啤酒酵母的蔗糖酶的提取提純及測(cè)定

1、浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)論文 2013 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提純及測(cè)定研究論文摘要：為了了解蔗糖酶的性質(zhì)，我們用啤酒酵母做了一系列的實(shí)驗(yàn)，它們主要是以下內(nèi)容：（1），蔗糖酶的提取與初提純：a、先將酵母自溶，再兩次離心得初提液a；b、接著調(diào)ph并加熱、離心得熱提取液b；c、用乙醇沉淀離心得提取液c。（2），蔗糖酶的純化q sepharose 柱沉析法：先裝柱，再安裝鹽度梯度發(fā)生器與柱的平衡，接著加樣并洗脫，最后處理結(jié)果與交換劑的再生并得到提取液d。（3），蔗糖酶活力的測(cè)定：第一人做葡萄糖標(biāo)曲，第二人測(cè)定各提取液反應(yīng)后的od540值，得各提取液的酶活力與回收率。（4），蔗

2、糖酶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定及活力計(jì)算：遇上一個(gè)實(shí)驗(yàn)相反，第二人做標(biāo)曲，第一個(gè)人測(cè)與各提取液相對(duì)應(yīng)的od660值，再對(duì)比得到各提取液的總蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率與純化倍數(shù)。(5),微量凱氏定氮法（以b為樣品）：先將樣品b消化得消化液，洗滌定氮儀，再將消化液蒸餾，用hcl滴定餾出液，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。（6），sds-page測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量：首先制備分離膠并使之凝固，再制備濃縮膠使之在分離膠之上凝固，加處理后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)液，接著電泳，最后染色和脫色，確定樣品相對(duì)分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞：蔗糖酶；蛋白質(zhì)；提??；純化；酶活力測(cè)定；folin-酚試劑；微量凱式定氮；sds-聚丙烯胺凝膠;標(biāo)曲；電泳；

3、正文：文獻(xiàn)綜述蔗糖酶(sucrase,ec 3.2.1.26)又稱轉(zhuǎn)化酶(invertase)，可作用于21,2糖苷鍵,將蔗糖水解為d2葡萄糖和d2果糖 ，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，主要從酵母中得到。蔗糖酶的最適溫度為45-50，最適ph為4.0-4.5. 實(shí)驗(yàn)原理、試劑與器材、操作方法、結(jié)果與分析、注意事項(xiàng)、認(rèn)識(shí)與體會(huì)1 蔗糖酶的提取及初步提純1.1實(shí)驗(yàn)原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞內(nèi)酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)行提取。酶的生產(chǎn)方法有生物提取法、微生物發(fā)酵法及化學(xué)合成法，細(xì)胞破碎又有化學(xué)裂解法、低滲溶液法等，本法屬于生物提取法、菌體自溶的方法。經(jīng)破碎提取的蔗糖酶液再經(jīng)熱提取、乙醇沉淀提

4、取，使蔗糖酶得到初步的提純。1.2 試劑與器材1.2.1試劑 啤酒酵母；醋酸鈉（ar）；甲苯（ar）；4mol/l醋酸；95%乙醇（b，可能是因?yàn)閏中蔗糖酶濃度高于b或反應(yīng)時(shí)間控制不好；（2）、蔗糖酶標(biāo)曲在01.-0.7之間呈線性關(guān)系，低于01或高出0.7都要重新做過；.3.5注意做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，加完各種試劑后要充分搖勻。要求測(cè)得的od值在0.10.7測(cè)定酶活力時(shí)，要準(zhǔn)確反應(yīng)3min，這個(gè)反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該精確把握，不要多1秒也不要少1秒測(cè)得在線性范圍外的od值，需重新配液顯色反應(yīng)。由于某些原因我們這一組用的是另一組的試劑，所以數(shù)據(jù)不符合前面的實(shí)驗(yàn)；3.6認(rèn)識(shí)與體會(huì) （1）、還原糖的測(cè)定方法有菲

