降血糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1、輔助降血糖作用檢驗(yàn)方法1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1 動(dòng)物選擇選用健康成年動(dòng)物，常用小鼠（ 25 2g）或大鼠（ 180 20g），單一性別，大鼠每組 8-12 只、小鼠每組 10-15 只。1.2 材料1.2.1 試劑四氧嘧啶（或鏈脲霉素） 小鼠 35-50mg/kg.bw.iv（ 100-160mg/kg.bw.ip ）、大鼠 50-80mg/kg.bw.iv （ 200-250mg/kg.bw.ip ）用新鮮配制。血溏測(cè)定試紙或試劑盒。1.2.2 儀器 血糖儀、全自動(dòng)生化儀、 721-B 型分光光度計(jì)。1.3 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間設(shè) 1 個(gè)溶劑對(duì)照組和 3 個(gè)受試樣品劑量組， 根據(jù)人體每日每公

2、斤體重推薦攝入量，小鼠擴(kuò) 大 10 倍作為其中一個(gè)劑量組 （大鼠擴(kuò)大 5 倍），根據(jù)受試樣品的具體情況另設(shè)兩個(gè)劑量組。 受試樣品給予時(shí)間原則上不少于 30 天，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行設(shè)定期限。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 降低空腹血糖實(shí)驗(yàn)1.4.1.1 高血糖模型動(dòng)物1.4.1.1.1 原理 四氧嘧啶（或鏈脲霉素）是一種細(xì)胞毒劑，可選擇性地?fù)p傷多種動(dòng)物的胰島細(xì)胞，造 成胰島素分泌低下引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病。1.4.1.1.2 造型動(dòng)物禁食 24 小時(shí)后，給予四氧嘧啶造型， 5-7 天后禁食 3-5 小時(shí)，測(cè)血糖，血糖值 10-25mmol/L 為高血糖模型成功動(dòng)物。1.4.1.1.3 操作步驟選高血糖模

3、型動(dòng)物按禁食 3-5 小時(shí)的血糖水平分組，隨機(jī)選 1 個(gè)模型對(duì)照組和 3 個(gè)劑量組 （組間差不大于 1.1mmol/L ）。劑量組給予不同濃度受試樣品， 模型對(duì)照組給予溶劑， 連續(xù) 30 天，測(cè)空腹血糖值（禁食同實(shí)驗(yàn)前） ，比較各組動(dòng)物血糖值及血糖降低的絕對(duì)值（即實(shí) 驗(yàn)前后血糖的差值） 。1.4.1.2 正常動(dòng)物選健康成年動(dòng)物按禁食 3-5 小時(shí)的血糖水平分組， 隨機(jī)選 1 個(gè)對(duì)照組和 1 個(gè)受試樣品組 （高 劑量）。余操作同 1.4.1.1.3。1.4.2 糖耐量實(shí)驗(yàn) 高血糖模型動(dòng)物禁食 3-5 小時(shí)，劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶 劑， 15-20分鐘后經(jīng)口給予葡萄糖

4、2.0g/kg 或醫(yī)用淀粉 3-52.0g/kg，測(cè)定給葡萄糖后 0、0、 5、2 小時(shí)的血糖值或人醫(yī)用淀粉后 0、1、2 小時(shí)的血糖值， 觀察模型對(duì)照組與受試樣品組 給葡萄糖或醫(yī)用淀粉后各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積的變化。血糖曲線下面積 =1/2（ 0 小時(shí)血糖值 +0.5 小時(shí)血糖值） 0.5+1/2（ 2 小時(shí)血糖值 +0.5 小時(shí)血糖值） 1.5=0.25（ 0 小時(shí)血糖值 +40.5 小時(shí)血糖值 +3 2小時(shí)血糖值） .1.5 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F 值，F(xiàn)值 降空腹血糖實(shí)驗(yàn)： 受試樣品劑量組與對(duì)照組比較，空腹血糖實(shí)測(cè)值

