間充質(zhì)干細胞原代細胞的影響各組組織塊貼壁

22、法得到細胞后,去貼塊,用.%胰酶.消化,用%的培養(yǎng)基中和,制成細胞懸液,進行臺盼藍染色計數(shù)。采用血球計數(shù)板計數(shù),計算公式如下:細胞濃度細胞數(shù)/毫升原液個大格細胞總數(shù)/稀釋倍數(shù)細胞總數(shù)細胞濃度原液毫升數(shù).人臍帶間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)將時內(nèi)處理組的細胞傳代培養(yǎng),進行后續(xù)實驗。用含%胎牛血清的/培養(yǎng)基重懸細胞,鋪入或瓶中。根據(jù)細胞生長情況以后每?天傳代一次。傳代時向細胞培養(yǎng)瓶中加入胰酶若是細胞培養(yǎng)瓶則加,胰酶消化后迅速加入加入的細胞培養(yǎng)基,反復吹打以使細胞脫落下來,將細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中,/,離心分鐘收集細胞。棄上清后,以一定體積的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞,并將細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中,置于,%培養(yǎng)箱中

23、培養(yǎng)。.人臍帶間充質(zhì)干細胞生長曲線分析細胞傳代之后,經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁,隨后度過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生長,進入平頂期,然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化,典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期,斜率較大的對數(shù)生長期、呈平臺狀的平頂期及退化衰亡個部分。取時內(nèi)處理組的第.代生長良好的細胞,分別用.%胰酶.消化,%的培養(yǎng)基中和,制成細胞懸液。以細胞數(shù)./孔鋪種至孔板,每組設置三個復孔。每隔小時用.%胰酶一進行消化,收集細胞,利用血球計數(shù)板進行臺盼藍染色計數(shù),連續(xù)天。以存活細胞數(shù)對培養(yǎng)時間作圖,繪制生長曲線。并按公式計算對數(shù)生長

24、期的倍增北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文時間:/。:倍增時間,:細胞數(shù)由至的時間;:細胞數(shù)。.人臍帶間充質(zhì)干細胞細胞周期測定正常哺乳動物細胞為二倍體細胞,而正常增殖細胞則存在不同的含量。在細胞周期的各個時期、中含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性變化,在期細胞開始合成和蛋白質(zhì),但含量仍保持二倍體,進入期后開始合成,此時細胞核內(nèi)的含量介于和期之間。當復制成倍體時細胞進入期并繼續(xù)合成和蛋白質(zhì),直到進入期,因此單純從含量無法區(qū)分期和期,一旦有絲分裂分裂成個細胞,同樣和期的含量也無法區(qū)分。熒光染料與結合,其結合量與含量成正比。因此,通過流式細胞術染色法對細胞內(nèi)含量進行檢測時將細胞周期各時相區(qū)分為/期,期和/期。/期具有

25、二倍體細胞的含量,而/期具有四倍體細胞的含量,而期的含量介于二倍體和四倍體之間。對時內(nèi)處理組臍帶間充質(zhì)細胞,應用試劑盒進行細胞周期測定。.將培養(yǎng)至第四代的細胞消化后,用冷洗細胞兩次,印刪,離心若細胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到,為減少細胞損失可用.離心管離心;航 .棄上清留大約下面的液體防止碰到細胞團,加入并低速混勻細胞;.室溫離心,/分鐘,離心分鐘;.重復步驟.、.各一次;仃.棄上清留大約下面的液體,加入 重懸細胞;.計數(shù)細胞,用硼 將細胞密度調(diào)為個/“;.染色:.取.“含細胞個;。.每管加入 ,用手輕拍混勻:.室溫反應,保留 ;.加入 ,輕輕混勻:.室溫反應,保留 和 ;.加入冷,輕輕混勻,黑暗處.

26、孵育;.用尼龍網(wǎng)過濾細胞,加入上樣管上流式分析內(nèi)分析完。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.人臍帶間充質(zhì)干細胞免疫表型測定對時內(nèi)處理組的第代細胞進行免疫表型分析。.調(diào)整每管細胞濃度為,分裝在個檢測管中;.每管添加抗體及同型對照各 ,。避光,孵育分鐘;.洗滌后用/的多聚甲醛固定分鐘;.流式細胞儀檢測.利用校準標準樣品調(diào)整儀器,在使激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎上,前向角和測向角的熒光強度最強,并且變異系數(shù)最小;.檢查鞘液,廢液筒水量;.開啟軟件、編輯實驗文件;.分別將加好樣的檢測管依次上樣,并不斷調(diào)整流速、測量細胞數(shù)、測量參數(shù);.收集實驗數(shù)據(jù);.樣品測量完畢后,進行管路清洗并關機;.

