熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)演示課件

1、1.1Page 14/28/2021 1.1Page 24/28/2021 什么是顯微鏡熒光檢測(cè)？什么是顯微鏡熒光檢測(cè)？ 一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標(biāo)本一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標(biāo)本: 1）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或 2）利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒）利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒 光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮光供作觀察。作出定

2、性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮 度）。度）。 其中：其中：1）為自發(fā)熒光，）為自發(fā)熒光，2）為繼發(fā)熒光。）為繼發(fā)熒光。 1.1Page 34/28/2021 落射熒光與透射光觀察的區(qū)別落射熒光與透射光觀察的區(qū)別 1.1Page 44/28/2021 落射熒光與透射光觀察的區(qū)別落射熒光與透射光觀察的區(qū)別 什么是熒光 ? 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度 輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光 1.1Page 64/28/2021 熒光的性質(zhì) 吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光

3、波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能） 熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度 有不同程度的衰減 熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率 1.1Page 74/28/2021 熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途 優(yōu)點(diǎn)： 檢出能力高（放大作用） 對(duì)細(xì)胞的刺激?。梢曰铙w染色） 能進(jìn)行多重染色 用途： 物體構(gòu)造的觀察熒光素 熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗體熒光等 發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析 1.1Page 84/28/2021 標(biāo)本制作的順序標(biāo)本制作的順序 組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片、染色、封片組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片、染色、封片 培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞 1.1Pag

4、e 94/28/2021 組織固定組織固定 活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會(huì)因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué)活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會(huì)因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué) 改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。 選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是： （1）最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；）最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定

5、液在免疫組化和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中 是禁用的；是禁用的； （3）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會(huì)）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會(huì) 使上皮細(xì)胞產(chǎn)生非特異性熒光；使上皮細(xì)胞產(chǎn)生非特異性熒光； （4）固定劑的選擇、固定時(shí)間、溫度和）固定劑的選擇、固定時(shí)間、溫度和PH值都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。值都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1.1Page 104/28/2021 單純固定液?jiǎn)渭児潭ㄒ?（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、及免疫組化、PCR等工作。中性等工作。中性

6、 甲醛是以甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對(duì)組織抗原性的保存均優(yōu)的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對(duì)組織抗原性的保存均優(yōu) 于一般的于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時(shí)間不超過一個(gè)甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時(shí)間不超過一個(gè) 月。月。 甲醛（甲醛（40%） 100ml 無水磷酸氫二鈉無水磷酸氫二鈉 6.5g 磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水蒸餾水 900ml 1.1Page 114/28/2021 單純固定劑單純固定劑 （2）乙醇固定液：使用時(shí)以）乙醇固定液：使用時(shí)以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、

7、固定、脫水等作用，對(duì)組織的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對(duì)組織 滲透力較弱，因此很少單獨(dú)使用，但其保存組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛，故常用于有核滲透力較弱，因此很少單獨(dú)使用，但其保存組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛，故常用于有核 酸操作的實(shí)驗(yàn)或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于酸操作的實(shí)驗(yàn)或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定組織。乙醇固定組織。 （3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。 1.1Page 124/28/2021 混合固定液混合固定液 （1）乙醇）乙醇-甲醛（乙醇甲醛（乙醇-福爾馬林，福爾馬林，AF）

8、固定液：適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定）固定液：適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定 液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入95%乙醇脫水。乙醇脫水。 甲醛（甲醛（40%） 100ml 95%乙醇乙醇 900ml （2）B5（醋酸鈉（醋酸鈉-升汞升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。 無水醋酸鈉無水醋酸鈉 1.25g 升汞升汞 6.0g 蒸餾水蒸餾水 90ml 使用前加入甲醛使用前加入甲醛 10ml 1.1Page 134/28/2021 混合固定液混合固

9、定液 （3）Bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對(duì)組織固定較均勻，收縮很液對(duì)組織固定較均勻，收縮很 少，不會(huì)使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。少，不會(huì)使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。 飽和苦味酸水溶液（約飽和苦味酸水溶液（約1.22%） 75ml 甲醛甲醛 25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml （4）Carnoy固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適用于固定外膜致固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適用于固定外膜致 密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。 無水乙醇無水乙醇 6