5、降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 可判定該受試樣品降空腹血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。糖耐量實(shí)驗(yàn)：受試樣品劑量組與對(duì)照組比較，在給葡萄糖或醫(yī)用淀粉后、0.0、0.5、2.0 小時(shí)血糖曲線下面積降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可判定該受試樣品糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。1.6 注意事項(xiàng)1.6.1 為了使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖代謝功能狀態(tài)盡量保持一致， 也為了準(zhǔn)確地按體重計(jì)算受試樣品的 用量，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物應(yīng)嚴(yán)格禁食（不禁水） ，實(shí)驗(yàn)前后禁食條件應(yīng)一致，鼠類(lèi)在禁食的同時(shí) 應(yīng)更換襯墊物。1.6.2血糖測(cè)定用試紙或試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作；若自行配制試劑，按附 1操作。1.6.3 如用血清樣品進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)于取血后 30 分鐘內(nèi)分離血清，分離后血清的含糖量在 6 小時(shí)內(nèi)

6、不變。用血清制備的無(wú)蛋白血濾液可保存 48 小時(shí)以上。1.6.4 高濃度的還原性物質(zhì)如 Vit C 亦能與色素原競(jìng)爭(zhēng)游離氧，干擾反應(yīng)，使結(jié)果偏低。血 紅蛋白能使過(guò)氧化氫過(guò)早分解，亦干擾反應(yīng)，致使測(cè)得血糖值偏低。故對(duì)已溶血的全血或 血清必須制備無(wú)蛋白濾液后，再進(jìn)行測(cè)定。 附 1血糖值測(cè)定方法1 原理葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶， 能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫， 后者在過(guò)氧化 物酶作用下放出氧，使 4-氨基安替比林與酚氧化縮合，生成紅色醌類(lèi)化合物，可在波長(zhǎng) 505nm 比色測(cè)定。2 試劑配制 磷酸鹽緩沖液（ 0.2mol/L, PH7.0 ）0.2mol/L Na2HPO4 61ml ，0.

7、2mol/L KH2HPO4 39ml 混合即可。 酶試劑葡萄糖氧化酶 400u，過(guò)氧化物酶 0.6mg,4- 氨基安替比林 10mg，疊氮鈉 100mg 加磷酸鹽緩 沖液至 100ml，PH 調(diào)至 7。冰箱存放至少可穩(wěn)定 2 個(gè)月。酚試劑酚 100mg 溶于 100ml 蒸餾水中。 酶混合試劑取等量酶試劑和酚試劑混合。在冰箱中可存放1 個(gè)月。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存液：無(wú)水 D-葡萄糖( A.R. )在烤箱中 80烤 4 小時(shí)，冷卻后，存放于干燥器中至恒 重。精確稱(chēng)取 2g 以 0.25% 苯甲酸溶液溶解并移入 100ml 容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀釋 至 100ml 。應(yīng)用液：在 100ml 容量

8、瓶中準(zhǔn)確加入儲(chǔ)存液 5ml，再用 0.25%苯甲酸溶液稀釋至 100ml ， 即 1mg/mL 應(yīng)用液。蛋白沉淀劑溶解磷酸氫二鈉 10g、鎢酸鈉 10g、氯化鈉 9g 于 800ml 蒸餾水中， 加入 1mol/L 鹽酸 125ml ， 并用蒸餾水稀釋至 1000ml 。3 操作步驟取蛋白沉淀劑 1ml 加入血漿(血清) 50ul 混勻。室溫放置 7 分鐘后，離心，取上清液(無(wú) 蛋白血濾液)測(cè)定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液亦進(jìn)行同樣處理。測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管無(wú)蛋白血濾液 mL0.5-處理后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 mL-0.5-蛋白沉淀液 mL0.5酶混合試劑 mL444混勻后， 37水浴保溫 15 分鐘，用空白管

9、調(diào)零點(diǎn)，在波長(zhǎng) 505nm 處比色。4 結(jié)果計(jì)算2 人體試食試驗(yàn)2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用隨機(jī)分組，組間和自身兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。2.2 受試產(chǎn)品 受試產(chǎn)品必須是具有定型包裝、標(biāo)明服用方法服用量的定型產(chǎn)品；安慰劑除功效成分外， 在劑型、口感、外觀和包裝上與受試產(chǎn)品保持一致。2.3 受試者選擇2.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn)選擇經(jīng)飲食控制或口服降糖藥治療后病情較穩(wěn)定， 不需要更換藥物品種及劑量， 僅服用維 持量的成年 II 型糖尿病病人，空腹血糖7.8mmol/L ( 140mg/dl )或餐后 2h 血糖11.1mmol/L ( 200mg/dl )；也可選擇 7.8mmol/L 空腹血糖 6.7mmol/L