5、林試劑熱滴法、3,5-二硝基水楊酸法、nelson試劑法； （2）、在這種定量且精確地實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格控制一些因素，比如在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中必須嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間； 4 蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測(cè)定及比活力計(jì)算4.1實(shí)驗(yàn)原理比活力是指單位質(zhì)量（mg）蛋白質(zhì)中酶的含量（u），常用來表示酶的純度。比活力=酶的含量（u）/蛋白質(zhì)含量（mg）測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有福林-酚試劑法、微量凱式定氮法、紫外吸收法、考馬斯亮法等，本實(shí)驗(yàn)采用的是福林-酚試劑法，或稱lowry法，蛋白質(zhì)與folin-酚a試劑（堿性）在堿性條件下形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后加入folin-酚b（酸性），銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物將其還原形成深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物。

6、因?yàn)閒olin-酚b中的磷鉬酸-磷鎢酸可被蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸還原生成藍(lán)色化合物。蛋白質(zhì)濃度增高，產(chǎn)物顏色加深，這一藍(lán)色溶液在750nm和660nm有較強(qiáng)的吸光值。故可用比色法測(cè)定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的od值，然后據(jù)此測(cè)出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度5。4.2試劑與器材4.2.1 試劑試劑a（堿性銅試劑） 取na2co3（ar）10g和 naoh（ar）2g，加蒸餾水30ml，微熱溶解：另取酒石酸鈉 （na2c2h3o32h2o，ar）0.1g和cuso45h2o（ar）0.05g，再加入30ml蒸餾水微熱溶解，冷卻后將上述兩溶液混合，再用水稀釋至100ml，即為試劑a。該試劑為含10%

7、na2co3，0.1%酒石酸鈉和0.05%硫酸銅的0.5mol/l naoh溶液。保存于塑料試劑瓶中，24至少可使用1個(gè)月。溶解于500毫升蒸餾水中。；試劑b（酚試劑） 在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（na2wo42h2o）,25克鉬酸鈉（na2moo42h2o）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫 酸 鋰（li2so4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使

8、用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1mol/l左右。標(biāo)準(zhǔn)濃度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精確稱取結(jié)晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要時(shí)預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度精確稱重配成。牛血清白蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。；4.2.2器材分光光度計(jì)（使用直徑為10nm的比色皿）；刻度吸管0.5ml（1），2ml（1），5ml（1）;試管1.5 cm15cm（8）；具塞試管10 ml（3）； 恒溫水浴箱（55）；4.3 操作方法 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 表2-6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置加樣表管號(hào)012345bsa00.20.40.60.81

9、.0水4.54.34.13.93.73.5試劑a1.01.01.01.01.01.0靜置10min（立即充分混勻）試劑b0.30.30.30.30.30.3靜置10min（立即充分混勻）試劑b0.20.20.20.20.20.2混勻55水域5min,測(cè)a660od6600.0000.2370.2160.3440.4810.6230.739由于在振蕩時(shí)，管1有灑出，因此做了兩次。2.未知蛋白濃度的測(cè)定按a（1：100）、b（1：100）、c（1：20）、d（不稀釋）進(jìn)行稀釋，a稀釋液去0.4ml，b、c、d稀釋液各取5ml測(cè)定od660(所得數(shù)據(jù)如上表所示)。 【注意】folin-酚b試劑在酸性

10、條件下穩(wěn)定，而folin-酚a試劑在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。當(dāng)folin-酚b試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加一管，搖一管），使還原反應(yīng)產(chǎn)生在試劑被破壞之前。4.4結(jié)果與分析4.4.1結(jié)果表2-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)記錄表標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（ml)標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(g)od6600.2400.216/0.2370.4800.3440.61200.4810.81600.62312000.739樣品a1b1c1d1od6600.3900.2760.3470.118（小） 圖 2-3表2-8實(shí)驗(yàn)處理結(jié)果總匯表總體積/ml總酶活/u總蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%純化倍數(shù)/