10、0ml 氯仿氯仿 30ml 冰醋酸冰醋酸 10ml 1.1Page 144/28/2021 混合固定液混合固定液 （5） Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需 特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。 升汞升汞 5.0g 重鉻酸鉀重鉻酸鉀 2.5g 硫酸鈉硫酸鈉 1.0g 蒸餾水（加至）蒸餾水（加至）100ml 1.1Page 154/28/2021 取材取材 組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)

11、本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后 續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。 細(xì)胞標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本的取材 （1）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞 （2）懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞：）懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞： 沉淀涂片，細(xì)胞離心涂片器（沉淀涂片，細(xì)胞離心涂片器（cytospin），）， 載玻片上涂粘附劑載玻片上涂粘附劑多聚賴氨酸（多聚賴氨酸（0.010.5%），）， 甲醛甲醛-明膠，鉻礬明膠，明膠，鉻礬明膠， Vectabond試劑試劑 （3）體液沉淀涂片法）體液沉淀涂片法 （4）穿

12、刺吸取涂片法）穿刺吸取涂片法 （5）印片法）印片法 1.1Page 164/28/2021 組織脫水組織脫水 試劑試劑濃度溫度濃度溫度時(shí)間設(shè)定時(shí)間設(shè)定 中性緩沖甲醛中性緩沖甲醛 乙醇乙醇 乙醇乙醇 乙醇乙醇過夜過夜 無水乙醇無水乙醇 無水乙醇無水乙醇 二甲苯無水乙醇二甲苯無水乙醇體積比為：體積比為： 二甲苯二甲苯 二甲苯二甲苯 石蠟石蠟 石蠟石蠟 石蠟石蠟 1.1Page 174/28/2021 包埋包埋 組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包 制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等

13、的過程稱為包埋。制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。 包埋步驟包埋步驟 先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包 埋托中央，放在小冷臺(tái)商，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再埋托中央，放在小冷臺(tái)商，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再 加好石蠟，移至冷凍臺(tái)上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的不同，加好石蠟，移至冷凍臺(tái)上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的不同， 選擇大小型號(hào)合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用

14、鑷子將組織固定在蠟塊中央稍選擇大小型號(hào)合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍 停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r(shí)立住，達(dá)到立埋的要求。停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r(shí)立住，達(dá)到立埋的要求。 1.1Page 184/28/2021 切片切片 冰凍切片冰凍切片 為免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠比較完好地保存多種為免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠比較完好地保存多種 抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的 組織均可作

15、冰凍切片。組織均可作冰凍切片。 冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中 保存。保存。 要注意刀片等接觸陽性物質(zhì)的污染問題。要注意刀片等接觸陽性物質(zhì)的污染問題。 1.1Page 194/28/2021 切片切片 石蠟切片石蠟切片 其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能連續(xù)切片（薄其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能連續(xù)切片（薄 片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。 用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的

16、石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進(jìn)用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進(jìn) 行。行。 脫水、透明等過程應(yīng)在脫水、透明等過程應(yīng)在4下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失；下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失； 組織塊大小應(yīng)限于組織塊大小應(yīng)限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸臘；，使組織充分脫水、透明、浸臘； 浸臘、包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在浸臘、包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在60以下，以熔點(diǎn)低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）；以下，以熔點(diǎn)低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）； 石蠟切片應(yīng)放在石蠟切片應(yīng)放在37恒溫箱過夜，這樣烤片

17、可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存，恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存， 可存放于可存放于4冰箱內(nèi)備用；冰箱內(nèi)備用； 冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了 抗原的丟失。抗原的丟失。 1.1Page 204/28/2021 切片切片 振動(dòng)切片振動(dòng)切片 可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成20100um的厚片，以漂浮法進(jìn)行染色。組織不冰凍，的厚片，以漂浮法進(jìn)行染色。組織不冰凍， 無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前

18、避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì) 抗原的損害，能比較好地保留組織細(xì)胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原?？乖膿p害，能比較好地保留組織細(xì)胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原。 1.1Page 214/28/2021 封片封片 封片劑封片劑 常用甘油和常用甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。 如需將染色后的樣品保存一段時(shí)間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。如需將染色后的樣品保存一段時(shí)間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。 一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水