27、數(shù)據(jù)分析。.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成脂誘導分化及鑒定對時內(nèi)處理第代的細胞進行誘導分化實驗。.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成脂誘導分化.用含%胎牛血清的/培養(yǎng)基配制細胞懸液,細胞數(shù) /孔鋪入六孔板中的四孔,其中兩孔為陰性對照,另兩孔為誘導組;.待鋪種的細胞融合至%左右,誘導組更換成脂誘導啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)三天,后更換為維持培養(yǎng)基,交替換液,誘導兩周。陰性對照組繼續(xù)使用%胎牛血清的/培養(yǎng)基。.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成脂誘導分化的鑒定.棄去誘導液,用溶液清洗六孔板三遍;.%多聚甲醛固定分鐘;.棄去固定液,加入.%油紅染液,染色分鐘;.吸去染色劑,再用充分清洗兩遍,洗凈染液;.加入蘇木素復染分鐘;.吸去蘇木素,

28、充分清洗去掉多余的蘇木素,鏡下觀察。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導分化及鑒定對時內(nèi)處理第代的細胞進行誘導分化實驗。.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導分化.用含%胎牛血清的/培養(yǎng)基配制細胞懸液,細胞數(shù)/孔,鋪入六孔板中的四孔,其中兩孔為陰性對照,另兩孔為誘導組;.待鋪種的細胞融合至%左右,誘導組更換成骨誘導培養(yǎng)基,陰性對照組繼續(xù)使用%胎牛血清的/培養(yǎng)基;.細胞誘導培養(yǎng)兩周。每周換液兩次。.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導分化的鑒定.棄去誘導液,溶液清洗六孔板三遍;.%多聚甲醛固定分鐘;.吸去固定液,加入%茜素紅染液,分鐘;.吸去染色劑,再用充分清洗兩遍,洗凈染液;.加入蘇

29、木素復染分鐘.吸去蘇木素,充分清洗去掉多余的蘇木素,鏡下觀察。.統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,應用統(tǒng)本實驗采用 進行圖表繪制。計量資料以均數(shù)標準差曼表計表和印 示。組間均數(shù)比較采用獨立樣本檢驗,以.為差異有統(tǒng)計學意義。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文實驗結果.人臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察.人臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)組織塊切割成?舢小塊,植入培養(yǎng)瓶中,密度?塊/瓶。如圖。. .人臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察,每組均可見細胞由組織塊周圍貼壁生長,細胞形態(tài)為長而扁平的梭形,呈現(xiàn)典型的成纖維細胞形態(tài)圖、,去掉組織塊后培養(yǎng),細胞呈極性排列,集落成旋渦狀圖、。形態(tài)比較均一,排列較為整齊。北京協(xié)和

30、醫(yī)學院碩士學位論文.陀.呦蝴 喇甜囂蛆柚鋤訛恤曩伽.? 跚 .? .伽 鉀叫 .臍帶不同處理時間對間充質(zhì)干細胞原代細胞數(shù)量的影響對不同組別獲得的原代細胞進行顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)時內(nèi)處理組天可以獲得原代細胞,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均每厘米臍帶可得到.個細胞;?小時處理組最早天得到原代細胞,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均可獲得.個細胞/:?小時處理組天可獲得原代細胞,平均獲得原代細胞的周期為.天,平均可獲得.個細胞/。臍帶?小時處理組、?小時處理組與小時內(nèi)處理組在得到原代細胞數(shù)量有統(tǒng)計學差異.。液氮凍存組天可以獲得原代細胞,平均獲得原代細胞的時間為.天。平均可獲得.個細胞/。獲得原代細胞

31、數(shù)量與非冷凍小時處理組相比,無明顯統(tǒng)計學差異。見表。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.實驗分組 標本數(shù)培養(yǎng)成功標本數(shù) 原代細胞平均獲得時間天平均原代細胞數(shù)/時內(nèi).?時. .?時. .液氮儲存. . ,/療 .宰.人臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線小時處理組,傳至?代時,細胞生長增殖數(shù)量分別為見表:.細胞代數(shù)細胞平均數(shù). . . . .士. . . . . .儺 . . . . . .細胞生長曲線如圖。細胞接種后的第天為潛伏期,從第天起開始進入對數(shù)生長期,?天到達高峰期,此后左右逐漸進入平臺期。根據(jù)生長曲線得出人臍帶間充質(zhì)干細胞的平均群體倍增時間為.小時。文復夏苔餐露蒜搴瓴俠毫如.北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文