11、倍初提取液a17.09613.62316.2030.401001001.00熱提取液b18.06051.64210.2428.7866.4962.950.95乙醇提取液c8.278618.4016.53521.385.2389.6517.15柱分離液d86.341100.250.373014.360.1211.4499.16 4.4.2分析（1）、此次方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，靈敏度高；缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)濃度和光密度線性關(guān)系不夠嚴(yán)格，而且不同的蛋白質(zhì)會(huì)因tyr和trp的含量不同，造成顯色程度有差異；（2）、此實(shí)驗(yàn)中由于蔗糖酶不斷提純，雖然也不斷損失，但比活力還是應(yīng)該上升的，但這次實(shí)驗(yàn)中比活力ab，是因?yàn)?/p>

12、上次實(shí)驗(yàn)我們組的酶活力沒測(cè)，這次用的是上次做的那個(gè)組的酶活力；（3）、測(cè)d的od值時(shí)是0.118，不在線性范圍內(nèi)，但由于d試劑不夠用，不重做，本來應(yīng)該將d的取樣量提高重做；4.5注意試劑a加完后，立即充分混勻，靜置10min。再向各管加b后放置10min，再加第二次。 每次加a、b后應(yīng)立即迅速充分混合。4.6認(rèn)識(shí)與體會(huì) （1）、folin-酚法之所以比雙縮尿試劑法靈敏是因?yàn)榇朔@色原理與后者相同，只是加入了第二種試劑-folin-酚b試劑，以此增加顯色量，從而提高了靈敏度； （2）、做實(shí)驗(yàn)時(shí)要謹(jǐn)慎仔細(xì)，盡量避免不必要誤差，在本實(shí)驗(yàn)中，我在振蕩試管時(shí)有時(shí)會(huì)將溶液振出，雖然量不多，但由于此法靈敏度

13、高也會(huì)造成相當(dāng)?shù)恼`差，在振蕩方面仍需練習(xí)；5微量凱氏測(cè)總蛋白5.1實(shí)驗(yàn)原理 凱氏定氮法由kieldahl于1833年首創(chuàng)，是一種元素分析方法。根據(jù)取樣量分類，可以分為常量和微量。 而不同蛋白質(zhì)中含氮量平均16%，凱式定氮儀測(cè)定含氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，得到蛋白質(zhì)含量。n / 16% = n 6.25 = 蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)共需消化、蒸餾、滴定3個(gè)步驟，其中消化是為了將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮 ，然后在堿性條件下蒸餾，讓無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成氨氣出來，用硼酸試劑吸收，最后用鹽酸滴定。滴定指示劑在堿性條件下是綠色，當(dāng)溶液由綠色-灰色-紅色時(shí)可認(rèn)為是滴定完全。 nh2ch2cooh + h2so4 2 c

14、o2 + 3 so2 + h2o + nh3 2 nh3 + h2 so4 （nh4）2 so4 （nh4）2 so4 + na oh na 2 so4 + 2 h2o + 2 nh3 2 nh3 + 4 h3bo3 （nh4）2b4o7 + 5h2o （nh4）2b4 o7 + 2 hcl + 5h2o 2nh4cl + 4h3bo35.2試劑與儀器2.5.2.1試劑 蛋白樣品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%nacl溶液并稀釋至100ml；濃硫酸；硫酸鉀3份與硫酸銅1份（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）混合研磨成粉末；30%naoh溶液:30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml； 2%硼酸溶液：2 g溶于蒸餾水，

15、稀釋至100ml； 混合指示劑：01甲基紅酒精溶液和 01甲基藍(lán)酒精溶液臨時(shí)按2:1的比例混合?；?1甲基紅酒精溶液和 01溴甲酚綠酒精溶液臨時(shí)按1:5的比例混合5.2.2器材 改良式凱氏定氮儀；克氏燒瓶50ml（2）;移液管；錐形瓶50ml（3）；吸球、玻棒、滴管、量筒；5.3操作方法 1消化凱氏瓶?jī)?nèi)加入a 0.1ml、b 0.2ml、c 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化劑，消化至淡綠色，定容至50ml。2.洗滌定氮儀實(shí)際操作時(shí)，觀察到隨著錐形瓶?jī)?nèi)水量增多，指示劑變棕紅色。第三次洗滌后，指示劑不變色。3蒸餾實(shí)際操作時(shí)，在加反應(yīng)液后，反應(yīng)室內(nèi)液體變成棕黑色，液體反應(yīng)劇烈。指示劑有紅色變成棕色