19、透明，封片最好用一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用DPX。 由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用PBS或生理鹽水也可以?；蛏睇}水也可以。 1.1Page 224/28/2021 組織和細(xì)胞的自發(fā)性熒光檢測(cè)組織和細(xì)胞的自發(fā)性熒光檢測(cè) 1、動(dòng)物組織一般呈現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強(qiáng)；、動(dòng)物組織一般呈現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強(qiáng)； 2、紅細(xì)胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)合，鐵離子有抑制熒光作用，、紅細(xì)胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)

20、合，鐵離子有抑制熒光作用， 所以紅細(xì)胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細(xì)胞可呈紅色熒光；所以紅細(xì)胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細(xì)胞可呈紅色熒光； 3、細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細(xì)胞核兩側(cè)的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長(zhǎng)或在某些疾病的情、細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細(xì)胞核兩側(cè)的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長(zhǎng)或在某些疾病的情 況下，可見較大量的棕黃色脂褐素?zé)晒忸w粒；況下，可見較大量的棕黃色脂褐素?zé)晒忸w粒； 4、某些腫瘤細(xì)胞在紫外或藍(lán)光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷；、某些腫瘤細(xì)胞在紫外或藍(lán)光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可

21、作原位腫瘤的早期診斷； 5、維生素、維生素A呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素A后，在肝細(xì)胞、后，在肝細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞、腎上腺束狀帶細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎上腺束狀帶細(xì)胞、肺 和腎的間質(zhì)細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和黃體細(xì)胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見到維生素和腎的間質(zhì)細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和黃體細(xì)胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見到維生素A的綠色熒光；的綠色熒光； 6、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合，、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合， 利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動(dòng)物以觀察

22、新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細(xì)胞有較大的親合力，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動(dòng)物以觀察新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細(xì)胞有較大的親合力， 能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶；能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶； 7、有機(jī)體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的內(nèi)源性生物胺、有機(jī)體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的內(nèi)源性生物胺兒茶酚胺、兒茶酚胺、5-羥色胺和羥色胺和 組織胺等與某些醛類物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。組織胺等與某些醛類物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。 1.1Page 234/28/2021 熒光組織細(xì)胞染色（熒光探針檢測(cè)，熒光標(biāo)記檢

23、測(cè)）熒光組織細(xì)胞染色（熒光探針檢測(cè)，熒光標(biāo)記檢測(cè)） 1.1Page 244/28/2021 熒光染色方法熒光染色方法 浸染（組織或細(xì)胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細(xì)胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適浸染（組織或細(xì)胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細(xì)胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適 用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固，染色時(shí)間需要比較長(zhǎng)，染色均勻。用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固，染色時(shí)間需要比較長(zhǎng)，染色均勻。 滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細(xì)胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細(xì)胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固 定不是很牢固，染

24、色時(shí)間較短。染色不易均勻，特別是時(shí)間比較長(zhǎng)時(shí)，需添加染料。定不是很牢固，染色時(shí)間較短。染色不易均勻，特別是時(shí)間比較長(zhǎng)時(shí)，需添加染料。 漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細(xì)胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細(xì)胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織 片，或黏附在一些膜上的組織細(xì)胞，染料使用相對(duì)較少。由于樣品一般是反過來面朝下片，或黏附在一些膜上的組織細(xì)胞，染料使用相對(duì)較少。由于樣品一般是反過來面朝下 （染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。（染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。 1.1Page 254/28/2021 細(xì)胞

25、骨架細(xì)胞骨架F-actin（F-肌動(dòng)蛋白）染色：肌動(dòng)蛋白）染色： 用用FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin（鬼筆環(huán)肽）。（鬼筆環(huán)肽）。 F-肌動(dòng)蛋白是大多數(shù)真核細(xì)胞中以聚合絲形式存在的肌動(dòng)蛋白。肌動(dòng)蛋白是大多數(shù)真核細(xì)胞中以聚合絲形式存在的肌動(dòng)蛋白。Phalloidin能與細(xì)胞內(nèi)的能與細(xì)胞內(nèi)的F- actin特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)Phalloidin上結(jié)合的熒光標(biāo)記，使上結(jié)合的熒光標(biāo)記，使F-肌動(dòng)蛋白被觀察到。肌動(dòng)蛋白被觀察到。 FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin，溶于甲醇中制成貯存液（，溶于甲醇中制成貯存液（200u/