32、.人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞周期分析對時內(nèi)處理組的第代細胞進行細胞周期分析圖發(fā)現(xiàn):/期細胞占總體的.%/期占.%,位于橫坐標的.期占.%/為.期為四倍體細胞,期為二倍體細胞,比值為細胞碎片為.%,細胞聚集體為.%哺甜:啦.腩:卜:響啪 : 脯粥:.辱:.% .:.% .:.菘,:.%:.靼: .%.:.男:.努細螄:.%翻:嘴:卵:. .人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞免疫表型鑒定對時內(nèi)處理組的第四代細胞進行細胞免疫表型鑒定結果為:?:.%,?:.%,: .%,:.%,:.%、:.%。?類分子、間充質(zhì)干細胞表面常見分子、表達為陽性;而?類分子及造血干細胞表面分子表達為陰性、白細胞表面共同抗原弱表達。見圖

33、。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文澈橢鱸高凇轟;霉毒。瓔勃醇菇畦曩鞠群鉻髓樹一一柚柚 蝣耪 輯瑚蘸 露 .鎊嵫 輯越嗽糖秘蝴韓掙醐 麓”搬一麓劓睡辯焉岱群鈿矗鬣秘一螂時辮越%蝴 ,嘲 囂纛磁 越麓心花麓. 北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外誘導向成脂分化能力對小時內(nèi)處理組的第四代細胞進行成脂誘導分化發(fā)現(xiàn),誘導一周左右,細胞形態(tài)發(fā)生變化,由長梭形變?yōu)槎趟笮?且呈現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象,鏡下可見成小片方形狀的細胞聚集團。兩周左右可見胞質(zhì)內(nèi)折光性強的脂滴。對其進行油紅染色,可見被染紅的脂滴,陰性對照組未見任何明顯改變見圖。. .? 孕 垂.人臍帶間充質(zhì)干細胞體外誘導向成骨分化能力對小時內(nèi)處理組的第

34、四代細胞進行成骨誘導分化發(fā)現(xiàn),誘導一周左右時可見細胞形態(tài)發(fā)生細微變化,形狀較原先而言變的不規(guī)則,高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含有黑色細小顆粒,且細胞外基質(zhì)成分增多。二周后可見細胞形成類似結節(jié)狀結構,經(jīng)茜素紅染色后可見細胞聚集處有深色沉著物,中間顏色深,并向四周放射,陰性對照組中未見明顯改變。見圖黻 .妣舀 . 仃伊北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文討論目前已有相當數(shù)量的研究小組從人源臍帶分離出間充質(zhì)干細胞,主要來源于自臍帶的及臍靜脈皮下層“馴,其主要分離方法是酶消化法和組織塊法。組織塊法由貼壁的組織直接獲得,相對酶消化法的化學反應過程而言對細胞傷害較小。瞄等研究表明過多消化組織會降低細胞的生存能力,消化過程中可

35、能會水解細胞表面受體,從而改變細胞的功能。此外,這種方式可以提高臍帶組織的利用率,浪費較小;省去酶消化法的復雜的操作步驟,并節(jié)約成本。因此有很多研究小組選擇使用組織塊貼壁法進行人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離,其中不乏有獲得較高細胞得率的小組?？紤]到細胞產(chǎn)業(yè)化需要這種低成本、高效的方式,于是本實驗對組織塊貼壁法分離人臍帶間充質(zhì)干細胞產(chǎn)業(yè)化的可行性進行了研究。實驗中選用含有%的培養(yǎng)基進行組織塊分離培養(yǎng),成分相對簡單,避免由于增加其他額外成分而造成細胞促分化的可能。有利于日后細胞產(chǎn)品的開發(fā)應用。由于臍帶問充質(zhì)干細胞產(chǎn)業(yè)化后臍帶采集后處理時間不一,本實驗觀察臍帶采集后不同處理時間及將采集臍帶液氮冷凍處理后對