16、，最后變成綠色。4滴定用0.01n hcl將錐形瓶中的指示劑滴定至淡紫色，記錄消耗hcl的量。5.4結(jié)果與分析5.4.1結(jié)果 表2-9次數(shù)12hcl消耗量/ml0.850.82hcl消耗量（同組）/ml0.750.77樣品含氮量=(a-b) n=11mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=1251mg5.4.2分析（1）、上次用folin-酚法測(cè)得的提取液b的蛋白質(zhì)是210.42mg，而此次測(cè)得為1251mg，影響原因可能有：a、folin-酚法以tyr和trp為中心測(cè)，實(shí)際蛋白質(zhì)有其他氨基酸且不一定符合比列；b、凱氏定氮法中不能否定其含有其他含氮物質(zhì)；c、收集氨氣過程中帶入了水蒸氣對(duì)硼酸ph影響較大；d

17、、蒸汽洗滌時(shí)間不夠長(zhǎng)也可以大致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大；e、最后滴定過程中，滴定操作的標(biāo)準(zhǔn)與否也對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大； （2）、本次試驗(yàn)與上次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果由較大的出入，其影響結(jié)果的主要因素有：1.收集氨氣過程中帶入了水蒸氣對(duì)硼酸ph影響較大；2.蒸汽洗滌時(shí)間不夠長(zhǎng)也可以大致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大；3.最后滴定過程中，滴定操作的標(biāo)準(zhǔn)與否也對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大； 5.4.3結(jié)論 樣品含氮量=11mg/ml 樣品含蛋白質(zhì)量=1251mg5.5注意 （1）、消化時(shí)，樣品勿粘于燒瓶壁上； （2）、定氮儀的橡皮管、塞都需處理； （3）、蒸餾時(shí)火不能太猛；5.6認(rèn)識(shí)與體會(huì)：1、常量凱氏定氮法測(cè)總蛋白氮時(shí)可用強(qiáng)酸，微量凱氏定氮法

18、測(cè)總蛋白氮必須用弱酸。2、folin-酚法與凱氏定氮法比較： （1）、folin-酚法：操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，但操作需嚴(yán)格計(jì)時(shí)、干擾多； （2）、凱氏定氮法：費(fèi)時(shí)間，靈敏度比前者低，但干擾少，用于蛋白質(zhì)的測(cè)定準(zhǔn)確6 sas-page測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量6.1實(shí)驗(yàn)原理電泳是指溶液中帶點(diǎn)粒子在外加電場(chǎng)的作用下，向相反電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它在某ph下所帶的凈電荷量、分子大?。捶肿恿浚┖托螤畹牟町愋?。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（bis）在催化劑過硫酸銨（ap）和加速劑n,n,n,n-四甲基乙二胺（temed）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀

19、結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠孔徑大小可通過改變acr和bis濃度來調(diào)節(jié)。濃度越大，孔徑越小，顆粒穿過網(wǎng)孔的阻力越大，反之亦然。網(wǎng)孔大小根據(jù)所分離物的分子量的大小來選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇分離膠濃度12%。聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)的和不連續(xù)的凝膠電泳兩類。不連續(xù)凝膠電泳有三大效應(yīng)：（1）濃縮效應(yīng)：兩層凝膠的孔徑不同（孔徑的不連續(xù)性）； 緩沖液與凝膠離子成分和ph不同（緩沖系統(tǒng)的不連續(xù)性）（2）分子篩效應(yīng)：顆粒小，圓球形的樣品分子，移動(dòng)較快；顆粒大，形狀不規(guī)則的分子阻力較大，移動(dòng)較慢。（3）電荷效應(yīng)：大部分蛋白質(zhì)在ph8.3帶負(fù)電，電荷多遷移快sds即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子表面活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)分子之間