26、ml），染色時(shí)終濃度），染色時(shí)終濃度 為為5u/ml。 細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片 PBS洗滌洗滌 2%戊二醛固定戊二醛固定15分鐘分鐘 PBS洗滌洗滌 0.2%Triton X-100抽提抽提2分鐘分鐘 PBS洗滌洗滌 FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin室溫室溫20分鐘分鐘 PBS洗滌，觀察。洗滌，觀察。 1.1Page 264/28/2021 Fluorochromes and Stains nDAPI, Hoechst, SYTO 16: semipermeant and permeant DNA stain, apoptosis nGFP: used in livin

27、g systems as a gene/protein reporter nLucifer yellow, Fluorogold: neuronal tracer nMitoFluor green, MitoTracker green: mitichondrial marker 1.1Page 274/28/2021 nDiI: lipophilic membrane marker nRhodamine 6G, MitoTracker red: mitochondrial and ER marker nPropidium iodide, Ethidium Bromide, SYTO 25: i

28、mpermeant and permeant nucleic acid stain TO-PRO-3 Alexa 488 Alexa 568 Human colon crypt Christine Anderson, Laboratory of Prof. Ray White, Hunstsman Cancer Institute, Utah 1.1Page 294/28/2021 細(xì)胞熒光離子探針細(xì)胞熒光離子探針 游離鈣離子含量測(cè)定：游離鈣離子含量測(cè)定： 有有Fura 2 AM, Indo 1和和Fluo 3AM, 前兩者激發(fā)波長(zhǎng)為紫外，而且均是雙激發(fā)波長(zhǎng)的比率熒光，前兩者激發(fā)波長(zhǎng)為紫外，而

29、且均是雙激發(fā)波長(zhǎng)的比率熒光， 所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用Fluo 3AM。Ex/Em: 506/526。 Fluo 3本身不發(fā)熒光，只有當(dāng)與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。本身不發(fā)熒光，只有當(dāng)與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。 Fluo 3AM不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（Fluo 3 不能透過細(xì)胞膜進(jìn)不能透過細(xì)胞膜進(jìn) 入細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞后的入細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞后的Fluo 3AM中的中的AM被細(xì)胞內(nèi)非

30、特異性酯酶水解，變?yōu)楸患?xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解，變?yōu)镕luo 3， Fluo 3與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)弱直接反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)弱直接反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子 的含量。的含量。 Fluo 3AM 染色：染色：Fluo 3AM用用DMSO配成貯存液，冰凍保存，使用時(shí)終濃度為配成貯存液，冰凍保存，使用時(shí)終濃度為1uM。染色一。染色一 般為般為37，3045分鐘。分鐘。 Fluo 3染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可以通過時(shí)間掃描，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動(dòng)態(tài)觀察。染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可以通過時(shí)間掃描，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動(dòng)態(tài)觀察。 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)pH的測(cè)定

31、：的測(cè)定： SNAFL：雙發(fā)射波長(zhǎng)比率熒光。：雙發(fā)射波長(zhǎng)比率熒光。 Ex: 514(488), Em: 580/640 BCECF：雙激發(fā)波長(zhǎng)比率熒光。：雙激發(fā)波長(zhǎng)比率熒光。 Ex: 490/440, Em: 530 1.1Page 304/28/2021 Physiology Probes nIndo-1, Fura-2: dual emission or dual excitation calcium probe nCalcium green, Fluo-3: single wavelength calcium probe nBCECF: single or dual excitation

32、 wavelength pH probe nJC-1: potential sensitive mitochondrial dual emission nCalcein: volume changes, gap junctions, liposomes, permeability nLysosensor Blue DND-192, LysoSensor Green DND-153: lysosomal marker nNBD-C6 ceramide: Golgi marker nRhodamine-123: mitochondrial marker 1.1Page 314/28/2021 nS

33、NARF: pH indicator emission ratio nFM1-43, RH-414: plasma membrane nFura red: calcium indicator, decreased fluorescence on binding nDIC18(3), DIC16(3): ER marker nLysoTracker Yellow DND-68: lysosomal marker nMitoTracker Orange, Rhodamine B Hexyl ester, Tetramethylrosamine: mitochondrial marker 1.1Pa

34、ge 324/28/2021 Mouse; hippocampal neurons; fluorescence of GFP Shigeo Okabe Department of Anatomy and Cell Biology Tokyo Medical and Dental University 1.1Page 334/28/2021 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種 熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗

35、原（或抗體）。在細(xì)胞或熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或 組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā) 光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、 定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較常用）熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較常用） 熒光抗原

36、法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的熒光素以異硫氰酸熒光素（免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的熒光素以異硫氰酸熒光素（FITC綠色熒光）、羅丹明（綠色熒光）、羅丹明（TRITC橙紅橙紅 色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC橙紅色熒光），橙紅色熒光），Cy3（橙紅色熒光），（橙紅色熒光），Cy5 （紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。 1.1Page 344/28/2021 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)

37、體法四種。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法四種。 1、直接法：、直接法： 1）檢查抗原法：（最早的方法）檢查抗原法：（最早的方法） 用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié) 合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。 該方法很特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。該方法很特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。 2）檢查抗體法：）檢查抗體法： 將抗原標(biāo)記上熒光素，即

38、為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗 體定位檢測(cè)出來。體定位檢測(cè)出來。 1.1Page 354/28/2021 2、間接法：、間接法： 1）檢查抗體法（夾心法）檢查抗體法（夾心法） 先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗 體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。 2）檢查抗體法）檢查抗體法 用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本

39、的切片，加上待測(cè)血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待測(cè)血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體， 抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合熒光抗體）與結(jié)合 在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測(cè)人血清中的抗體必需用抗人在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測(cè)人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光熒光抗體等），在熒光 顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種 病原體抗體的重要

40、手段。病原體抗體的重要手段。 1.1Page 364/28/2021 3）檢查抗原法雙薄片）檢查抗原法雙薄片 先用特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽先用特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽 水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗 原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體抗體-熒光抗體的復(fù)合物。熒光抗體的復(fù)合物。 由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體

41、顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原 上每個(gè)分子結(jié)合上每個(gè)分子結(jié)合35個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合35個(gè)分子的熒光抗體，個(gè)分子的熒光抗體， 所以與直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)所以與直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)34倍。倍。 靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。是目前靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。是目前 使用得最廣泛的技術(shù)。缺點(diǎn)為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。使用得最廣泛的技術(shù)。缺點(diǎn)為容易出現(xiàn)非

42、特異性染色反應(yīng)。 1.1Page 374/28/2021 3、補(bǔ)體法、補(bǔ)體法 1）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法 用抗補(bǔ)體用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而 形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物 抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部 位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。 2）間接檢查組織內(nèi)抗原法）間接檢查組織內(nèi)抗

43、原法 常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗孵育后，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗 體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原 抗體抗體抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物。抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物。 此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。缺點(diǎn)為容此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。缺點(diǎn)為容 易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。 1.1Pag

44、e 384/28/2021 4、雙（多）重免疫熒光標(biāo)記法、雙（多）重免疫熒光標(biāo)記法 在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需同時(shí)檢查兩種或兩種以上抗原時(shí)，要進(jìn)行雙（多）重?zé)晒馊旧Ｔ谕患?xì)胞組織標(biāo)本上需同時(shí)檢查兩種或兩種以上抗原時(shí)，要進(jìn)行雙（多）重?zé)晒馊旧?一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗A和抗和抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上（也可分）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上（也可分 別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標(biāo)記抗體最好用波長(zhǎng)范圍別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標(biāo)記抗體最好用波長(zhǎng)范圍 分得比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。分得

45、比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。 1.1Page 394/28/2021 1.1Page 404/28/2021 研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針 細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記：免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián)與抗體耦聯(lián), 直標(biāo): 一抗+熒光探針 間標(biāo): 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗體+熒光探針) 肌動(dòng)蛋白actin ( Palloidine+熒光探針) 1染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)的熒光抗體，在室溫或37染色30min，切片 置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 2洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH

46、7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min， 再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。 3用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.09.5）甘油封固、鏡檢 1.1Page 414/28/2021 研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針 細(xì)胞膜表面受體 配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2) 標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC 1 .切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的 濕度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干 余留的液體。 2 .再

47、滴加間接熒光抗體，染色30min，37，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固， 鏡檢。 1.1Page 424/28/2021 研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針 1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫 組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明) Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白) Texa

48、s Red 595/615 (德州紅) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 1.1Page 434/28/2021 研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針 2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針 1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢 測(cè)線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時(shí)間短 JC1 線粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電位最 佳探針 Mitot