36、臍帶間充質(zhì)干細胞的影響。以期對臍帶組織塊貼壁分離培養(yǎng)方法在產(chǎn)業(yè)化中應用進行探討。實驗結果可見,小時內(nèi)處理組培養(yǎng)天后鏡下可見細胞貼壁生長,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均可得到.個細胞/;?小時處理組天后鏡下可見原代細胞生長,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均可獲得.個細胞/;?小時處理組天可獲得原代細胞,平均獲得原代細胞的時間為.天,平均可獲得.個細胞/;液氮凍存組冷凍后復蘇的組織可以獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞,且形態(tài)與非冷凍組得到的細胞形態(tài)相似,天可以獲得原代貼壁細胞,平均可以獲得.個細胞/。其中小時內(nèi)處理組的標本全部可以得到貼壁的,而?小時處理組和?小時處理組分離成功率分別約為%和%。實驗表

37、明處理時間對組織塊貼壁分離法的成功率有影響,且小時內(nèi)處理組得到的原代細胞數(shù)與其它組別有統(tǒng)計學差異。.。此與徐燕瞄副研究報道的能獲得.個細胞/相差較大,分析原因可能主要有兩個方面:一是培養(yǎng)體系的差異,本實驗的培養(yǎng)體系除%外不含任何促進細胞生長的生長因子成份;二是與臍帶組織的新鮮程度有關,本實驗結果可以看出臍帶標本處理時間愈早,分離成功率越高,并且獲得的細胞數(shù)量愈多。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文本實驗分離獲得的細胞其人臍帶間充質(zhì)干細胞常見表面分子、陽性,而造血細胞表面標記、為陰性或弱表達;?類分子表達為陽性,而?類分子表達為陰性;細胞周期顯示,/期細胞占總體.%。在體外可誘導向成骨、成脂方向分化。上

38、述數(shù)據(jù)證明本實驗應用組織塊貼壁分離法可以獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞。在間充質(zhì)干細胞產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中需要操作簡單,周期較短,成本較低的工藝方法。組織塊貼壁分離法雖然可以獲得貼壁的,但得到原代細胞的時間過長,占用細胞培養(yǎng)箱較多,加之在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)運作中由于臍帶運輸采集過程中會遇到很多非可控因素,可能存在臍帶采集后不能馬上處理的情況,而此種分離方法與處理時間密切相關,隨著處理時間延長,分離成功率呈現(xiàn)下降趨勢。因此組織塊貼壁法是否適合于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,有待進一步討論。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文小 結.臍帶組織塊分離法可以獲得原代貼壁的。.臍帶組織塊液氮冷凍后復蘇也可以獲得原代貼壁。.臍帶組織的處理時間對分離的成功率

39、有影響。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文二、因子對原代人臍帶間充質(zhì)干細胞促貼壁生長的影響和均為體內(nèi)一種活性物質(zhì),由體內(nèi)一系列的酶聯(lián)反應發(fā)揮促生長的作用,蟛刮等人在對人臍血間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)研究中表明添加和等因子可以促細胞增殖。【】等在人臍帶間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)中應用咖可以增強其貼壁生長。為了進一步提高人臍帶間充質(zhì)干細胞的得率,本實驗在原代人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)體系中添加和因子,討論其對原代人臍帶問充質(zhì)干細胞貼壁生長的影響。實驗方法.酶消化法分離人臍帶間充質(zhì)干細胞使用醫(yī)用鑷子將臍帶從臍帶采集瓶中取出,放入第一個燒杯中浸泡清洗。由鑷子取出臍帶放入其中一個大號培養(yǎng)皿中,并使用手術刀切除雙側(cè)手術線

40、結扎及淤血部分。用含雙抗對剩余組織在余下的兩個燒杯中進行充分清洗,一般沖洗兩遍,去除血污。將清洗干凈的臍帶置于另一個大號培養(yǎng)皿中,均分為?部分,平均每部分約長?。對每一小部分沿縱向進行分離,使臍帶組織管狀變?yōu)槠瑺?。將片狀臍帶組織進行進一步的分離,將剝離好的臍帶組織進一步剪碎,成糜狀后,先后移入兩個燒杯中,充分清洗。將洗好的組織移入含有.%膠原酶的消化液中。加入.%胰酶補充消化。移入搖床,。,消化.個小時。將消化完全的消化液以目過濾網(wǎng)過濾,分裝在兩個燒杯內(nèi)。將過濾后的液體分裝在六個的離心管中,配平,離心,分鐘。棄上清,用不含血清的/液進行洗滌和吹打。將洗好吹起的細胞懸液移入個離心管中,再次離心,