20、的非共價(jià)鍵，形成帶大量負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-sds復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然電荷的差異；引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變。6.2試劑與器材6.2.1試劑 30%丙烯酰胺貯液: 稱丙烯酰胺（ar）29.2g、甲叉雙丙烯酰胺0.8g，先用80ml雙蒸餾水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸餾水稀釋至100ml，過濾。用棕色瓶中，4保存一個(gè)月。10%的temed；10%過硫酸銨（ap）：現(xiàn)用現(xiàn)配。；分離膠緩沖液貯液（1.5mol/l tris-hcl，ph8.8）：取tris 9.08g溶解在40ml雙蒸水中，用 4mol/l鹽酸調(diào)節(jié)至ph8.8，用雙蒸水定容至

21、50ml， 4保存；濃縮膠緩沖液貯液（1.5mol/l tris-hcl，ph6.8）：取tris 6.06g溶解在40ml雙蒸水中，用 4mol/l鹽酸調(diào)節(jié)至ph6.8，用雙蒸水定容至50ml，4保存；2sds-樣品緩沖液：1ml濃縮膠緩沖液貯液（1mol/l tris-hcl，ph6.8）+4ml10%sds+1ml巰基乙醇+2ml甘油0.5ml0.1%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)，加雙蒸水定容至10ml，4保存。sds-電極緩沖液貯存液（0.025mol/l tris，0.25mol/l甘氨酸，0.1%sds，ph8.3）: 取tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml雙蒸水中，加入50m

22、l 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))sds貯存液，加雙蒸水定容至1000ml則成5sds-電極緩沖液。 10%sds：25gsds用雙蒸水定容至250ml，室溫保存。 染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)g-250，加入90ml 50%甲醇溶液和10ml 冰乙酸，用濾紙過濾。6.2.2器材 垂直板型電泳槽；玻璃板; 大培養(yǎng)皿；燒杯；吸量管；滴管6.3 操作方法 1分離酸制備 裝配制膠工具，按表比例配制分離膠，小心加滿水，待聚合好后，傾去水，用濾紙片吸干膠面。 2.濃縮膠制備 按表配置濃縮膠，迅速混勻，倒在分離膠上層，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用濾紙片去除齒孔中的氣泡。 3.加樣 取100l樣品與100l樣品緩

23、沖液混合，沸水浴3-5min，取20l各樣品加入齒孔中，加一孔marker，將電極緩沖液倒入電泳槽。4.電泳 調(diào)節(jié)電流，電泳至溴酚藍(lán)距酸前沿1.5cm左右，停止電泳。5.染色和脫色小心取出凝膠，置于平皿中，加染色液中過夜，用脫色液脫色，換兩次脫色液，至背景透明。6計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量。6.4結(jié)果與分析6.4.1 結(jié)果 表2-10蛋白質(zhì)分子遷移距離/cm染料遷移距離/cm相對(duì)遷移率標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)2.944.40.668 144004.1583624921.30 0.295310004.4913616941.19 0.270430004.6334684560.720.16466

24、2004.8208579890.480.109 970004.988558957 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子遷移數(shù)據(jù)表 圖2-4電泳標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 由電泳遷移率圖得到蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量：組別分子量的對(duì)數(shù)蛋白質(zhì)分子遷移距離相對(duì)遷移率蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量a4.8967147730.450.10227272778834.22 4.7792313640.820.18636363660149.41 4.72207727310.22727272752732.37 4.6585727271.20.27272727345558.85 4.5474397731.550.35227272735272.79 4.4585334091.830.41590909128743.09 4.2807206822.390.54318181819086.25 b4.9443431820.30.06818181887971.74 4.7379534090.950.21590909154695.73 4.7062011361.050.23863636450839.48 4.5601406821.510.343181818