10、( 120mg/dl )或 11.1mmol/L 餐后 2h 血糖 7.8mmol/L 的高血糖人群。2.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn)2.3.2.1 I 型糖尿病病人。2.3.2.2 年齡在 18 歲以下或 65 歲以上，妊娠或哺乳期婦女，對(duì)受試樣品過(guò)敏者。2.3.2.3 有心、肝、腎等主要臟器并發(fā)癥，或全并有其它嚴(yán)重疾病，精神病患者，服用糖皮 質(zhì)激素或其它影響血糖藥物者。2.3.2.4 不合作者（指不能配合飲食控制而影響觀察結(jié)果者） 。2.3.2.5 近 3 個(gè)月內(nèi)有糖尿病酮癥、酸中毒以及感染者。2.3.2.6 凡不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定服用受試樣品，或資料不全影響觀察結(jié)果者。2.4 受試者分組 按受試

11、者的血糖水平隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如病程、 服藥種類(lèi)（黃脲類(lèi)、雙胍類(lèi)）等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受度者不 少于 50 例。、2.5 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)前對(duì)每一位受試者按性別、年齡、不同勞動(dòng)強(qiáng)度、理想體重參照原來(lái)生活習(xí)慣規(guī)定相 應(yīng)的飲食，試食期間堅(jiān)持飲食控制，治療糖尿病的藥物種類(lèi)和劑量不變。試食組在服藥的 基礎(chǔ)上，按推薦服用方法服用量每晶是食受試樣品，對(duì)照組在服藥的基礎(chǔ)上，可不進(jìn)行任 何處理（或服用安慰劑） 。連續(xù)觀察時(shí)間不少于 30 天，必要時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)。2.6 觀察指標(biāo) 各項(xiàng)指標(biāo)于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束各檢測(cè)一次，必要時(shí)實(shí)驗(yàn)中期血糖指標(biāo)可加測(cè)一次。2.6

12、.1 安全性指標(biāo)2.6.1.1 一般狀況體征 包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.6.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查2.6.1.3 肝、腎功能檢查2.6.1.4 胸透、心電圖、腹部 B 超檢查（僅試驗(yàn)前檢查一次）2.6.2 功效指標(biāo)2.6.2.1 癥狀觀察 詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史，了解患者飲食情況，用藥情況，活動(dòng)量，觀察口渴多飲、多食易饑、倦怠 乏力、多尿等主要臨床癥狀，按癥狀輕重積分，于試食前后統(tǒng)計(jì)積分值，并就其主要癥狀 改善（改善 1 分為有效），觀察臨床癥狀改善率。臨床癥狀積分表無(wú)癥（積 0 分）輕癥（積 1 分）中癥（積 2 分）重癥（積 3 分）口渴多飲無(wú)有口渴感，飲水量2000ml/ 日多食

13、易饑無(wú)餐前有輕度饑餓感餐前有明顯饑餓感晝夜均有饑餓感倦怠乏力無(wú)精神不振，可堅(jiān)持體力勞動(dòng)精神疲乏，勉強(qiáng)堅(jiān)持日常工作精神極度疲乏， 不能堅(jiān)持日?；顒?dòng)多尿癥狀消失， 尿量尿量尿量尿量3000ml/日2.6.2.2 空腹血糖 觀察試食前后空腹血糖值及血糖下降的百分率。2.6.2.3 餐后 2h 血糖 觀察試食前后食用 100g 精粉饅頭后 2小時(shí)血糖值及血糖下降的百分率。2.6.3.4 尿糖 用空腹晨尿定性，按、 +、+、+、 +分別積 0、0、5、1、2、 3、4 分，于試 食前后統(tǒng)計(jì)積分值。2.6.2.5 血脂 觀察試食前后血清總膽固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇水平。2.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 凡自身對(duì)照資料可以采用配對(duì) t 檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組 t 檢驗(yàn)，后者需進(jìn)行方差齊 性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿(mǎn)足正態(tài)方差齊后，用 轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行 t 檢驗(yàn)；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿(mǎn)足正態(tài)或方差齊的要求，改用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；方差劑但變異系數(shù)太大（如CV50% ）的資料應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。結(jié)果判定 空腹血糖結(jié)果判