41、分鐘。棄上清,用適量完全培養(yǎng)基重懸細胞后鋪入孔板中培養(yǎng)。、因子對原代人臍帶間充質(zhì)干細胞的生長增殖的影響分別以完全培養(yǎng)基組含%的/培養(yǎng)基、組/細胞培養(yǎng)基、組/細胞培養(yǎng)基、組/細胞培養(yǎng)基重懸細胞,鋪種至孔板,每組。于培養(yǎng)至第三設置三個復孔,使每孔細胞數(shù)達.,每孔體積北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文天時按上述培養(yǎng)基分別換液,連續(xù)培養(yǎng)天。利用血球計數(shù)板進行臺盼藍染色計數(shù)。以公式計算原代細胞的促貼壁時間:/。:倍增時間,:細胞數(shù)由至的時間;:細胞數(shù)。.、因子對傳代后人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞周期的影響對各組細胞進行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第代,取對數(shù)生長期的細胞,應用“試劑盒進行檢測,基本方法參見第一部分人臍帶間充質(zhì)干

42、細胞的細胞周期測定。.、因子對傳代后人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞免疫表型的影響對各組細胞進行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第代,取對數(shù)生長期的細胞,進行細胞免疫表型檢測。具體方法參見第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞免疫表型的測定。.、因子對傳代后人臍帶間充質(zhì)干細胞的誘導分化的影響將各組細胞傳至第代,用胰酶消化,用含%的培養(yǎng)基中和消化作用,并吹打培養(yǎng)瓶壁,將吹打好的細胞懸液離心甲,分鐘。用細胞培養(yǎng)基重新吹打重懸,每組均分為成脂誘導、成骨誘導及相應的陰性對照,鋪種至孔板和孔板中。并對誘導兩周后的細胞進行成脂和成骨染色鑒定,具體步驟參見第一部分實驗方法、相關內(nèi)容。.統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,應用統(tǒng)本實驗采用研

43、進行圖表繪制。計量資料以均數(shù)標準差表計表和研印 示。組間均數(shù)比較采用獨立樣本檢驗,以.為差異有統(tǒng)計學意義。北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文實驗結果.、因子對原代入臍帶間充質(zhì)干細胞貼壁生長的影響利用公式,計算得出:完全培養(yǎng)基組促貼壁時間平均為.小時,組為.小時,組為.小時,組為.小時。圖對促貼壁時間進行統(tǒng)計學分析得出,組與完全培養(yǎng)組相比,.,組與完全培養(yǎng)組相比.,而組與完全培養(yǎng)組相比,.,具有統(tǒng)計學差異。幽緞簏蠛彝器繒緇貔緒彝纂地虬固鈉繃黧垮棼鏨爭孵潮繃穩(wěn)垮莽簇瓣峭孵夥貼綮時帶來間/、邑筠 仃 電.幸牛. 宰宰. 倒置顯微鏡下觀察,原代細胞接種后,細胞大部分貼壁,外觀呈紡錘形和多角形。圖.經(jīng)過天培養(yǎng)后

44、,鏡下可見各組間細胞數(shù)量差異明顯。其中,組、組細胞生長密集。圖.?北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文 . . . . . 北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文.、因子對原代人臍帶間充質(zhì)干細胞對原代促生長情況對細胞生長曲線觀察分析,四組曲線均為形,第?天為適應期,從第天起組增殖明顯并進入對數(shù)生長期,且組細胞數(shù)量是完全培養(yǎng)基組的倍左右,.,具有統(tǒng)計學差異。第天,組、組、組與完全培養(yǎng)基組相比,均顯示出統(tǒng)計學意義。數(shù)量上,組是完全培養(yǎng)基組的.倍,.;組為完全培養(yǎng)基組.倍,.;組為完全培養(yǎng)基組的.倍,.。刁曼冀復 島盛翟糍鬃毽良幻. .? 心 姻: : :.、因子對傳代人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞周期的影響對傳代培養(yǎng)至第代各組人臍帶間充質(zhì)干細胞進行細胞周期檢測,結果為:.完全培養(yǎng)基組圖/期細胞占總體的.%/期占.%,位于橫坐標的.,期占.%/為.期為四倍體細胞,期為二倍體細胞,比值為.細胞碎片為.%,細胞聚